本公开涉及用于治疗杜兴氏肌肉营养不良症的发动蛋白2抑制剂或包含该抑制剂的组合物。
背景技术：
杜兴氏肌肉营养不良症(duchenne’smusculardystrophy(dmd))是儿童最常见的肌病。dmd患者发展为肌肉营养不良的表型。dmd是一种严重的x连锁病症，伴有的进行性肌萎缩和肌无力影响几乎全部肌肉，并通常导致心肺功能衰竭而引起过早死亡。尽管对dmd的治疗进行了广泛的研究，其中，许多研究靶向抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的表达(在al-zaidy，s.，l.rodino-klapac和j.r.mendell(2014)，“genetherapyformusculardystrophy:movingthefieldforward.”，pediatrneurol51(5)：607-618中综述)，然而，尚未发展出针对这种毁灭性疾病的有效治疗。
dmd是由于抗肌萎缩蛋白突变导致抗肌萎缩蛋白表达缺失。抗肌萎缩蛋白构成收缩组织与肌纤维质膜之间的机械连接。在dmd患者中，抗肌萎缩蛋白表达的缺失导致正常力量传递的中断，在纤维上施加大量的应力并导致肌纤维损伤。dmd患者需要针对生理肌肉力量的有效治疗，从而改善肌肉功能。dmd的大多数治疗方法针对的都是突变基因抗肌萎缩蛋白，以尝试提高抗肌萎缩蛋白的全长/部分的表达。
最近已经公开了针对x连锁中央核性肌病(x-linkedcentronuclearmyopathy(xlcnm))患者的降低dnm2表达的有潜力的新疗法。这种新方法是基于以下发现：发动蛋白2(dnm2)表达的降低可以挽救mtm1-/y小鼠的xlcnm(也被称为肌小管肌病)表型。
发明人发现，通过降低mdx小鼠(mdx小鼠为用于临床前dmd研究的经典小鼠模型)中的dnm2，数个年龄段的比肌肉力量得以显著改善。此外，对收缩引起的肌肉损伤耐受性的改善证实了这一发现的生理意义。因此，本文提供了通过降低dnm2表达来治疗杜兴氏肌肉营养不良症的新治疗方法。
技术实现要素：
在第一方面，本发明涉及用于治疗dmd的发动蛋白2抑制剂。
本发明还涉及用于治疗dmd的药物组合物，所述药物组合物包含发动蛋白2抑制剂和药学上可接受的载体/赋形剂。
本发明进一步涉及一种治疗dmd的方法，其中，所述方法包括向需要这种治疗的受试者给予治疗有效量的发动蛋白2抑制剂的步骤。
最后，本发明涉及发动蛋白2抑制剂在制备用于治疗dmd的药物组合物中的用途。
发动蛋白2抑制剂优选选自于由如下抑制剂所组成的组：针对发动蛋白2的抗体；特异性干扰发动蛋白2表达的核酸分子；经工程化以靶向dnm2基因并递送使用基因组编辑疗法的核酸酶的核酸或核酸酶；以及抑制发动蛋白2活性、表达或功能的小分子。在优选的实施方式中，发动蛋白2抑制剂选自于由特异性干扰发动蛋白2表达的核酸分子所组成的组。在具体的实施方式中，发动蛋白2抑制剂是特异性干扰发动蛋白2表达的核酶或rnai(一种反义核酸)。
在更具体的实施方式中，发动蛋白2抑制剂是sirna、shrna或反义snrna。在另一具体实施方式中，发动蛋白2抑制剂是经工程化以靶向dnm2基因并递送使用基因组编辑疗法的核酸酶的dna、mrna或核酸酶。
本发明进一步的目的涉及对有益于治疗dmd的化合物进行识别的筛选方法，所述方法包括如下步骤：
a)提供或获得候选化合物；以及
b)确定所述候选化合物是否抑制发动蛋白2的活性/表达，
c)如果所述候选化合物抑制发动蛋白2的活性/表达，则选择所述候选化合物。
对适于治疗dmd的分子进行筛选或识别的方法可任选地进一步包括如下步骤：在体内或体外将所选择的分子给予dmd非人动物模型或其部分(组织或细胞)，并分析其对肌病发病或进展的作用。
在对本发明的详细描述之后，本发明的这些目的和其它目的以及实施方式将变得更加明显。
附图说明
图1。在具有降低的dnm2的mdx小鼠中比肌肉力量增加。测量6周龄、3月龄和1岁的mdx-/y(白色)和mdx-/ydnm2+/-(黑色)小鼠的比肌肉力量。结果以相对于肌肉质量的绝对力量(spo/mg)显示。统计学显著性表示如下：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图2。对于具有降低的dnm2的mdx小鼠，收缩引起肌肉损伤后的肌肉力量得到改善。测量1岁的mdx-/y(黑色实线)和mdx-/ydnm2+/-(黑色虚线)小鼠的绝对肌肉力量。结果以初始力量的百分比(％)显示。统计学显著性表示如下：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图3。(a)首先对mdx-/y(白色)和mdx-/ydnm2+/-(黑色)小鼠的胫骨前肌的比肌肉力量(spo)进行测量。(b)随后使得胫骨前肌经历9次延长收缩。以第0、3、6和9次延长收缩后初始力量的百分比(％)显示mdx-/y(黑色实线)和mdx-/ydnm2+/-(黑色虚线)小鼠的结果。(c)将靶向dnm2(黑色)或干扰对照序列(白色)的aav-shrna肌肉内注射至3周龄的mdx-/y小鼠的胫骨前部。在3月龄时测量胫骨前肌的比肌肉力量(spo)。(d)使得胫骨前肌随后经历9次类似(b)的延长收缩，aavshrna对照(黑色实线)和aavshrnadnm2(黑色虚线)。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
发动蛋白2由dnm2基因(geneid1785)编码。更确切地说，dnm2基因位于第19号染色体第10,919,884碱基对至第10,942,586碱基对(grch37/hg19发布)，或位于nc_000019.10位置的第10,718,053碱基对至第10,831,910碱基对(grch38/hg19)。发动蛋白2基因或基因产物也被称作其它名称，包括但不限于cmtdi1、cmtdib、di-cmtb、dyn2、dyn2_human、发动蛋白ii、dynii。
发动蛋白2抑制剂
本文所使用的术语“发动蛋白2抑制剂”指能够特异性地降低发动蛋白2的表达或者抑制发动蛋白2的活性或功能的任何分子。优选地，此类发动蛋白2抑制剂是直接抑制剂，这意味着它直接与发动蛋白2蛋白或编码所述发动蛋白2的核酸或它们的一部分相互作用。根据本发明的发动蛋白2抑制剂能够在体内和/或在体外抑制或降低发动蛋白2的功能活性。抑制剂可以将发动蛋白2的功能活性抑制至少约30％，优选至少约50％，优选至少约70％、75％或80％，更优选85％、90％或95％。特别地，抑制剂可以将发动蛋白2的表达抑制至少约10％，优选至少约30％、35％、40％、45％，优选至少约50％，优选至少约70％、75％或80％。
本发明的发动蛋白2抑制剂可以通过阻断和/或抑制发动蛋白2的活性或功能而起作用。这例如可以通过抑制发动蛋白2的酶活性来实现。本领域技术人员可以根据已知的方法，通过测试例如网格蛋白介导的内吞作用中发动蛋白2的功能或gtpase活性，来容易地评估发动蛋白2的功能活性或酶活性(maciae.等，dynasore,acell-permeableinhibitorofdynamin：developmentalcell10，839-850，2006年6月)。就gtpase活性或脂质结合、亚细胞定位、网格蛋白介导的内吞作用、突触囊泡内吞作用的抑制剂而言，可以使用以下文献所描述的方法：mccluskey等，traffic，2013；mcgeachie等，acschembiol，2013。就发动蛋白2的gtpase活性、寡聚化、脂质结合而言，可以使用以下文献所描述的方法：wang等，jbiolchem2010；或kenniston和lemmon，emboj，2010。
本发明的发动蛋白2抑制剂还可以通过阻断和/或抑制发动蛋白2的表达(包括转录、剪接、转录成熟或翻译)起作用。可借助本领域技术人员所知的任何手段对发动蛋白2表达的降低或抑制进行评估，所述手段包括但不限于：例如使用抗发动蛋白2抗体，借助例如western印迹分析或elisa来评估发动蛋白2的蛋白水平；和/或例如使用任何可获得的技术，例如定量pcr，来评估发动蛋白2的mrna水平。
发动蛋白2抑制剂优选选自于由以下抑制剂所组成的组：针对发动蛋白2的抗体；特异性干扰发动蛋白2表达的核酸分子；以及抑制发动蛋白2酶活性(即，抑制gtpase活性)、表达(例如通过抑制启动子、剪接或翻译)或功能(例如抑制寡聚化、活化、脂质结合或伴侣结合)的小分子。
根据具体的实施方式，发动蛋白2抑制剂选自于由针对发动蛋白2的抗体或特异性干扰发动蛋白2表达的核酸分子(或核苷酸)所组成的组。在优选的实施方式中，发动蛋白2抑制剂选自于由特异性干扰发动蛋白2表达的核酸分子所组成的组。根据本发明，该特异性干扰发动蛋白2表达的核酸分子通常是非天然存在的核酸。具体的实施方式中，发动蛋白2抑制剂是特异性干扰发动蛋白2表达的rnai、反义核酸或核酶。
在具体的实施方式中，发动蛋白2抑制剂是sirna或shrna。
在本发明中，所述核酸能够与编码发动蛋白2的基因或转录物特异性杂交。“特异性杂交”意味着在严格条件下杂交。具体而言，严格条件可由以下条件定义：盐浓度；有机溶剂(如甲酰胺)的浓度；温度和本领域公知的其它条件。典型的严格杂交条件包括：30℃以上、优选35℃以上、更优选超过42℃的温度；和/或低于约500mm、优选低于200mm的盐度。然而，应理解的是，根据本发明的核酸不需要具有与靶序列100％的互补性来进行特异性杂交。具体而言，具有至少相当于约90％的互补性程度的核酸能够特异性杂交。优选地，根据本发明的核酸与靶序列之间的互补性程度相当于至少95％、96％、97％、98％、99％或100％。
术语“互补的”或“互补性”指多核苷酸与另一多核苷酸分子形成碱基对的能力。碱基对典型地由反平行多核苷酸链中的核苷酸单元之间的氢键形成。互补的多核苷酸链能够以watson-crick方式进行碱基配对(例如，a与t、a与u、c与g)，或以允许双链形成的任何其它方式进行碱基配对。如本领域技术人员所知晓的，当使用rna而不是dna时，尿嘧啶而不是胸腺嘧啶被认为是与腺苷互补的碱基。然而，除非另有说明，在本发明的上下文中表示为u时，隐含能够替换为t。完美互补性或100％互补性是指一条多核苷酸链的每个核苷酸单元都能够结合第二多核苷酸链的核苷酸单元的情况。不够完美的互补性是指两条链的一些但不是全部核苷酸单元能够相互结合的情况。例如，对于两个20-mer而言，如果各链仅两个碱基对能够相互结合，多核苷酸链展现出10％的互补性。同样地，如果各链的18个碱基对能够相互结合，多核苷酸链展现出90％的互补性。
本文所使用的术语“irna”、“rnai”或“干扰rna”指能够下调靶蛋白表达的任何rna。它包括小干扰rna(sirna)分子、双链rna(dsrna)分子、单链rna(ssrna)分子和短发夹rna(shrna)分子。rna干扰是指在转录后水平dsrna特异性地阻遏靶基因表达的现象。在正常情况下，rna干扰由数千碱基对长度的双链rna分子(dsrna)引发。在体内，导入细胞的dsrna被切割为被称为sirna的短dsrna分子的混合物。催化该切割的酶dicer是包含rnaseiii结构域的内切rnase(endo-rnase)(bernstein，caudy等，2001nature，2001年1月18日；409(6818)：363-6)。在哺乳动物细胞中，由dicer产生的sirna长度为21-23bp，其具有19或20个核苷酸的双链序列、2个核苷酸的3'垂悬和5'-三磷酸末端(zamore，tuschl等，cell，2000年3月31日，101(l)：25-33；elbashir，lendeckel等，genesdev.，2001年1月15日，15(2)：188-200；elbashir，martinez等，emboj.，2001年12月3日，20(23)：6877-88)。根据具体的实施方式，irna不包括microrna。
大量专利和专利申请，例如wo99/32619，已一般性地描述了sirna分子用于抑制基因表达的用途。z.wang等，pharmres(2011)28：2983-2995的综述中还详述了使用sirna和shrna的rna干扰治疗。
通常将sirna或shrna设计为针对翻译起始密码子下游19-50个核苷酸的区域，而通常避开5'utr(非翻译区)和3'utr。应该就所选择的sirna或shrna靶序列进行针对est数据库的blast搜索，以确保靶向唯一的期望基因。有助于制备和使用sirna或shrna的多种产品是可商购的。
在优选的实施方式中，rnai分子是长度为至少约10-40个核苷酸、优选为约15-30碱基核苷酸的sirna。
sirna或shrna可包括天然存在的rna、合成的rna或重组产生的rna，以及通过添加、删除、置换和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的rna的改造型rna。此类改造可包括将非核苷酸物质添加至例如sirna的分子末端或添加至sirna的一个或多个内部核苷酸，包括使sirna耐受核酸酶消化的修饰。
一些发动蛋白2抑制核酸是可商购的。例如可以列举但不限于如下：abnova-novusbiologicals，参考号为h00001785-r05-h00001785-r08的发动蛋白2rnai；santacruzbiotechnology，参考号为sc-35236的发动蛋白iisirna(h)，参考号为sc-35236-pr的发动蛋白ii(h)-pr，参考号为sc-35236-sh的发动蛋白iishrna质粒(h)，参考号为sc-35236-v的发动蛋白iishrna(h)慢病毒颗粒。
在具体的实施方式中，特异性干扰发动蛋白2的核酸分子是特异性干扰人肌肉发动蛋白2cdna全长序列(如seqidno1所示，添加有12b的转录变体1(nm_001005360.2)(外显子10a，13ter))的至少一部分的核酸。更具体而言，根据该实施方式，rnai分子是长度为至少约10-40个核苷酸的sirna或shrna、优选约15-30碱基核苷酸的irna。在具体的实施方式中，sirna或shrna靶向发动蛋白2mrna的至少一个外显子；更具体而言，发动蛋白2mrna的外显子1、4、5、12b、13、15、17和21中的至少一个。
在具体的实施方式中，特异性干扰发动蛋白2的核酸分子包含选自于由如下序列所组成的组中的序列，或者特异性干扰发动蛋白2的核酸分子由选自于由如下序列所组成的组中的序列组成：
-seqidno2的irna序列：5’-aaggacatgatcctgcagttcat-3’
(或shrnaseq编号c，见下)
-seqidno3的irna序列：5'-aagaggctacattggcgtggtga-3′
-seqidno4的irna序列：5'-aggtggacactctggagctctcc-3’，
-seqidno5的irna序列：5'-aagaagtacatgctgcctctgga-3’，
-seqidno6的irna序列：5'-aacgtctacaaggacctgcggca-3’，
-seqidno7的irna序列：5'-aggagaacaccttctccatggac-3’，
-seqidno8的irna序列：5'-aactgttactatctgagcag-3’，
-seqidno9的irna序列：5'-tgccaactgttactatact-3’，
-seqidno10的irna序列：5'-gaagagctgatcccgctgg-3’
-seqidno11的irna序列：5'-gcacgcagctgaacaagaa-3′
-seqidno12的irna序列：5'-ggacttacgacgggagatc-3′
-seqidno13的irna序列：5'-ggatattgagggcaagaag-3’
-seqidno14的irna序列：5'-ggaccaggcagaaaacgag-3′
-shrna15的irna序列：5′-gcgaatcgtcaccacttac-3′
也可用反义核酸来下调发动蛋白2的表达。反义核酸可与编码发动蛋白2的正义核酸的全部或部分互补(例如与双链cdna分子的编码链互补或与mrna序列互补)，认为反义核酸干扰靶mrna的翻译。本发明使用的反义核酸特异性干扰发动蛋白2的表达。
根据一个实施方式，反义核酸是与编码发动蛋白2的靶mrna互补的rna分子。
根据另一实施方式，反义核苷酸表示与编码发动蛋白2的pre-mrna的一部分互补的单链核酸序列(dna或rna)。具体而言，将本发明的反义核苷酸设计为阻断发动蛋白2pre-mrna中的剪接受体(sa)位点和/或外显子剪接增强子(ese)和/或分支点和/或能够调制pre-mrna剪接的任何序列，即，将其设计为与包含sa、ese、分支点序列或能够调制pre-mrna剪接的任何序列的发动蛋白2pre-mrna的一部分互补。更具体而言，反义核苷酸用于诱导发动蛋白2pre-mrna内的外显子跳跃(exon-skipping)，从而在所得mrna中引起移码，这产生含有提前终止密码子的截短cdna。这种策略因此允许dnm2蛋白水平降低。在具体的实施方式中，反义核苷酸用于诱导发动蛋白2pre-mrna内的外显子跳跃。例如，将所使用的反义核苷酸设计为特异性诱导外显子2或外显子8跳跃。在具体的实施方式中，本发明的反义核苷酸能够诱导人dnm2mrna中包含提前终止密码子。显示外显子2或外显子8跳跃导致发动蛋白2的蛋白缺失(如如下文献所描述：“reducingdynamin2expressionrescuesx-linkedcentronuclearmyopathy”，cowlingbs，chevremontt，prokici，kretzc，ferrya，coiraultc，koutsopouloso，laugelv，romeronb，laportej，jclininvest，2014年3月3日，124(3)：1350-63doi:10.1172/jci71206，电子出版：2014年2月24日；以及tinellie，pereiraja，suteru，hummolgenet，2013年11月1日，22(21)：4417-29doi:10.1093/hmg/ddt292，电子出版：2013年6月27日)。
在具体的实施方式中，将反义核苷酸设计为特异性诱导dnm2外显子2或外显子8跳跃，并包含如下序列中的一条，或由如下序列中的一条组成：
u7-ex2(具有反义u7snrna，靶向dnm2外显子2的跳跃)，包含如下序列：
seqidno26：gtcacccggaggcctctcattctgcagctc
u7-ex8(具有反义u7snrna，靶向dnm2外显子8的跳跃)，包含如下序列：
seqidno27：acacactagagttgtctggtggagcccgcatca
反义核酸的长度可为例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。具体而言，反义rna分子的长度通常为15-50个核苷酸。可使用本领域所知晓的程序，利用化学合成和酶连接反应来构建本发明使用的反义核酸。具体而言，反义rna可以是化学合成的、通过体外转录由线性模板(例如pcr产物)或环状模板(例如病毒或非病毒载体)产生的、或者通过体内转录由病毒或非病毒载体产生的。可对反义核酸进行修饰，以具有增强的稳定性、核酸酶耐受性、靶标特异性和改进的药理学特性。例如，反义核酸可以包含设计用于增加反义和正义核酸之间形成的双链的物理稳定性的修饰的核苷酸或/和骨架。
在本发明的上下文中，“核酶”是能够切割核酶与之具有互补区的单链核酸(如mrna)的具有核糖核酸酶活性的催化性rna分子。因此，核酶可用于催化性地切割mrna转录物，从而抑制由该mrna编码的蛋白的翻译。可利用本领域公知的方法设计、产生和给予对功能性发动蛋白2具有特异性的核酶分子(参见例如fanning和symonds(2006)rnatowardsmedicine(handbookofexperimentalpharmacology)，springer编：289-303页)。
根据本发明，也可将基因组编辑用作工具。基因组编辑是一类基因工程，其中，使用人工工程化的核酸酶或“分子剪刀”将dna插入基因组、从基因组中替换或从基因组中移除。核酸酶在基因组的期望位置处制造特定的双链断裂(dsb)，并利用细胞内源机制借助同源重组(hr)和非同源末端连接(nhej)的天然过程来修复被诱导的断裂。目前使用的是四个家族的工程化核酸酶：锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应因子核酸酶(talen)、crispr/cas系统(更具体而言，如在如下文献中描述的cas9系统：p.mali等，naturemethods，第10卷第10期，2013年10月)或工程化大范围核酸酶(meganuclease)再工程化的归巢(homing)核酸内切酶。根据本发明，可以dna或mrna将所述核酸酶递送至细胞，将此类dna或mrna工程化以靶向dnm2基因。根据一个实施方式，所述发动蛋白2抑制剂是经工程化以靶向dnm2基因并递送使用基因组编辑疗法的核酸酶的dna或mrna，或者，所述发动蛋白2抑制剂是经工程化以靶向dnm2的使用基因组编辑疗法的核酸酶。
可以将根据本发明所使用的如上定义的核苷酸以dna前体或编码它们的分子的形式进行给药。
对于体内使用，可借助化学修饰(如磷酸骨架修饰(例如硫代磷酸键))对本发明的核苷酸进行稳定化。可以如下形式给予本发明的核苷酸：游离(裸的)形式；或使用增强稳定性和/或靶向性的递送系统(例如脂质体)；或纳入至其它载体(如水凝胶、环糊精、可生物降解的纳米微囊、生物粘附性微球或蛋白性载体)；或与阳离子肽组合。也可将其偶联至仿生细胞穿透肽。也可以其前体或编码dna的形式给药。核苷酸的化学稳定化版本还包括“吗啉代”(磷酰二胺吗啉代寡聚物-pmo)、2'-o-甲基寡聚物、带achn-(rxrrbr)2xb肽标签的pmo(r，精氨酸；x，6-氨基己酸；b，(r)-丙氨酸)(ppmo)、三环dna或小核(sn)rna。可实现该效果的后几种形式的核苷酸为小核rna分子，包括u1、u2、u4、u4atac、u5、u7、u11和u12(或其它usnrnp)，优选u7snrna(如上识别的seqidno26和seqidno27)，特别是在与基于但不限于慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒的病毒转移法组合使用的情况下，优选u7snrna(如上认定为seqidno26和seqidno27)。所有这些技术为本领域所公知。
本发明的特异性干扰发动蛋白2表达的核酸分子可单独或与载体共同递送至体内。在最广的意义上，“载体”是能够促进核苷酸转移至细胞(优选为表达dnm2的细胞)的任何媒介。优选地，与无载体所获得的降解程度相比，载体将核苷酸运送至细胞使得所述核苷酸具有降低的降解程度。一般来说，本发明中有用的载体包括但不限于：已经插入或纳入本发明的核苷酸处理的质粒、噬菌粒、病毒以及衍生自病毒或细菌来源的其它媒介。病毒载体是优选的载体类型，包括但不限于来自于如下病毒的核酸序列：慢病毒(如hiv-1)、逆转录病毒(如莫洛尼鼠类白血病病毒、腺病毒、腺相关病毒)；sv40型病毒；疱疹病毒(如hsv-1病毒和痘苗病毒)。可容易地使用本文未指出然而本领域已知的其它载体。在其临床应用已被验证并可用于递送核苷酸的载体中，慢病毒、逆转录病毒和腺相关病毒(aav)显示出用于外显子跳跃策略的较大潜力。
本文所使用的术语“抗体”旨在广义上指任何免疫结合剂(如igg、igm、iga、igd和ige)以及人源化抗体或嵌合抗体。在某些实施方式中，由于igg和igm为在生理状态下最常见的抗体并且最容易制造，优选igg和/或igm。术语“抗体”用于指具有抗原结合区的任何抗体样分子，包括抗体片段如fab'、fab、f(ab')2、单结构域抗体(dab)、fv、scfv(单链fv)等。制备和使用多种基于抗体的构建体和片段的技术为本领域所公知。制备和表征抗体的手段也为本领域所公知(参见例如harlow，e.和lane，d.(1988)antibodies:alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory编)。
“人源化”抗体是其中的一个或多个人免疫球蛋白的恒定和可变骨架区融合至动物免疫球蛋白的结合区(例如cdr)的抗体。本发明涉及的“人源化”抗体是来自于小鼠、大鼠或其它物种并带有人的恒定和/或可变区结构域的嵌合抗体；双特异性抗体；重组抗体和工程化抗体，以及上述抗体的片段。此类人源化抗体设计为保留非人抗体(所述结合区由其衍生而来)的结合特异性，但避免针对该非人抗体的免疫反应。
“嵌合”抗体是具有如下特征的抗体分子：(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，从而抗原结合位点(可变区)连接至不同或改变的类型、效应因子功能和/或物种的恒定区，或赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等)；或(b)可变区或其部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区交换、替换或改变。
针对发动蛋白2的抗体为商购可得的，例如novusbiologicals出售或制造的如下抗体：目录编号：发动蛋白2抗体nb300-617、发动蛋白2抗体nbp2-16244、发动蛋白2抗体(6c9)h00001785-m01；santacruzbiotechnology出售或制造的如下抗体：目录编号：sc-81150、sc-6400、sc-166525、sc-166669、sc-166526；bd-biosciences出售或制造的抗体抗dnm2(小鼠抗体，610264)；或igbmc-illkirch出售或制造的抗体抗dnm2：r2679、r2680、r2865、r2866、r2640或r2641。
在另一具体的实施方式中，发动蛋白2抑制剂是抑制发动蛋白2酶活性或功能的小分子。
本文所使用的术语“抑制发动蛋白2的活性、表达或功能的小分子”指具有抑制或降低发动蛋白2的活性、表达或功能的能力的小分子，可以是有机或无机化合物，通常小于1000道尔顿。该小分子可以来自于任何已知的生物(包括但不限于动物、植物、细菌、真菌和病毒)或来自于合成分子库。可借助本文档描述的方法识别抑制发动蛋白2的活性、表达或功能的小分子。
发动蛋白抑制剂在综述harpercb等，trendscellbiol.，2013年2月，23(2)：90-101中描述。在具体的实施方式中，此类分子选自于由如下分子所组成的组：
－dynasore(发动蛋白1和发动蛋白2的非竞争性、细胞透过性缩氨基脲(semicarbazone)化合物抑制剂－cas编号304448-55-3)，其化学名称是3-羟基萘-2-甲酸(3,4-二羟基苯亚甲基)酰肼，
－hydroxy-dynasore(发动蛋白2的强效抑制剂(ic50＝2.6μμ))(hydroxy-dynasore是发动蛋白抑制剂dynasore的细胞透过性羟基化类似物－cas编号1256493-34-1)，其化学名称是3-羟基-n'-[(2,4,5-三羟基苯基)亚甲基]萘-2-甲酰肼，
－十四烷基三甲基溴化铵(cas编号1119-97-7)，由abcam以mitmabtm(ab120466)的名称销售(细胞透过性发动蛋白1和发动蛋白2抑制剂(对于发动蛋白ii的抑制，ic50＝8.4μμ)。它靶向普列克底物蛋白同源(ph)(脂质结合)结构域。它抑制受体介导的内吞作用和突触囊泡内吞作用(ic50值2.2μμ)，
－phthaladyn-23(细胞透过性邻苯二甲酰亚胺化合物，据报道抑制发动蛋白2gtpase活性(ic50＝63μμ))，phthaladyn-23的化学名称是4-氯-2-((2-(3-硝基苯基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1h-异吲哚-5-羰基)-氨基)-苯甲酸，
－dynole34-2，其为发动蛋白抑制剂v(scbt.com)，作用于gtpase活性，对gtp无竞争性，dynole34-2的化学名称是2-氰基-n-辛基-3-[1-(3-二甲基氨丙基)-1h-吲哚-3-基]丙烯酰胺，
－m-divi-1(线粒体分裂抑制剂，ic50＝10μμ)(scbt.com)，m-divi-1的化学名称是3-(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)-2-硫烷基喹唑啉-4(3h)-酮(3-(2,4-dichloro-5-methoxyphenyl)-2-sulfanylquinazolin-4(3h)-one)，
－iminodyn-22/17(scbt.com)(iminodyn22：ic50＝390nm，作用于gtpase变构位点，相对于gtp显示非竞争性拮抗作用)，iminodyn22的化学名称是n,n'-(丙烷-1,3-二基)双(7,8-二羟基-2-亚氨基-2h-苯并吡喃-3-甲酰胺)，iminodyn17的化学名称是n,n'-(乙烷-1,2-二基)双(7,8-二羟基-2-亚氨基-2h-苯并吡喃-3-甲酰胺)，
－octmab，即十八烷基三甲基溴化铵(abcam.com)，它靶向ρη结构域，
－发动蛋白抑制肽(tocrisbiosciences1774)：具有氨基酸序列seqidno28：qvpsrpnrap，
－dyngo-4a(ic50－2.5μμ)，它作用于gtpase变构位点，dyngo-4a的化学名称是3-羟基-n'-[(2,4,5-三羟基苯基)亚甲基]萘-2-甲酰肼，
－rtil-13(ic50－2.3μμ)，它是靶向ph结构域的去甲斑蝥素支架，rtil-13的化学名称是4-(n,n-二甲基-n-十八烷基-n-乙基)-4-氮杂-10-氧杂三环-[5.2.1]癸烷-3,5-二酮溴化物。
发动蛋白2抑制剂的用途
本发明涉及通过向有需要的患者给予治疗有效量的如上述定义的发动蛋白2抑制剂来治疗dmd的方法，以及此类发动蛋白2抑制剂在治疗dmd中的用途。本发明还涉及发动蛋白2抑制剂在制造用于治疗dmd的药物组合物中的用途。本发明还涉及用于治疗dmd的发动蛋白2抑制剂。
此外，本发明涉及包含发动蛋白2抑制剂和任选的药学上可接受的载体的药物组合物，具体而言用于dmd的治疗。
在本发明具体的实施方式中，待治疗的疾病是杜兴氏肌肉营养不良症(dmd)，更具体而言，通过增加dmd患者的肌肉力量和/或通过改善肌肉对收缩引起的损伤的耐受性进行所述治疗。
本文所使用的术语“治疗有效量”指的是给予患者的足以构成dmd治疗的治疗剂的量。在具体的实施方式中，待给予的治疗有效量是足以将发动蛋白2的表达、活性或功能降低至正常水平的同等水平或低于正常水平的量。正常水平为不表现出dmd的受试者的发动蛋白2的表达、活性或功能。可通过本领域普通技术人员公知的标准程序来确定待给予的发动蛋白2抑制剂的量。需要对患者的生理数据(例如年龄、大小和体重)、给药途径和待治疗的疾病加以考虑来确定合适的剂量，并任选地与不表现出dmd的受试者进行比较。本领域技术人员将认识到的是，待给予的发动蛋白2抑制剂的量、或者包含或表达特异性干扰发动蛋白2表达的核酸的载体的量是足以诱导改善不期望的dmd症状、或诱导dmd的一种或多种症状或体征得以缓解的量。一种或多种症状或体征的缓解可以通过对来自患者的肌源性细胞或肌细胞进行以下任何一种测定来评判：肌细胞钙摄取减少；胶原合成减少；形态改变；脂质生物合成改变；氧化应激降低；和/或肌纤维功能、完整性和/或存活性的改善。通常通过对肌肉活检的横切面进行组织化学分析和/或免疫荧光来评判这些参数。也可以通过对患者自身进行以下的任一种测定来评判一种或多种症状或体征的缓解：至无法行走的时间的延长；肌肉力量的改善；提举重物能力的改善；从地面起身所需时间的改善；9米步行时间或6分钟步行的改善；攀爬四层楼梯耗时的改善；腿部功能定级的改善；肺功能的改善；心功能的改善；生活质量的改善。这些测定中的每一种都是本领域技术人员已知的。对于这些测定中的每一种，只要在测定中发现测量的参数具有可检测的改善或增长，则宜认定使用本发明的方法缓解了个体中杜兴氏肌肉营养不良症的一种或多种症状。可检测的改善或增长优选为如hodgetts等所描述的统计学上显著的改善或增长(hodgettss.等(2006)，neuromusculardisorders，16：591-602，2006)。或者，如本文后述的，可以根据测得的肌纤维功能、完整性和/或存活性的改善来评判杜兴氏肌肉营养不良症的一种或多种症状的缓解。可以使用以下测定中的至少一种来评判肌纤维功能、完整性和/或存活性的改善：血液中肌酸激酶可检测的降低；在被怀疑为营养不良的肌肉活检横切面中肌纤维坏死的可检测的降低；和/或在被怀疑为营养不良的肌肉活检横切面中肌纤维直径均匀性的可检测增加。这些测定中的每一种都是本领域技术人员已知的。发动蛋白2抑制剂的量、或含有或表达特异性干扰发动蛋白2表达的核酸的载体的量可根据选定的发动蛋白2抑制剂的类型、患者的性别、年龄、体重、整体身体状况等因素而改变，并可基于个案确定。该量也可根据治疗方案的其它组成因素(例如给予其它药物等)而改变。一般来说，当发动蛋白2抑制剂是核酸时，合适的剂量范围为约1mg/kg至约100mg/kg，更通常为约2mg/kg/天至约10mg/kg/天。如果选择基于病毒的核酸递送，合适的剂量将依赖于不同因素，例如使用的病毒、递送途径(肌肉内、静脉内、动脉内或其它)，但通常可以是10-9病毒颗粒/kg至10-15病毒颗粒/kg。如果抑制剂是抑制发动蛋白2的活性、表达或功能的小分子，每单位剂量可以包含例如2mg/kg体重至300mg/kg体重，特别是5mg/kg体重至100mg/kg体重。如果抑制剂是抗体，每单位剂量可以包含例如0.1mg/kg体重至20mg/kg体重、特别是4mg/kg体重至10mg/kg体重。本领域技术人员将认识到的是，此类参数通常是在临床试验过程中制定。此外，本领域技术人员将认识到的是，通过本文所述的治疗，疾病症状可能完全缓解，然而并非必须如此。即使部分的或间歇性的症状缓解对于接受治疗者也可大有裨益。此外，对患者的治疗可为单个事件，或在多个时机给予患者发动蛋白2抑制剂，依赖于获得的结果，所述多个时机可相隔几天、相隔几个星期、或者相隔几个月、或者甚至相隔几年。在根据本发明的方法的治疗中可以具有至少一周、至少一个月、至少几个月、至少一年、至少2、3、4、5、6年或更长的持续时间。给予频率可以在两周至少一次、或三周至少一次、或四周至少一次、或五周至少一次、或更长时间段中至少一次的范围内。
如本文所定义的根据本发明用途的各发动蛋白2抑制剂可适用于直接给予至受到dmd影响或具有dmd发生风险的个体体内的细胞、组织和/或器官，并可直接进行体内、离体或体外给药。本文所使用的寡核苷酸可以直接或间接地给予至受到dmd影响或具有dmd发生风险的个体体内的细胞、组织和/或器官，并可直接或间接地进行体内、离体或体外给药。因为杜兴氏肌肉营养不良症在肌细胞中具有明显的表型，优选所述细胞是肌细胞，进一步优选所述组织是肌肉组织，和/或进一步优选所述器官包括肌肉组织或由肌肉组织组成。优选的器官是心脏。优选地，所述细胞是患有dmd的个体的细胞。
可以其本身的形式将如本文定义的发动蛋白2抑制剂(所述抑制剂可以是分子或寡核苷酸或它们的等同物)递送至细胞。当向个体给予所述抑制剂时，优选将其溶解在与递送方法相容的溶液中。对于静脉内、皮下、肌肉内、鞘内和/或脑室内给药，优选地，溶液为生理盐溶液。对于本发明的方法，特别优选的是使用赋形剂，所述赋形剂会进一步促进将本文定义的所述抑制剂递送至细胞并递送进入细胞(优选肌细胞)。
按照本领域技术人员知晓的标准制药实践(参见例如remington：thescienceandpracticeofpharmacy(第20版)，a.r.gennaro，lippincottwilliams&wilkins编，2000；以及encyclopediaofpharmaceuticaltechnology，j.swarbrick和j.c.boylan编，1988-1999，marceldekker，newyork)来配制本发明的药物组合物。优选地，如本文所定义的发动蛋白2抑制剂被溶解于与递送方法相容的溶液中。对于静脉内、皮下、肌肉内、鞘内和/或脑室内给药，优选的是溶液是生理盐溶液。
更加普遍而言，可能的药物组合物包括那些适于经口、经直肠、经粘膜、局部(包括经皮、口腔和舌下)、或胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内、动脉内和皮内)给药的药物组合物。对于这些制剂，可根据本领域技术人员公知的技术使用常规赋形剂。
更具体而言，为了提供局部治疗效果，优选特定的肌肉给药途径。特别优选肌肉内给药。
可将根据本发明的药物组合物配制为在给药后实质上立即释放活性药物，或在给药后的任意预定时间或时间段释放活性药物。
在本发明的上下文中，术语治疗指治愈性的(curative)、对症的(symptomatic)和预防性的处理。本文使用的术语疾病的“治疗”指的是任何旨在延长受试者(或患者)寿命的行为，如疾病进展的延迟和治疗。可将治疗设计为根除疾病、阻止疾病进展和/或促进疾病康复(regression)。术语疾病的“治疗”也指任何旨在减少与疾病相关的症状(如张力减退和肌无力)的行为。至无法行走的时间的延长；肌肉力量的改善；提举重物能力的改善；从地面起身所需时间的改善；6分钟步行或9米步行时间的改善；攀爬四层楼梯耗时的改善；腿部功能定级的改善；肺功能的改善；心功能的改善；受试者(或患者)生活质量的改善也在术语“治疗”一词的定义之内。更具体而言，根据本发明的治疗旨在推迟dmd表型或症状的出现，改善运动(motor)和/或肌肉行为和/或寿命，特别是通过改善肌肉力量和/或对收缩引起的肌肉损伤的耐受性来实现。
待治疗的受试者(或患者)是任何哺乳动物，优选是人。优选地，受试者是人类患者(无论其年龄或性别)。新生儿、婴儿、儿童也包括在内。更优选地，根据本发明的患者或受试者是杜兴氏患者或疑似杜兴氏患者(由于他或她的遗传背景而易于发生dmd的患者)。
发动蛋白2抑制剂的筛选
本发明还涉及对有益于dmd的分子进行识别或筛选的方法，所述识别或筛选基于此类分子抑制发动蛋白2的表达、活性和/或功能的能力。
具体而言，本发明给出包含如下步骤的筛选方法：
a)提供或获得候选化合物；以及
b)确定所述候选化合物是否抑制发动蛋白2的活性、功能和/或表达；
c)其中，所述候选化合物抑制所述发动蛋白2的活性、功能或表达的能力指示所述候选化合物对于dmd治疗的有效性。
在本方法的框架内，待测试的候选化合物可以是任何分子性质，例如，它可对应于化学分子(优选小分子)、抗体、肽、多肽、适体、sirna、shrna、snrna、正义寡核苷酸或反义寡核苷酸、核酶、或靶向核酸内切酶。
可以使用本领域技术人员知晓的任何方法(例如上文指出或在实施例中描述的方法)测试所述候选化合物抑制发动蛋白2的表达、活性或功能的能力。
对适于治疗dmd的分子进行筛选或识别的方法可任选地进一步包括如下步骤：在体内或体外将所选择的分子给予dmd非人动物模型或其部分(组织或细胞，如肌肉组织或肌细胞)，并分析对肌病发病或进展的作用。
作为dmd非人动物模型，可以列举抗肌萎缩蛋白缺陷型mdx小鼠。抗肌萎缩蛋白缺陷型mdx小鼠是用于杜兴氏肌肉营养不良症医学研究的经典模型，于30年前首次发现(bulfield，g.，w.g.siller，p.a.wight和k.j.moore(1984)，“xchromosome-linkedmusculardystrophy(mdx)inthemouse.”procnatlacadsciusa，81(4)：1189-1192)。mdx小鼠带有的自发突变导致在抗肌萎缩蛋白基因的外显子23中产生提前终止密码子，且蛋白表达完全丧失。mdx小鼠模型已被广泛用于dmd的病理生理学研究，并在临床前方法中用于测试潜在的疗法(manning，j.和d.o'malley(2015)，“whathasthemdxmousemodelofduchennemusculardystrophycontributedtoourunderstandingofthisdisease？”，jmusclerescellmotil.)。在以下实施例中使用该模型小鼠。
出于说明而并非限制的目的给出以下实施例。
实施例
实施例1
材料：
动物实验。将动物安置在具有12:12小时光/暗周期的温控室(19-22℃)中。根据动物实验的国家和欧洲法规，通过co2吸入后实施颈椎脱位，在需要时将小鼠人道地处死，将胫骨前肌解剖出并在液氮冷却的异戊烷和液氮中冷冻。动物实验由机构伦理委员会com’ethigbmc-ics和法国政府批准(批准编号n°01594.01)。
小鼠繁殖：利用来自charlesriverlaboratories的雄性dmdmdx纯合小鼠和雌性dmdmdx纯合小鼠进行繁殖，获得自发出现dmd的小鼠模型mdx小鼠，该mdx小鼠不表达抗肌萎缩蛋白并呈现轻度营养不良表型。使得mdx小鼠与dnm2+/-小鼠繁殖，从而遗传性地下调dnm2。生成dnm2+/-小鼠并由宿主实验室表征，如前所述(cowling，b.s.，t.chevremont，i.prokic，c.kretz，a.ferry，c.coirault，o.koutsopoulos，v.laugel，n.b.romero和j.laporte(2014)，“reducingdynamin2expressionrescuesx-linkedcentronuclearmyopathy.”jclininvest124(3)：1350-1363)。
原位肌肉力量：使用wholemousetestsystem(aurora1300a)，对6周龄、3月龄和1岁龄的mdx-/y和mdx-/ydnm2+/-小鼠胫骨前部最大肌肉力量实施原位测量。如前所述(cowling等，2014)，刺激坐骨神经，并测量胫骨前肌收缩产生的总力。计算最大肌肉力量相对于肌肉质量的比值作为比肌肉力量。
收缩引发的肌肉损伤：如前所述(hourde等，2013)，使用wholemousetestsystem(aurora1300a)测量1岁时对收缩引起的肌肉损伤的易感性。对数次损伤引起的延长收缩导致的绝对肌肉力量的降低进行测量。首先刺激坐骨神经(700毫秒，频率150hz)，测量所产生的等长肌肉力量，然后进行8次延长(+10％长度)收缩，在每次收缩后(在初始长度)测量等长肌肉力量。以第2、5和8次延长收缩之后初始力量百分比显示数据。收缩测量后，使用过量的戊巴比妥使动物安乐死，对胫骨前肌进行称重。
结果：
原位测量胫骨前肌的比肌肉力量来测试肌肉功能的生理改善。测量坐骨神经被刺激时的绝对肌肉力量。然后计算总肌肉力量与肌纤维质量之比作为比肌肉力量。与对照mdx-/y小鼠相比，具有降低的dnm2表达的mdx-/y小鼠(mdx-/ydnm2+/-)在6周龄和3月龄时比肌肉力量增加(图1)。
为了证实这种肌肉力量改善的生理意义。已经知晓的是，类似于杜兴氏肌肉营养不良症(dmd)的患者，缺少抗肌萎缩蛋白的mdx-/y小鼠的骨骼肌比健康对照更容易受到收缩引起的损伤。因此，使得小鼠经历延长的肌肉收缩(这诱导肌纤维的损伤)，以分析dnm2表达降低时mdx营养不良肌肉对损伤的易感性。
进行8次延长收缩，引起肌纤维损伤，每次收缩后测量最大肌肉力量。重要的是，与mdx-/y小鼠相比，mdx-/ydnm2+/-小鼠在对收缩引起的损伤的耐受性方面表现出2倍的增加(图2)。因此，降低dnm2改善了mdx肌肉对收缩引起的损伤的耐受性。
结论：
因此，降低dnm2表达具有针对杜兴氏肌肉营养不良症的治疗潜力。通过降低dnm2，mdx小鼠确实显示出数个年龄段比肌肉力量的显著改善，其中，mdx小鼠是用于临床前dmd研究的经典小鼠模型。此外，在收缩引起的肌肉损伤的耐受性中观察到两倍的改善，证实了该发现的生理意义。因此，降低dnm2是杜兴氏肌肉营养不良症的新的治疗靶标。
实施例2
材料和方法：
aav的生产和纯化：
利用paav2插入物、pxr1和phelper对aav-293细胞系进行三重转染，生成aav2/9载体，其中，所述paav2插入物包含处于cmv启动子控制下、侧翼具有血清型2反向末端重复的插入物，所述pxr1包含aav血清型9的rep基因和cap基因，所述phelper编码腺病毒辅助功能。对细胞裂解液进行3次冻融循环，然后使用50u/mlbenzonase(sigma)在37℃处理30分钟，并通过离心澄清。使用离心过滤器(amiconultra-15centrifugalfilterdevices30k，millipore，bedford)进行碘克沙醇梯度超速离心，随后相对于杜氏磷酸缓冲生理盐水进行透析并浓缩，对病毒载体进行纯化。通过实时pcr，使用质粒标准paav-egfp对物理粒子进行定量，以每毫升病毒基因组(vg/ml)表示效价。在这些实验中使用的raav效价为5×1011至7×1011vg/ml。
mdx-/y小鼠胫骨前部(t.a)肌肉的aav转导：
通过i.p.注射5μl/g氯胺酮(20mg/ml；virbac，法国卡罗)和甲苯噻嗪(0.4％，rompun；bayer，德国伍珀塔尔)将3周龄的雄性mdx-/y小鼠麻醉。将aav2/9干扰对照序列(白色)或靶向dnm2(黑色)的aav2/9-shrna肌肉内注射至3周龄的mdx-/y小鼠的胫骨前部。动物被安置在具有12:12小时光/暗周期的温控室(19℃至22℃)中。
小鼠繁殖如实施例1所述。
结果：
在具有降低的dnm2的mdx小鼠中，收缩引起肌肉损伤后的肌肉力量。
分析了mdx-/y和mdx-/ydnm2+/-小鼠的肌肉力量。首先测定mdx-/y(白色)和mdx-/ydnm2+/-(黑色)小鼠的胫骨前肌的比肌肉力量(spo)(见图3a)。随后使得胫骨前肌经历9次延长收缩。对于mdx-/y(黑色实线)和mdx-/ydnm2+/-(黑色虚线)小鼠，以第0、3、6和9次延长收缩后初始力量的百分比(％)显示结果(见图3b)。
将aav2/9干扰对照序列(白色)或靶向dnm2(黑色)的aav2/9-shrna注射至3周龄的mdx-/y小鼠的胫骨前肌。在3月龄测量胫骨前肌的比肌肉力量(spo)(见图3c)。然后，使得胫骨前肌经历9次类似图3b的延长收缩(见图3d)，aavshrna对照(黑色实线)和aavshrnadnm2(黑色虚线)。
分析时所有小鼠的年龄皆为3月龄。n＝7-10只小鼠/组。所有图以平均值±s.e.m表示。
在图3b和图3d中，具有降低的dnm2的mdx-/y小鼠(黑色虚线)都显示出对收缩引起的损伤的耐受趋势。
结论：
使得小鼠与dnm2+/-小鼠杂交，或向其肌肉内注射靶向dnm2的表达aav的shrna，以降低dnm2的水平。在3月龄时，组间比肌肉力量无显著差异，对于两种技术，均观察到对收缩引起的损伤的耐受性增加的趋势。
序列表
<110>斯特拉斯堡大学
法国国家科学研究中心
国家健康医学研究所
<120>用于治疗杜兴氏肌肉营养不良症的发动蛋白2抑制剂
<130>b2017
<150>15305615.5
<151>2015-04-22
<160>28
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>3714
<212>dna
<213>homosapiens(智人)
<400>1
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