本发明涉及组织培养
技术领域：
，特别涉及一种革叶卫矛组织培养的培养基及其方法。
背景技术：
：革叶卫矛(EuonymuslecleriLévl.)灌木或小乔木，高1-7米。革叶卫矛属于卫矛科卫矛属植物，是中国的特有植物。分布于湖北、湖南、四川、贵州等地，生长于海拔1,300米至2,900米的地区，多生长于山地林荫和沟边。卫矛属植物在园林应用中应用较为普遍，多用于孤植、丛植及群植，是优良的园林观赏植物和绿化树种。革叶卫矛作为一种常绿树种，耐荫耐寒，抗逆性强，在北方地区具有很高的观赏和应用价值。随着“南树北引”的逐渐成熟，革叶卫矛逐渐被广泛应用于园林景观规划中。革叶卫矛常用的繁殖方法包括种子繁殖、扦插繁殖，但这两种繁殖方法受季节限制，繁殖系数低。传统的繁殖方式难以满足市场庞大的需求。而组织培养技术作为一种快速繁殖方式，可实现工厂化育苗，从而满足市场日益增长的需求量。组织培养技术是在无菌的条件下将活器官、组织或细胞置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续培养而成的细胞、组织或个体。这种技术已广泛应用于农业和生物、医药的研究。近年来，组织培养技术逐渐应用到园林树种的繁殖方面，并开始代替传统的叶插、分株等繁殖方法。但针对革叶卫矛的组织培养技术还未有报道，目前只有关于双歧卫矛和火焰卫矛的组织培养技术的报道。周魏于2008年报道了《双歧卫矛组织培养体系的建立》的学位论文，其中公开了初代培养基、增殖培养基和生根培养基，以MS+BA2mg/L+IBA0.1mg/L+NAA0.05mg/L为初代培养基，以MS+6-BA2mg/L+IBA0.1mg/L+NAA0.1mg/L为增殖培养基，以1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA1mg/L+AC0.1％为生根培养基。祖庆学于2009年报道了《火焰卫矛组织培养再生体系优化及遗传转化研究》的学位论文，其中也公开了初代培养基、增殖培养基和生根培养基，以WPM+6-BA6mg/L+IBA0.2mg/L为初代培养基，以WPM+6-BA4mg/L为增殖培养基，以1/2MS+NAA0.2mg/L+AC0.5g/L为生根培养基。但采用上述培养基进行革叶卫矛的组织培养，其初代培养的成活率、移栽成活率均较低。因此，需要研发一种初代培养的成活率及移栽成活率均较高的革叶卫矛的组织培养方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种革叶卫矛组织培养的培养基及其方法。该培养基配方可显著提高初代培养的成活率及移栽成活率。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种革叶卫矛组织培养的培养基，包括初代培养基、增殖培养基和生根培养基；初代培养基为：含有0.5～2.0mg/L6-BA、0.1～0.5mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.86～5.90；增殖培养基为：含有0.2～1.0mg/LKT、0.01～0.03mg/LTDZ、20mg/LVc、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.86～5.90；生根培养基为：含有0.4～0.5mg/LIBA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.86～5.90。本发明的革叶卫矛的组培培养基配方可显著提高初代培养的成活率及移栽成活率，启动培养成活率从过去的不足30％提高到了85％，种苗移栽成活率从过去的50％提高到了现在的90％以上，对于实现革叶卫矛工厂化育苗提供了理论依据和技术支持，从而打破了传统繁殖方式瓶颈的限制。优选地，革叶卫矛组织培养的培养基中，初代培养基为：含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.86；增殖培养基为：含有0.5mg/LKT、0.03mg/LTDZ、20mg/LVc、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.86；生根培养基为：含有0.4mg/LIBA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.86。本发明还提供了一种革叶卫矛的组织培养方法，包括如下步骤：将革叶卫矛外植体接种到初代培养基进行启动培养，得到革叶卫矛幼苗；将革叶卫矛幼苗转接到增殖培养基进行继代培养，得到继代苗；将继代苗转接到生根培养基进行生根培养，得到组培苗；初代培养基为：含有0.5～2.0mg/L6-BA、0.1～0.5mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.86～5.90；增殖培养基为：含有0.2～1.0mg/LKT、0.01～0.03mg/LTDZ、20mg/LVc、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.86～5.90；生根培养基为：含有0.4～0.5mg/LIBA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.86～5.90。本发明首次针对革叶卫矛的组培快繁技术进行了研究，研发出了一整套革叶卫矛的组培快繁体系，包括取材、培养基配方、炼苗技术等，经过炼苗培育的革叶卫矛的性状稳定，生长周期短，不受季节条件的限制，能完整的继承木本的优良性状，且启动培养成活率从过去的不足30％提高到了85％，种苗移栽成活率从过去的50％提高到了现在的90％以上，对于实现革叶卫矛工厂化育苗提供了理论依据和技术支持，从而打破了传统繁殖方式瓶颈的限制。优选地，革叶卫矛组织培养的培养基中，初代培养基为：含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.86；增殖培养基为：含有0.5mg/LKT、0.03mg/LTDZ、20mg/LVc、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.86；生根培养基为：含有0.4mg/LIBA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.86。作为优选，启动培养的时间为30～45天，继代培养的时间为30～60天，生根培养的时间为30～40天。作为优选，革叶卫矛外植体为带腋芽的茎段。作为优选，组织培养的光照强度为2000～2500lx，光照时间为12～18h/d，温度为25～28℃，相对湿度为45％～50％。在本发明提供的实施例中，组织培养的光照强度为3500lx，光照时间为12h/d，温度为26℃，相对湿度为45％～50％。作为优选，将革叶卫矛外植体接种到初代培养基进行启动培养之前还包括革叶卫矛外植体的消毒处理，消毒处理具体为：将外植体用NaClO溶液浸泡，用酒精消毒，然后用氯化汞溶液进行消毒处理。作为优选，NaClO溶液的质量百分浓度30％，浸泡时间为15～25min。在本发明提供的实施例中，NaClO溶液浸泡时间为15min。作为优选，酒精的体积百分浓度为75％，酒精消毒的时间为30s。作为优选，氯化汞溶液的质量百分浓度为0.1％，氯化汞溶液的消毒时间为8min。在本发明提供的实施例中，外植体的消毒处理为：带腋芽的茎段首先用30％的次氯酸钠浸泡15～25min，轻轻刷洗茎段及其腋芽和茎段连接处；在超净工作台上操作步骤如下：75％酒精30s→无菌水2次2min→0.1％升汞8min→无菌水2次2min→换杯(预先灭菌)→0.1％升汞8min→无菌水2次2min→换杯→0.1％升汞8min→无菌水2min→换杯→无菌水3min→换杯→无菌水3min→控干水分备用。本发明中，外植体的采集为：选取播种繁殖得到的2～3年生苗，采集当年生健壮且无病虫害的带腋芽的茎段，作为组织培养的外植体，用加有洗涤剂的清水浸泡清洗，去除外植体上残留的虫卵、污渍等，转入烧杯中，用洁净纱布罩住杯口，在流水下冲洗50～60min。作为优选，得到组培苗之后还包括炼苗的步骤。在本发明提供的实施例中，炼苗为：选取生长健壮的瓶苗，开瓶炼苗2d，将苗取出，用稀释1000倍的多菌灵溶液清洗2～3次，用流水冲净植株上附着培养基；将苗移栽到培养土中，培养土采用蛭石：泥炭＝1：1的比例进行配制；栽好后喷洒多菌灵溶液，然后覆薄膜，放置于炼苗大棚内培育2～3个月；待新叶、新根长出后放置向阳处培养，保持湿度，白天覆膜，夜晚揭膜，温度保持在15～25℃，逐步加强通风；待幼苗长势健壮，进行露天栽植。本发明提供了一种革叶卫矛组织培养的培养基及其方法。该革叶卫矛组织培养的培养基包括初代培养基、增殖培养基和生根培养基；初代培养基为：含有0.5～2.0mg/L6-BA、0.1～0.5mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.86～5.90；增殖培养基为：含有0.2～1.0mg/LKT、0.01～0.03mg/LTDZ、20mg/LVc、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.86～5.90；生根培养基为：含有0.4～0.5mg/LIBA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.86～5.90。本发明至少具有如下优势之一：本发明培养基配方可显著提高革叶卫矛初代培养的成活率及移栽成活率，启动培养成活率从过去的不足30％提高到了85％，种苗移栽成活率从过去的50％提高到了现在的90％以上，其技术效果好于现有报道的卫矛培养基；本发明利用了植物组织培养方法，解决革叶卫矛传统繁殖方式周期长、繁殖率低的问题，形成一个革叶卫矛组培快繁培养体系，使其能够实现工厂化育苗。具体实施方式本发明公开了一种革叶卫矛组织培养的培养基及其方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。所述的6-BA为6-苄基嘌呤，所述NAA为萘乙酸，所述KT为激动素，所述TDZ为植物生长调节剂噻苯隆。本发明提供的革叶卫矛组织培养的培养基及其方法中所用培养基组分均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1培养基配方的配制(1)母液配制母液一：NH4NO316.5g/L，KNO319g/L，KH2PO417g/L，MgSO4·7H2O3.7g/L；母液二：CaCl20.6644g/L；母液三：KI0.083g/L，MnSO4·H2O1.69g/L，ZnSO4·7H2O0.86g/L，H3BO30.62g/L，Na2MoO4·2H2O0.025g/L，CuSO4·5H2O2.5g/L，CoCl2·6H2O2.5g/L；母液四：FeSO4·7H2O2.78g/L，Na2·EDTA3.73g/L；母液五：肌醇2g/L，烟酸0.01g/L，VB60.01g/L，VB10.002g/L，甘氨酸0.04g/L；试剂一：6BA1g/L；试剂二：NAA1g/L；试剂三：KT1g/L；试剂四：TDZ0.1g/L；试剂五：IBA1g/L；试剂六：HCl0.5mol/L；试剂七：NaOH0.5mol/L；试剂八：NaClO0.1％；试剂九：升汞0.1％；母液一、母液二、母液三、母液四、母液五分别配制1L于4℃冰箱中贮存备用，其中，母液五需高温灭菌，在超净工作台上用100mL具塞瓶分装，随用随取。(2)培养基配制(以各阶段最适培养基为例)配制1L革叶卫矛初代培养基需要：母液一50mL、母液二50mL、母液三5mL、母液四5mL、母液五5mL，试剂一1mL，试剂二100μL；蔗糖30g/L，琼脂7g/L；配制1L革叶卫矛增殖培养基需要：母液一25mL、母液二50mL、母液三5mL、母液四5mL、母液五5mL，试剂三500μL，试剂四300μL；配制1L革叶卫矛生根培养基需要：母液一25mL、母液二50mL、母液三5mL、母液四5mL、母液五5mL，试剂五400μL；用试剂六和试剂七将培养基pH调至5.86；把装有革叶卫矛培养基的培养瓶放入高压灭菌锅中灭菌，温度121℃，时间15min，压强115kPa。将灭好菌的培养基在超净工作台中分装到带盖的培养瓶中。待冷却凝固后放入组培架上备用。2、外植体处理选取革叶卫矛当年生带有一两个侧芽的茎段、叶片、叶柄作为外植体。用加有洗涤剂的清水浸泡清洗，去除外植体上残留的虫卵、污渍等，转入烧杯中，用洁净纱布罩住杯口，在流水下冲洗50～60min。将外植体浸泡在预先配好的试剂八中15min，其中茎段要用牙刷轻轻刷洗腋芽和茎段连接处。叶片和叶柄浸泡即可。之后在盘子中将叶柄和茎段除去叶片切成1-2cm长，叶片修剪成0.5×0.5cm的正方形备用。将茎段、叶片和叶柄接种于初代培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L中进行培养，培养天数为35天，启动培养结束后，分别统计茎段、叶片、叶柄的诱导成活率。试验结果如下：表1最佳外植体筛选3个处理的试验结果项目带腋芽茎段叶片叶柄培养时间35d35d35d诱导成活率％934635试验结果说明：带腋芽茎段成活率高，高达93％。叶片和叶柄成活率仅为46％和35％，其余大部分出现褐化，并逐渐死亡。因此，当年生枝条上的带腋芽的茎段为革叶卫矛组织培养的最佳外植体。3、接种与培养(1)接种：接种前，超净工作台紫外灯打开15-20min，之后通风10min。然后将外植体在超净工作台上依照以下步骤进行处理：酒精30s→无菌水2次2min→0.1％升汞8min→无菌水2次2min→换杯(预先灭菌)→0.1％升汞8min→无菌水2次2min→换杯→0.1％升汞8min→无菌水2min→换杯→无菌水3min→换杯→无菌水3min→控干水分备用。然后用灭过菌的刀和镊子将外植体简单处理后接种到预先配制分装好的培养基中。初代培养基中一瓶接种1个，增殖培养基中一瓶接种2-3个，生根培养基中一瓶接种1个。(2)培养室培养：培养室采用荧光灯进行光照培养，温度控制在26℃，相对湿度45％-50％。启动培养后15-20d即可萌发，30-45d后小苗快速生长分苗后转入增殖培养基中培养。2-3个月后转入生根培养基中培养。3至4个月后待长出新根即可出瓶炼苗。4、各阶段接种培养基如下：(1)初代培养基：MS+6-BA0.5～2.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L；表2初代培养基9个处理条件及成活率结果项目CK处理1处理2处理3处理4处理5处理6处理7处理8处理96-BA01.00.52.01.01.00.50.52.02.0NAA00.20.10.50.10.50.20.50.10.2成活率％82786579965560395438说明：其中，对照CK和9个处理的基本培养基为MS培养基；对照CK为不添加激素6BA和NAA；6BA、NAA单位为mg/L，成活率单位为％；成活率＝成活数/接种数。据统计，处理4的茎段成活率达96％，表明处理4培养基：MS+6BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L为革叶卫矛的最适初代培养基。(2)增殖培养基：1/2MS+KT0.2～1.0mg/L+TDZ0.01～0.03mg/L+Vc20mg/L；表3增殖培养基9个处理条件及增殖系数结果项目CK处理1处理2处理3处理4处理5处理6处理7处理8处理9KT00.20.20.20.50.50.51.01.01.0TDZ00.010.020.030.010.020.030.010.020.03增殖系数2.52.652.032.102.542.332.892.232.222.49说明：其中，对照CK和9个处理的基本培养基为1/2MS培养基；对照CK为不添加激素KT和TDZ；6BA、NAA单位为mg/L；增殖系数＝增殖后芽的个数/接种数。据统计，处理6的增殖系数最高，为2.89。因此，通过对比得出，处理6的培养基：1/2MS+KT0.5mg/L+TDZ0.03mg/L+20mg/LVc为最适增殖培养基。(3)生根培养基：1/2MS+IBA0.1～0.5mg/L；表3生根培养基5个处理条件及生根率结果项目CK处理1处理2处理3处理4处理5IBA00.10.20.30.40.5生根率％284533358929说明：其中，对照CK和5个处理的基本培养基为1/2MS培养基；对照CK为不添加激素IBA。6BA、NAA单位为mg/L，生根率单位为％。生根率＝生根数/接种数。据统计，处理4的生根率达到89％。处理4的培养基：1/2MS+IBA0.4mg/L为最适生根培养基。5、炼苗与移栽炼苗与移栽包括以下步骤：(1)选取根系生长健壮、顶芽饱满的瓶苗，先开瓶炼苗2d，使幼苗适应外界环境。(2)将苗小心取出，不要伤到根系，流水冲净植株上附着培养基，洗不净则容易导致根系发霉腐烂最终死亡。(3)将苗栽到事先准备好已灭菌的培养土中，培养土采用蛭石：泥炭＝1：1的比例进行配制。(4)栽好后喷洒多菌灵溶液，然后覆薄膜，放置阴凉处。(5)1个月左右，待新叶、新根长出后放置向阳处培养，注意保持湿度，可白天覆膜，夜晚揭膜，温度保持在15-25℃，逐步加强通风。(6)待幼苗长势健壮再进行露天栽植。实施例21、外植体处理选取革叶卫矛当年生带有一两个侧芽的茎段作为外植体。用加有洗涤剂的清水浸泡清洗，去除外植体上残留的虫卵、污渍等，转入烧杯中，用洁净纱布罩住杯口，在流水下冲洗50～60min。将外植体浸泡在预先配好的试剂八中15min，要用牙刷轻轻刷洗腋芽和茎段连接处。之后在盘子中将茎段除去叶片切成1-2cm长，备用。接种前，超净工作台紫外灯打开15-20min，之后通风10min。然后将外植体在超净工作台上依照以下步骤进行处理：酒精30s→无菌水2次2min→0.1％升汞8min→无菌水2次2min→换杯(预先灭菌)→0.1％升汞8min→无菌水2次2min→换杯→0.1％升汞8min→无菌水2min→换杯→无菌水3min→换杯→无菌水3min→控干水分备用。2、启动培养培养室采用荧光灯进行光照培养，温度控制在26℃，相对湿度45％-50％。将茎段接种于初代培养基中进行培养，培养天数为35天，启动培养后15-20d即可萌发，启动培养结束后，统计茎段的诱导成活率。试验设置2个对照。试验分组情况如下：试验组：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L；对照组1：MS+6-BA2mg/L+IBA0.1mg/L+NAA0.05mg/L；(周魏2008年《双歧卫矛组织培养体系的建立》学位论文公开的初代培养基)对照组2：WPM+6-BA6mg/L+IBA0.2mg/L。(祖庆学2009年《火焰卫矛组织培养再生体系优化及遗传转化研究》学位论文公开的初代培养基)试验结果如下：表5启动培养成活率结果组别成活率％试验组96对照组171对照组265试验结果表明，经本发明提供的初代培养基培养后可显著提高茎段成活率，达96％，效果好于现有报道的以MS为基本培养基的对照组1和以WPM为基本培养基的对照组2。3、增殖培养启动培养结束后，分苗，将幼苗转入增殖培养基中培养。培养时间为1个月。增殖培养结束后，统计增殖系数。试验设置2个对照。试验分组情况如下：试验组：1/2MS+KT0.5mg/L+TDZ0.03mg/L+20mg/LVc；对照组1：MS+6-BA2mg/L+IBA0.1mg/L+NAA0.1mg/L；(周魏2008年《双歧卫矛组织培养体系的建立》学位论文公开的增殖培养基)对照组2：WPM+6-BA4mg/L。(祖庆学2009年《火焰卫矛组织培养再生体系优化及遗传转化研究》学位论文公开的增殖培养基)试验结果如下：表6增殖培养增殖系数结果组别增殖系数试验组2.89对照组12.32对照组22.15试验结果表明，经本发明提供的增殖培养基培养后可显著提高幼苗的增殖系数，为2.89，效果好于现有报道的增殖培养基。4、生根培养增殖培养结束后将继代苗转入生根培养基中培养。1个月后统计生根率。试验设置2个对照。试验分组情况如下：试验组：1/2MS+IBA0.4mg/L；对照组1：1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA1mg/L+AC0.1％；(周魏2008年《双歧卫矛组织培养体系的建立》学位论文公开的生根培养基)对照组2：1/2MS+NAA0.2mg/L+AC0.5g/L。(祖庆学2009年《火焰卫矛组织培养再生体系优化及遗传转化研究》学位论文公开的生根培养基)试验结果如下：表7生根培养试验结果组别生根率％试验组89对照组160对照组252试验结果表明，经本发明提供的生根培养基培养后可显著提高继代苗的生根率，为89％，效果好于现有报道的增殖培养基。5、炼苗与移栽将生根培养后各组的生根苗进行炼苗与移栽，炼苗与移栽包括以下步骤：(1)选取根系生长健壮、顶芽饱满的瓶苗，先开瓶炼苗2d，使幼苗适应外界环境。(2)将苗小心取出，不要伤到根系，流水冲净植株上附着培养基，洗不净则容易导致根系发霉腐烂最终死亡。(3)将苗栽到事先准备好已灭菌的培养土中，培养土采用蛭石：泥炭＝1：1的比例进行配制。(4)栽好后喷洒多菌灵溶液，然后覆薄膜，放置阴凉处。(5)1个月左右，待新叶、新根长出后放置向阳处培养，注意保持湿度，可白天覆膜，夜晚揭膜，温度保持在15-25℃，逐步加强通风。(6)待幼苗长势健壮再进行露天栽植。(7)观察并统计炼苗移栽成活率。表8移栽成活率试验结果组别成活率％试验组92对照组150对照组248以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3