本发明属于聚合物芯片的加工、制作、修饰及其应用领域，具体涉及一种基于微流控芯片细胞无支架自组装的方法及其应用。
背景技术：
单层细胞培养是体外细胞培养的主要方法，它具有培养简单、易操作、费用低、可大量应用的优点,被广泛用作体外药理毒理研究的实验模型。但常规的体外单层培养方法不能提供组织正常生长发育所需的环境条件，而生长环境对细胞基因表达及行为有着重要的影响，体内每个细胞的基因组是相同的,但不同器官组织中其表型和功能结构不同，在单层细胞培养中，细胞附在底物平面上生长，因缺少立体支架，只能向二维发展,不能生成细胞外基质。由于缺乏体内特异性生长因子及分化因子作用，细胞不能分化而失去原体内时的立体形态。因此，单层细胞培养所反映的生物学性状，与体内组织细胞相差甚远。因此为细胞提供与体内相似的支架系统，创建与原体内类似的生长环境，促使细胞增殖、分化及呈现出类似体内组织结构和功能性状是体外细胞培养的发展趋势。细胞三维培养就是基于上述特点，通过一些特殊的培养技术所建立的体外立体培养方法。三维培养体系为细胞提供类似体内生长环境的支架或基质，细胞通过紧密连接和缝隙连接等连接方式建立细胞间及细胞与胞外基质间的联系，形成一定的三维结构。三维培养细胞基因表达、基质分泌及细胞功能活动与单层培养细胞均有明显差异，而与体内细胞更为相似。因此三维细胞培养既能保留体内细胞微环境的物质结构基础，又能体现细胞培养的直观性及条件可控制性，把体外无细胞及单层细胞培养体系与组织器官及整体研究联系起来。
近年来利用制作弧形凹陷微结构形成三维细胞结构来研究细胞行为和功能越来越被人所关注。现在报道的微结构形成三维细胞结构一方面可为体外培养细胞提供与其组织来源相似甚至相同的细胞生长微环境和细胞联系,从而既有利于各类细胞的分化定向诱导，又有利于细胞分化表型的维持和增殖；另一方面可望在体外构建与各类组织、器官相应的细胞三维生长类似物或等同物。而其应用领域也涉及干细胞分化，胰岛细胞功能再生、肿瘤细胞的抗药性，体外器官重建等诸多方面。随着生物医学领域的需求，制作弧形凹陷微结构方法也在飞速发展，主要的方法有：冰刻蚀，软刻蚀、电子束刻蚀，原位合成法，气动技术等(1、Park,J.Y.；Hwang,C.M.；Lee,S.-H.,Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network.Biomedical Microdevices 2008,11(1),129-133；2、Xu,Y.；Xie,F.；Qiu,T.；Xie,L.；Xing,W.；Cheng,J.,Rapid fabrication of a microdevice with concave microwells and its application in embryoid body formation.Biomicrofluidics 2012,6(1),016504)。本研究组报道过的利用对SU-8聚合物模板进行热熔，使小孔的形状由直角形变为凹陷型的方式一种简单，快速，可控性强、并且价格低廉的制作弧形微结构的方式，尽管此方法现在已经发展较为成熟,但如何有效利用细胞形成三维组织，同时满足多细胞培养的需求，更有效的方法有待进一步改进。
综上所述，发明一种简单，高效，快速，无需专业的知识就可以操作的细胞无支架自组装的微流控芯片具有十分重要意义的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于微流控芯片细胞无支架自组装的方法及其应用，以解决以往细胞微组织形成过程中存在的操作步骤繁琐复杂、细胞利用率低，需专业的知识等局限，并有望生产化。
本发明一种基于微流控芯片细胞无支架自组装的方法，采用细胞培养的微流控芯片、晃动平台和控制器按照以下步骤进行：
(1)制备细胞培养的微流控芯片；
(2)接种细胞悬浮液，将芯片置于动态的可控晃动平台的载物台上；
(3)芯片与晃动平台放入细胞培养箱中培养，用控制器控制晃动时间和频率。
(4)细胞可自组装成微组织。
本发明所述的微流控芯片，上层为PDMS培养池结构，下层为PDMS凹陷微阵列结构；该芯片可以用于形成大小均一的细胞无支架微组织。
所述培养池为圆孔，凹陷阵列也为圆形阵列。。
所述微流控芯片的长为15-20mm,宽15-20mm,高5-10mm，培养池半径为5-10mm。
所述凹陷阵列小孔的直径大小可变化为：200-500微米。
所述方法的晃动培养时间为3-5小时，晃动频率为1-2秒晃动一次。
本发明一种基于微流控芯片细胞无支架自组装的方法的应用，用于形成直径不同的U87细胞的微组织。
一种用于细胞无支架自组装微流控芯片的制备方法，具体步骤如下：
(1)利用光蚀刻技术制作含有多个直径尺寸的小孔的SU-8聚合物模板；
(2)对SU-8聚合物模板在85℃加热5分钟进行热熔，使小孔的形状由直角形变为凹陷型；
(3)对热熔后的SU-8聚合物模板进行整体的紫外曝光90秒；
(4)将未固化PDMS聚合物溶液(单体与硅烷偶联剂体积配比为10：1)倾倒入SU-8聚合物模板上，85摄氏度加热固化PDMS聚合物溶液40分钟，剥离固化PDMS聚合物芯片，得到PDMS聚合物反模芯片；
(5)将未固化PDMS聚合物溶液倾倒入上述的PDMS聚合物反模芯片上，加热固化PDMS聚合物溶液，剥离固化PDMS聚合物芯片，得到具有凹陷小孔的PDMS聚合物芯片；
(6)利用商业购买的石英管在玻璃片上占位，将未固化PDMS聚合物溶液倾倒在玻璃表面，液面不高于石英管，加热固化PDMS聚合物溶液，剥离固化PDMS聚合物芯片，得到带有培养池的PDMS芯片；
(7)利用等离子体仪器不可逆封接将上述的2层PDMS聚合物芯片；
(8)对上述的整合芯片进行表面修饰，即得本发明微流控芯片；
其中，表面修饰条件为：0.002g/ml(溶剂为水)PF-127处理4个小时，后用无菌水和PBS溶液各冲洗2次。
本发明提供的用于细胞微组织形成的微流控芯片，该方法中所形成的微米级别的凹孔，该微孔的宽度和结构为设计固定，微孔的直径大小设定为：200，500和800微米。凹陷形小孔的深度通过调节乳酸乙酯显影SU-8聚合物模板的时间来控制，时间为5分钟，凹陷形小孔的曲率形状通过在加热板调节热熔的加热时间来控制，加热时间为5分钟。
本发明还提供了基于微流控芯片细胞无支架自组装的方法，用于形成直径不同的U87细胞的微组织。
本发明提供的细胞无支架自组装的应用，先对弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片进行表面修饰，以达到细胞不贴附表面的作用，接种U87细胞悬液，在重力的条件下，U87细胞会自发的形成三维微球，在形成微球的过程中培养过程中，加入带有控制其的晃动平台，同时由于凹陷微结构的之间的间隔低于20微米，U87细胞大部分落入凹陷微结构中，U87自发形成了均一的细胞微球有效利用了细胞。
本发明的优点在于：
1、无需昂贵的仪器，操作简单、高效、快速；
2、实验成本低廉；
3、不涉及有机试剂，环境友好；
4、细胞操作简单，无需非常专业的微流控芯片知识。
附图说明
图1为用于细胞无支架自组织的微流控芯片结构示意图，其中1为PDMS培养池结构，2为PDMS凹陷微阵列。
图2为用于细胞无支架自组织的微流控芯片系统实物图。其中1为PDMS微流控芯片，2为晃动平台，3为控制器。
图3为细胞无支架自组织的微流控芯片培养U87细胞三天后的细胞增殖图。
图4为细胞无支架自组织的微流控芯片培养U87细胞三天后的细胞活性鉴定图。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
利用光刻蚀技术制作SU-8聚合物模板，含有直径不同的微孔，直径分别为200，500和800微米。采用常规的光刻蚀技术制作SU-8模板：将SU-8光刻蚀胶涂于干净的玻璃片上，95摄氏度前烘加热1小时后，去除有机试剂，待SU-8光刻胶冷却后；放上设计好的掩膜在紫外下曝光90秒后，95摄氏度后烘加热15分钟。区别于常规的方法，本发明SU-8模板显影时间为5分钟，为不完全显影，吹干显影剂后，在85℃下热熔5分钟，使SU-8模板中的微孔的结构由直角变为弧形；降温后，将SU-8模板在紫外灯下完全曝光90秒，弧形凹陷微孔的SU-8模板。将未固化的PDMS(体积比10：1)倾倒在制作好的SU-8聚合物模板上，并同时在85℃下加热固化40分钟。装置冷却后，剥离上层PDMS芯片形成反模。将未固化的PDMS倾倒于PDMS聚合物反模芯片上，并同时在85℃下加热固化40分钟，装置冷却后，剥离上层PDMS聚合物可形成弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片。利用商业购买的石英管在玻璃片上占位，将未固化PDMS聚合物溶液倾倒在玻璃表面，液面不高于石英管，加热固化PDMS聚合物溶液，剥离固化PDMS聚合物芯片，得到带有培养池的PDMS芯片；利用等离子技术，不可逆封接含有弧形凹陷小孔的PDMS层和有培养池圆孔的PDMS层芯片(如图1所示)。
实施例2
在封接的PDMS聚合物芯片上进行U87细胞微球培养。PDMS聚合物芯片首先进行灭菌处理，紫外照射过夜，然后使用0.2％的PF-127溶液进行表面修饰4小时，用无菌水和PBS溶液各冲洗2次后，接种U87细胞悬浮液，细胞在重力的作用下，会沉淀到芯片表面的小孔底部，晃动平台工作(如图2所示)4个小时，U87细胞形成三维细胞球。
实施例3
基于的微流控细胞无支架自组装的方法用于U87细胞的三维组织的形成。图3显示了U87细胞在静止与晃动的条件下再PDMS聚合物芯片培养三天的后的形态学变化，细胞微球在晃动4小时的条件下的直径均一性良好。图4显示了U87细胞在在静止培养与晃动培养4小时后培养3天的后的细胞活性鉴定，可以看出，细胞都能保持良好的细胞活性。