本发明属于兽药残留分析和免疫学
技术领域：
，具体涉及一种能识别金刚烷胺(AMA)和金刚乙胺(RMA)的单克隆抗体以及酶联免疫方法(ELISA)与试剂盒。
背景技术：
：金刚烷胺类是对流感病毒最有效的人医用抗病毒药，但也在畜牧养殖业中被大范围使用，主要以盐酸金刚烷胺和盐酸金刚乙胺来治疗和预防鸡、猪等经济动物的流感及其它临床常见病毒病。金刚烷胺类除本身会影响蛋鸡增重，有神经毒性、胃肠道反应等副作用外，耐药性问题也越来越严重，耐药病毒具有更强大的致病性、传播性及在不同药物间的交叉耐性。为避免金刚烷胺不规范使用造成流感病毒的耐药性上升及变异株的产生，避免影响人类病毒病的预防与治疗，FDA和中国农业部都于2005年明文禁止将金刚烷胺类药物应用于可食性动物病毒病的治疗及相关的生产与销售等。检测金刚烷胺类的方法主要为仪器方法和生物分析法。目前仪器方法已经很成熟，灵敏度、精密度高并且可进行多残留检测的定性、定量研究，但是仪器昂贵、前处理繁琐并且需要专业人员操作，更适用于科研机构和国家权威部门对药物的确认检测而不适用于样品的大量筛选。生物分析法是通过分子生物学方法建立了金刚烷胺受体蛋白表达系统，以评价受体蛋白的亲和活性，这种方法灵敏度不高，在技术上也不够成熟。免疫化学分析法特别是酶联免疫分析方法具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合高通量样品筛选，因此对于快速检测金刚烷胺类的残留，ELISA方法更具优势。目前没有同时检测金刚烷胺和金刚乙胺的ELISA方法的报道。技术实现要素：本发明的主要目的有以下几个：(1)提供一种特异性识别金刚烷胺和金刚乙胺的单克隆抗体；(2)提供检测金刚烷胺和金刚乙胺药物残留的酶联免疫试剂盒；(3)提供金刚烷胺和金刚乙胺非诊断目的药物残留酶联免疫检测方法。上述目的是通过以下技术方案实现的：一种单克隆抗体，能识别金刚烷胺和金刚乙胺，它是杂交瘤细胞株2G3所分泌的。所述的杂交瘤细胞株2G3，保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCCNO:C201625。所述的单克隆抗体是以金刚乙胺半琥珀酸酯作半抗原，并将其与载体蛋白通过EDC方法偶联后作为免疫原制备得到的。所述的单克隆抗体可用于制备检测金刚烷胺和金刚乙胺的酶联免疫试剂盒。一种金刚烷胺和金刚乙胺非诊断目的药物残留酶联免疫检测方法，包括以下步骤：(1)将金刚乙胺半琥珀酸酯与载体蛋白偶联得到免疫原；(2)将金刚乙胺与载体蛋白偶联得到包被原；(3)用步骤(1)得到的免疫原免疫动物并得到保藏号为CCTCCNO:C201625的杂交瘤细胞株2G3；(4)用保藏号为CCTCCNO:C201625的杂交瘤细胞株2G3制备单克隆抗体；(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；(6)可食性动物组织样品的处理和检测。优选地，所述可食性动物组织样品的处理包括以下步骤：1)准确称取可食性动物组织样品2±0.05g于50mL离心管中，加8mL含1％三氯乙酸的乙酸乙酯和1g无水MgSO4，震荡5min，室温条件下离心；2)取上清2mL氮气吹干，用正己烷1mL复溶，用含2％KH2PO4和2％Na2HPO4的缓冲溶液调节pH至6.5-7，涡旋30s，静置5min后室温条件下离心，取下层水相。本发明的有益效果是：(1)本发明在制备单克隆抗体时，以金刚乙胺半琥珀酸酯作为半抗原，将半抗原与载体蛋白偶联作为免疫原，由该免疫原制备的单克隆抗体能特异性同时识别金刚烷胺和金刚乙胺；(2)本发明的酶联免疫试剂盒和方法适用于检测可食性动物组织中金刚烷胺和金刚乙胺残留，检测的灵敏度、准确度高，精密度好，IC50值为15.83μg/L和22.40μg/L，本发明的ELISA方法灵敏度、准确度高，精密度好；(3)本发明所涉及的检测方法简单，易操作，检测成本低，对操作者要求低，身体健康危害相对较小。具体实施方式下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。实施例1免疫原和包被原的制备1.1免疫原RMA-HS-EDC-KLH的制备在圆底烧瓶中称取金刚乙胺(RMA)1g，丁二酸酐(HS)2g，将其溶解在8ml吡啶中，90℃油浴、磁力搅拌条件下，回流反应2d。反应完成后，将溶剂吡啶旋蒸掉，用甲醇复溶后再旋蒸掉，重复两次。将产物用氢氧化钠溶液溶解，调PH到碱性(PH＝9-10)。乙酸乙酯洗碱液，弃有机相，重复三次。后将得到的水相用盐酸调PH到中性(PH＝6-7)，再用乙酸乙酯洗三次，弃有机相烘干后得到黄褐色产物，即为半抗原金刚乙胺半琥珀酸酯(RMA-HS)。称取半抗原(RMA-HS)18mg、水溶性碳二亚胺(EDC)15mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)8mg，用300μlDMF将其溶解，室温避光条件下磁石搅拌2h，记该反应液为A液。将2ml血蓝蛋白(KLH)用6ml0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)稀释后记为B液。在冰浴、磁石搅拌下将A液逐滴加入到B液中，反应过夜。反应完成后，将产物液转入透析袋中，4℃PBS中透析3d，每4～6h更换一次透析液，透析完后5000转/分钟离心10min后取上清液，将其冷冻干燥后即得偶联物RMA–HS–EDC–KLH，置-20℃保存。1.2包被原RMA-EDC-BSA的制备在青霉素小瓶中称取35mg牛血清白蛋白(BSA)、120mgEDC、65mgNHS，用6mlPBS将其溶解，并用CBS将溶液调到弱碱性(pH＝8-9)，避光、室温条件下磁石搅拌30min，反应液记为A液。称取12mgRMA，用1mlPBS将其完全溶解后记为B液。在冰浴条件下将B液加入到已反应30min的A液中，反应过夜。反应完成后，将产物液转入透析袋中，4℃PBS中透析3d，每4～6h更换一次透析液，透析完后5000转/分钟(rmp)离心10min后取上清液，将其冷冻干燥后即得偶联物RMA-EDC-BSA。实施例2单克隆抗体的制备2.1动物免疫利用发明人所在的国家兽药残留基准实验室制备的免疫原(RMA-HS-EDC-KLH)免疫Balb/C小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心)。免疫程序是取免疫原RMA-HS-EDC-KLH以蛋白溶液分别为100μg和50μg与佐剂等量混合后注入小鼠体内，使其产生特异性血清。2.2细胞融合和克隆化参照杨汉春《动物免疫学》，利用发明人所在国家兽药残留基准实验室制备的RMA-HS-EDC-KLH免疫原免疫Balb/C小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心)，免疫程序为：基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射，以后每间隔2周加强免疫一次，换用不完全佐剂乳化。最后于融合前三天(最好于免疫结束后休整1月)腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞来自本实验室)按1～2×107个和108个免疫脾细胞，其比例在1:10-1:15之间，将其都置于50mL离心管中，用15mL的RPMI-1640基础液重悬细胞，1500r/min离心5min，洗细胞1次。离心的间隙将温浴的培养基，温浴的水，温浴的50％聚乙二醇(PEG)等放入超净台。然后取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴，轻敲管底使细胞松动。打开计时器，吸取0.8mL的PEG，手持装有混合细胞的离心管，将其放置在水浴中片刻，将PEG缓慢的滴加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，1min内加完，持续搅拌10s。然后加入10mL基础培养液，沿管壁缓慢加到融合细胞上，边加边轻轻摇动(不能吹打)，在3min内加完5mL，在5min内加完10mL，最后补加基础培养液到40mL，加盖后，反复颠倒几次，使细胞混匀。900r/min5min离心，弃上清。吸取含有饲养细胞的HAT培养基5mL，缓慢加入，并轻轻搅动，忌吹打；然后将该细胞缓慢滴入到含饲养细胞的血清瓶中，混合均匀后将细胞接种在细胞培养板上，每孔两滴，置于培养箱中培养。一次融合可接种5～7块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含104左右个SP2/0细胞。于37℃，5％CO2培养箱中培养。融合的当天计为0d，前3d尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3d每孔补加1滴HAT完全培养基；第5d每孔吸出l/2培养上清(100μL)，再加入1滴HT完全培养基；以后每隔2d同上吸去l/2-3/4培养上清，在7d后换入HT完全培养基。待融合细胞集落长至培养孔的1/4左右，用建立的间接ELISA方法进行筛选。与零药物孔相比，药物孔OD值能被抑制的判为阳性。根据抑制率和细胞集落生长状况，选择2～6个强阳性的仅有1-2个单集落的细胞孔，采用有限稀释方法进行克隆化。经过3～4次克隆，最终筛选出分泌抗金刚烷胺的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，申请人将其命名为杂交瘤细胞株2G3，于2016年1月25日将其送于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO:C201625。对该细胞系进行了染色体计数，结果显示，杂交瘤细胞的染色体数目平均值为102.1条，满足SP2/0的染色体数为62～68条，脾细胞染色体为40条，说明融合细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。将该细胞株经腹腔注射Balb/C小鼠，生产单克隆抗体。采用购自ThermoSxientific公司的鼠单克隆抗体(Monoclonalantibody,Mab)快速ELISA同型试剂盒对本发明所得到的单克隆抗体的亚型和轻链进行鉴定，结果为小鼠IgG1亚型。实施例3间接竞争ELISA检测方法的建立3.1试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配制)磷酸盐缓冲液：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O2.9g，KCl0.2g，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4；包被液：取Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加三蒸水至1000mL，调节pH值至9.6；洗涤液：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O2.9g，KCl0.2g，Tween200.5mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4；封闭液：脱脂奶粉1.5g溶于100mL磷酸盐缓冲液中；底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；底物液B：Na2HPO414.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢脲6.4mL，加双蒸水至1000mL；底物混合液：将A液和B液按体积比1:1混合即得，现配现用；终止液：2mol/L硫酸溶液。3.2包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定选择上述合成的RMA-EDC-BSA作为包被原，用包被液稀释成12μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL8个浓度，在96孔酶标板，从第一至第八行依次加入，4℃过夜；洗涤3次，拍干，加入封闭液250μL，37℃封闭60min；洗涤3次，拍干，在酶标板的第一列至第八列依次加入50μLPBS，后再加入用磷酸盐缓冲液稀释的稀释倍数为2000、4000、8000、16000、32000、64000、128000、256000的单克隆抗体，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干；各孔加入1:5000倍磷酸盐缓冲液稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(简称二抗，以下所指二抗均为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，购自武汉飞远科技有限公司)100μL，37℃孵育30min，洗涤5次，拍干；各孔加入100μL底物混合液，避光显色15min，加入50μL终止液，用自动酶标仪在450nm波长处测定光密度值(OD值)，结果见表1。结果表明，初步确定包被原RMA-EDC-BSA的包被浓度为2mg/L或1mg/L，抗体工作浓度为1:64000或1:32000。表1包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定3.3最佳包被原浓度和抗体工作浓度的确定以方阵滴定初步确定的包被原RMA-EDC-BSA的包被浓度，即2μg/mL、1μg/mL2个浓度包被酶标板。将AMA标准溶液用磷酸盐缓冲液稀释成0、5、10、20、40、80μg/L的6个浓度，将单克隆抗体用磷酸盐缓冲液分别稀释为1:64000和1:32000，向加入50μLPBS的零孔和50μLAMA标准溶液的药物孔中各加50μL单克隆抗体进行间接竞争ELISA测定。以AMA标准溶液浓度的对数值作横坐标，以药物孔的OD值与“零”孔OD值的比值(B/B0)作为纵坐标绘制抑制曲线，选择线性较佳、产生50％抑制时AMA浓度(IC50)较低者作为包被浓度。以最佳包被原浓度包被酶标板，将AMA标准溶液稀释成0、5、10、20、40、80μg/L6个浓度，将抗体以选择浓度1:32000等差设置稀释度，分别加入到零孔和系列浓度的AMA标准溶液的药物孔中进行间接竞争ELISA，绘制抑制曲线，选择线性较佳、IC50值较低者作为最佳抗体工作浓度。结果见表2、3。表2最佳包被原浓度优化包被原浓度抗体稀释倍数0孔ODIC50值2640001.88722.151320002.14719.53表3最佳抗体稀释度优化抗体稀释倍数0孔ODIC50(μg/L)340002.15920.35360002.03718.23380001.99616.77400001.81519.24结果表明，包被浓度为1μg/mL，抗体稀释度为1:38000时，其IC50最低。3.4标准曲线的建立将AMA标准溶液用磷酸盐缓冲液配制成0、5、10、20、40、80μg/L的6个浓度，每个浓度重复5孔，按照间接竞争ELISA方法测定，重复测定5次。以AMA溶液浓度的对数值为横坐标，B/B0为纵坐标绘制标准曲线，求出IC50。本试剂盒的IC50值为15.83μg/L。3.5交叉反应试验将金刚乙胺用磷酸盐缓冲液配制成适当浓度，用建立的ELISA方法测定各药物的IC50值，每个药物3个复孔，以单克隆抗体对金刚烷胺的交叉反应率为100％，利用公式1计算单克隆抗体对金刚乙胺的交叉反应率，结果见表4。表4本发明对金刚乙胺的交叉反应率化合物名称IC50交叉反应率(％)回归方程相关系数R2金刚烷胺15.83100y＝-0.504x+0.9953金刚乙胺22.4070.67y＝-0.5408x+1.23020.9974利巴韦林＞1000＜1--阿昔洛韦＞1000＜1--吗啉胍＞1000＜1--以上结果表明，单克隆抗体对金刚烷胺和金刚乙胺有交叉反应，能同时检测这两种药物。实施例4ELISA试剂盒的组装4.1本发明ELISA试剂盒由下述部分组成：1)包被有包被原RMA-EDC-BSA的固相载体(酶标板)；2)AMA标准溶液6瓶，浓度分别为0、5、10、20、40、80μg/L；3)杂交瘤细胞2G3分泌的单克隆抗体；4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl80.0g，KH2PO42.0g，Na2HPO4.12H2O29.0g，KCl2.0g，加双蒸水至1000mL；6)浓缩洗涤液：NaCl80.0g，KH2PO42.0g，Na2HPO4.12H2O29.0g，KCl2.0g，Tween205mL，加双蒸水至1000mL；7)底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；8)底物液B：Na2HPO414.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至5.0～5.4；9)终止液：2mol/L硫酸溶液。4.2酶标板的制备用包被液将RMA-EDC-BSA稀释成1μg/mL，每孔加入100μL，4℃过夜，倾去包被液，每孔加入250μL洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入封闭液250μL，37℃孵育120min，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。实施例5酶联免疫试剂盒的测定程序5.1试剂的配制1)样品稀释液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用三蒸水稀释10倍后使用。2)洗涤液：将试剂盒中提供的洗涤液用三蒸水稀释10倍后使用。3)底物混合液：根据每次所需用量，将配制的底物液A和底物液B按体积1:1混匀，现配现用。5.2样品前处理鸡肉、鸡肝的前处理：1)准确称取可食性鸡组织样品2±0.05g于50mL离心管中，加8mL含1％(重量比)三氯乙酸的乙酸乙酯和1g无水MgSO4，震荡5min，室温5000r/min离心5min；2)取上清2mL氮气吹干，用正己烷1mL复溶，用含2％(重量比)KH2PO4和2％(重量比)Na2HPO4的缓冲溶液调节pH至6.5-7，涡旋30s，静置5min后室温条件下离心，取下层水相供试剂盒测定。5.3测定步骤1)加样：向酶标板微孔中加入金刚烷胺系列浓度标准溶液或样品溶液50μL，然后加入单克隆抗体工作液50μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL洗涤3次并拍干；3)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液：每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；4)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL，洗涤3次并拍干；5)加底物：每孔中加入底物混合液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育15min；6)加终止液：每孔中加入终止液50μL；7)测定：用酶标仪在450nm处测定每孔的光密度值(OD值)。5.4结果判断标准曲线：以所测定的标准品OD值除以“零”孔OD值(B/B0)为纵坐标，AMA浓度的对数值为横坐标作标准曲线，并进行线性回归，给出回归方程。可食性鸡组织中金刚烷胺(AMA)的浓度计算：计算样品的抑制率(所获得的样品的OD值除以“零”孔OD值)，代入标准。可食性鸡组织中金刚乙胺(RMA)的浓度计算：计算样品的抑制率(所获得的样品的OD值除以“零”孔OD值)，代入标准曲线的回归方程中，按照公式2折算成金刚乙胺药物浓度。实施例6ELISA方法的灵敏度、精密度、准确度试验6.1本发明试剂盒的灵敏度试验以标准曲线的IC50值作为本发明ELISA方法的灵敏度指标。将AMA标准品稀释成为0、5、10、20、40、80μg/L6个浓度，每个浓度5个复孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，并求测定的IC50值。标准曲线的回归方程为y＝-0.504x+1.1046，R2＝0.9953，IC50值为15.83±0.44μg/L(n＝5)，线性范围为5-80μg/L。LOD通过以下步骤决定：测定20份空白组织样品的OD值，根据标准曲线的回归方程计算出相应的金刚烷胺浓度，然后计算出金刚烷胺浓度的平均值和标准差(SD)，根据公式计算出组织中的最低检测限。金刚烷胺和金刚乙胺在可食性鸡组织中的最低检测线详见表5。表5可食性组织中金刚烷胺和金刚乙胺的检测限6.2本发明试剂盒的精密度试验将AMA标准品稀释成0、5、10、20、40、80μg/L6个浓度，每浓度5个重复，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，应用标准曲线的回归方程计算出各浓度AMA标准溶液的测定值，计算板内和板间变异系数，结果见表6。表6标准曲线的板内与板间变异系数6.3本发明试剂盒的准确度、重复性试验分别将三个浓度金刚烷胺添加到可食性鸡组织中，其添加回收率在76％～117％之间，批内与批间变异系数≤15％；具体测定结果见表7、8。公式2：表7鸡肉中添加回收率表8鸡肝中添加回收率当前第1页1 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