鉴定护肤组合物的昼夜节律依赖性化妆剂的方法与流程
皮肤是限定在生物体与环境之间的交互式边界的护盖的复杂的多层且动态的系统。它是身体最大的器官，并且对我们的健康和我们的自我形象至关重要。皮肤包括三个主要层：表皮、真皮和皮下脂肪层。表皮中的大部分细胞是产生称为角蛋白的蛋白质家族的角质细胞。表皮本身可以分成多层，其中最外层称为角质层，并且最内层称为基底层。所有的表皮细胞起源于基底层，并且随着它们逐渐向外置换到角质层而经历一个称为分化的过程，在此它们融合成鳞片并最终脱落。在健康的正常皮肤中，生产率与脱落率(脱屑率)大致相同。完全成熟的角质细胞起保护皮肤免受紫外线损坏的作用，并且有助于完成对环境刺激的免疫应答。
位于表皮正下方的真皮主要由蛋白质胶原构成，占真皮重量的75％，并且负责着皮肤的回弹性和弹性。胶原束通过贯穿真皮的弹性蛋白纤维保持在一起。成纤维细胞是在真皮中发现的主要细胞，其功能是合成胶原和真皮基底物质，真皮基底物质是缠住真皮的纤维和细胞组分的包含糖蛋白和糖胺聚糖的胞外基质。微小血管的网络贯穿真皮中的“钉突”，通过扩散将营养物、维生素和氧气带到表皮。
真皮下面是皮下组织，其包含从诸如肌肉和骨头的下面组织缓冲真皮的皮下脂肪。脂肪包含在包埋在结缔组织基质中的脂肪细胞中。该层还可容纳处于生长阶段的毛囊。
因此，皮肤是包含多种细胞类型和结构的多层复杂器官。皮肤老化同样是一个复杂的多因素过程，这是由未修复的细胞和组织损坏导致的功能能力受损而造成的。皮肤的老化过程是数十年来发生的内在因素和外在因素两者的结果。皮肤受到许多与其它器官相同的内在老化过程，但还暴露于太阳辐射、污染、香烟烟雾和可能促进皮肤过早老化或光老化的其它外在因素。通过鉴定与长寿和衰老相关联的细胞通路和基因，已经在理解衰老过程方面取得了重大进展。然而，就像一般的老化一样，尚未发展出对皮肤老化的综合理解。
皮肤研究人员将年龄诱导因素分为内在因素和外在因素，尽管这些因素是彼此相关的，例如通过外在因素可能加速内在老化的事实所反映。因素的复杂相互作用的一个示例涉及自由基，其是通过正常的代谢过程在内部产生，以及是由于包括uvr暴露的外部因素而生成。由于保护性内部抗氧化机制的年龄相关的下降，自由基可以在细胞中达到更高且持续的水平，并且改变皮肤中的蛋白质和dna两者。改变的蛋白质和dna的水平可能聚积，造成有时称为氧化应激反应的损坏。此外，继发于内部生成的自由基与由uvr和其它外部攻击(表面活性剂、过敏原和其它刺激物)生成的那些自由基的组合的损坏的持续聚积可以促进慢性炎性状态，这加速了老化过程。例如，可能生成蛋白分解酶，导致胶原降解。在一些情况下，由循环促炎介质(例如，前列腺素、细胞因子、组胺)升高产生的活化炎性细胞可以生成对核酸、细胞蛋白质和脂质引起氧化损坏的活性氧物质。由活性氧物质引起的聚积损坏可能刺激许多细胞因子级联，导致光老化和光致癌，所有这些都可能与老化皮肤的外观密切联系。
由氧化应激反应引起的变化可能会损害皮肤的弹性、紧致度和结构，促成塌陷和不规则的区域，最终表现为细纹、皱纹和质地问题。存在许多消费者可用的可商购获得的皮肤护理产品，它们涉及改善皮肤的健康和/或物理外观。许多此类产品涉及延缓、最小化或甚至消除通常与改善老化皮肤的外观相关联的变化。此类产品通常宣传使用一种或多种已知用于改善皮肤的健康和/或外观的化妆护肤剂。因此，仍然需要鉴定可以改善老化皮肤的外观的护肤活性物质。
由于与皮肤老化相关联的多细胞多因素过程，已经证明新型抗衰老化妆剂的成功鉴定是困难的。另外，许多期望的化妆剂可能包含具有可能未被充分理解的效果和相互作用的化合物的混合物。化妆品配制人员面临的另一挑战是化妆品必须对非处方消费者使用是安全的。对潜在化妆剂的生物学应答的常规体外研究包括在可以被鉴定出给出期望结果的化妆剂并将其移入下一测试阶段之前在各种细胞类型中筛检数百或甚至数千种潜在试剂。当采用筛检技术如连通映射或其它已知的基因应答分析技术时，该问题可能会进一步复杂化。这类研究可以被通常由化妆剂诱导和/或引起的复杂或弱可检测的基因应答所阻碍。这类弱应答部分地由于涉及到大量的基因和基因产物而产生，并且化妆剂可能以多种方式影响多个基因。此外，化妆剂的生物活性程度对于每个基因可能不同，并且难以定量。
到目前为止，皮肤研究通常没有考虑皮肤的昼夜节律以及皮肤的昼夜节律如何影响化妆剂的功效。像其它器官一样，皮肤受到生物节律的影响。生物节律是随时间而发生的生理变化，具有可再现的波形。包括dna修复的皮肤的细胞功能不会在随机时间以相等的概率发生。相反，这些细胞活动受具有昼夜节律(24小时)的内源性时钟调控。身体接受环境线索，诸如存在和不存在日光，以帮助同步全身的各种细胞和系统的内源性时钟。因此，昼夜周期由通常与太阳日的阶段相重合的明暗周期组成。例如，光明周期可对应于约上午6:00至约下午6:00，并且黑暗周期可对应于约下午6:00至约上午6:00。
昼夜节律允许皮肤细胞预测可潜在地影响细胞的环境变化并相应地进行调整。在身体健康且昼夜节律正常作用的受试者中，皮肤细胞以同步方式起作用，并在最佳时间执行其各种功能。例如，人类的昼夜节律提出，在白天，皮肤促进对于环境的各种保护功能。人类的昼夜节律提出，在夜间，皮肤促进细胞更新和各种代谢合成过程。尽管通常已知皮肤护理疗法的功效可以根据给药当天的时间来优化，并且还显示昼夜节律钟和生物节律两者都受老化过程影响，但目前还没有可用于鉴定与皮肤的昼夜节律同步工作以最大化抗衰老功效的新型抗衰老化妆剂的方法。
因此，虽然许多皮肤护理剂是已知的，但是持续需要改善的、灵敏的且可断定的筛检方法来准确地鉴定新型化妆剂，这些新型化妆剂不仅提供按时间顺序老化和/或光老化的皮肤的治疗，而且还可以更具体地靶向特定的皮肤细胞类型，并且可以与皮肤的昼夜节律同步工作以最大化功效并优化治疗。还需要鉴定与现有产品相比提供类似或改善的益处但更易于配制、生产和/或销售的另外的化妆剂。
技术实现要素：
因此，本发明提供了可用于筛检和生产与皮肤的昼夜节律同步工作以治疗老化皮肤的潜在化妆剂的新方法。通过基因表达谱分析和生物信息学分析，本发明人已经确定，有可能得到新的和独特的基因标签，以用于开发用于鉴定对人类皮肤有效提供昼夜节律依赖性dna修复益处的化妆品测试剂的新筛检方法。这些独特的基因标签可以充当先前未鉴定出的与dna修复相关联的通路的指示物，并且因此可以提供鉴定新类别的化妆剂的机会。
在一些情况下，这些方法允许筛检与皮肤的昼夜节律如皮肤的昼夜节律周期的黑暗周期同步工作的化妆品测试剂。这些新方法还允许鉴定新型化妆剂，所述新型化妆剂可以针对它们对皮肤老化状况的选择性治疗以及针对诸如角质细胞或成纤维细胞的特定皮肤细胞类型的特异性靶向来筛检。因此，本发明提供了独特地适合于期望治疗目标的方法。另外，这些方法特别有用，因为它们可以充当先前未鉴定出的与dna修复相关联的通路的指示物，并且因此可以提供鉴定新类别的化妆剂的机会。
根据本发明的一个实施方案，提供了一种鉴定对人类皮肤有效提供昼夜节律依赖性dna修复益处的化妆品测试剂的筛检方法。该方法包括：(a)使皮肤组织样本与化妆品测试剂接触；(b)生成该皮肤组织样本的转录谱，其中该转录谱包含与选自下列的至少两个基因的转录有关的数据：apitd1、actr5、ap5z1、apex1、apex2、aplf、aptx、atxn3、bccip、brca1、c11orf30、cdc14b、chek1、cul4a、dclre1c、dtl、epc2、exo5、eya3、fam175a、fan1、fancc、fancf、fancg、fancl、fignl1、gadd45a、gtf2h1、h2afx、ints3、kiaa0430、kiaa0101、kin、mcm9、mdc1、mgme1、morf4l2、mre11a、msh2、mum1、neil1、neil3、nono、npm1、nsmce1、ogg1、parpbp、pif1、pml、pms1、pms2、pold1、pold2、pole、polk、polr2f、rad50、rad51b、rad51c、rad52、rbm14、recql5、rfc4、rfc5、rpa2、sfpq、sfr1、smarca5、smc4、smg1、swi5、ticrr、tp53bp1、tp73、ube2t、ube2w、usp28、usp47、wdr33、zfyve26；(c)将皮肤组织样本的转录谱与对照转录谱进行比较；以及(d)当皮肤组织样本的转录谱和对照转录谱一致时，将化妆品测试剂鉴定为对人类皮肤有效提供昼夜节律依赖性dna修复益处。
这些以及本发明的附加对象、实施方案和方面参见下面的附图说明和具体实施方式将变得显而易见。
附图说明
图1a和1b示出在许多基因本体论类别中显露表达的节律模式的全局基因表达谱，包括dna修复基因。
图2示出控制dna修复的若干关键基因和显示强烈昼夜节律性的若干代谢过程。图2a示出代表性dna修复基因的相互作用网络。图2b示出代表性dna修复基因表达变化。
图3示出表皮中示例性dna修复基因的代表性数据。图3a示出由于老化引起的表皮中的示例性基因的表达变化(％)(自20s的平均值的表达变化％)。图3b示出在体外用gse(0.01％)处理的情况下在角质细胞中代表性dna修复基因表达的表达变化(％)。图3c示出在来自全厚穿孔活检的表皮中代表性dna修复基因的昼夜模式。
图4示出真皮中示例性dna修复基因的代表性数据。图4a示出由于老化引起的表皮中的示例性基因的表达变化(％)(自20s的平均值的表达变化％)。图4b示出在体外用gse(0.01％)处理的情况下在成纤维细胞中代表性dna修复基因表达的表达变化(％)。图4c示出在来自全厚穿孔活检的表皮中代表性dna修复基因的昼夜模式。
具体实施方式
说明书中对“实施方案”或类似方法的引用意指与该实施方案结合描述的具体材料、特征、结构、和/或特性包括在至少一个实施方案、任选多个实施方案中，但这并不意味所有实施方案包括所描述的材料、特征、结构、和/或特性。此外，材料、特征、结构、和/或特性可以任何合适的方式结合在不同的实施方案中，并且材料、特征、结构、和/或特性可以省略或替换所描述的。因此，除非另外说明或声明不相容性，否则尽管未在组合中明确地例示，本文所述的实施方案和方面可包括其它实施方案和/或方面的元件或组件或者可与其它实施方案和/或方面的元件或组件组合。
除非另外具体地说明，否则所有成分百分比均按相应组合物的重量计。除非另外具体地说明，否则所有比率均为重量比。所有范围均包括端值在内并且可组合。有效数字的数表示既不表达对所示量的限制，也不表达对测量精确性的限制。所有数值应理解为被词“约”修饰，除非另外特别指明。除非另外指明，否则所有测量均被理解为是在大约25℃和环境条件下进行的，其中“环境条件”意指在约1个大气压和约50％的相对湿度下的条件。所有数值范围是包括端值在内的较窄范围；描述的范围上限和下限是可互换的，以形成未明确描述的其它范围。
本文中的转录谱可以包含与受试者基因标签中的基因(例如，以基因标识符和调控方向的形式)有关的数据以及本文所述的其它任选组分(例如，元数据)，基本上由其组成或者由其组成。如本文所用，“基本上由......组成”意指转录谱包括与仅仅来自受试者基因标签或基因表达谱的选择基因的转录有关的数据，但是还可以包括附加数据，只要该附加数据与不包括在受试者基因标签中的基因的转录无关，并且不实质上改变要求保护的组合物或方法的基本和新颖特征。如说明书和所附权利要求书中所用，除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该(所述)”旨在也包括复数形式。
本文公开的基因对应于2015年6月8日已知的其相应序列。
定义
“昼夜节律钟”意指调控细胞活性的约24小时的内源性周期。
“昼夜节律依赖性益处”意指与人类体皮肤组织的昼夜节律同步工作的对角质组织的益处(包括dna修复益处)。
“昼夜节律基因标签”意指来源于角质组织的昼夜节律模式的基因表达谱分析的基因标签。
“化妆剂”或“化妆品测试剂”意指旨在经擦涂、倾倒、喷洒、喷涂、导入或以其它方式施用于哺乳动物身体或其任意部位的任何物质及其任何组分。化妆剂可包含通常被美国食品及药品管理局承认安全(gras)的物质、食品添加剂和用于非化妆消费品(包括非处方药物)的材料。在一些实施方案中，化妆剂可掺入化妆品组合物中，该化妆品组合物包含适用于向皮肤局部施用的皮肤病学上可接受的载体。化妆品或可起化妆作用的材料的一些非限制性示例可以见于与美国国立卫生研究院有关的pubchem数据库；个人护理产品委员会的成分数据库；以及个人护理产品委员会出版的2010国际化妆品成分词典和手册，第13版；欧盟化妆品成分和物质列表；日本化妆品成分列表；个人护理产品委员会的skindeep数据库；fda批准的赋形剂列表；fdaotc列表；全球新产品数据库(gnpd)；以及来自化妆品成分和植物制剂的供应商。
“昼夜节律钟的黑暗周期”意指受试者睡眠的时间段。这通常是在夜间(不存在日光)。然而，对于某些受试者，黑暗周期可以在白天发生，例如夜间工作且白天睡觉的人。相反地，“光明周期”是昼夜节律钟的周期，在此期间受试者通常是清醒的。
“皮肤病学上可接受的”意指所述的组合物或组分适用于与人类皮肤组织接触。
“基因表达谱分析”和“基因表达谱分析实验”意指使用任何合适的谱分析技术测量在生物样本中多个基因的表达。例如，几千个基因的mrna表达可使用微阵列技术来测定。出现的其它可使用的技术包括rna-seq或利用nextgen测序技术的全转录组测序。
“基因标签”意指代表皮肤组织状况或对化妆剂的应答的基因的合理得到的列表或多个列表。在具体情况下，化妆剂可以是基准皮肤剂或潜在的皮肤剂。因此，基因标签可以充当皮肤组织的感兴趣的表型的代表。基因标签可以包含，相对于正常或对照状态，其表达增加(上调)、其表达降低(下调)及它们的组合的基因。一般来讲，修饰的细胞表型的基因标签可被描述为相对于细胞表型而言在修饰的细胞表型中差异表达的基因集。基因标签可以从包括但不限于体外测试、体内测试及它们的组合的各种数据来源得到。在一些实施方案中，基因标签可以包含代表感兴趣状况的多个上调基因的第一列表和代表感兴趣状况的多个下调基因的第二列表。
“内在老化基因标签”意指来源于内在老化皮肤状况的基因表达谱分析的基因标签。
“内在老化皮肤状况”意指全部或部分地来源于皮肤的年龄老化的皮肤老化状况。“内在老化的”皮肤因此是指已经按时间顺序老化并且已经实质上被保护而免于暴露于阳光和/或紫外线的皮肤。
“角质组织”意指设置为哺乳动物的最外层护盖的含角蛋白的层，其包括但不限于皮肤、毛发、指/趾甲、表皮、角、爪、喙和蹄。就皮肤而言，该术语是指真皮层、皮下层和表皮层中的一种或全部，其部分地包括角质组织。
“微阵列”意指核酸、寡核苷酸、蛋白质、小分子、大分子和/或它们的组合在底物上的任何有序阵列，其能够进行生物样本的基因表达谱分析。微阵列的一些非限制性示例可从affymetrix,inc.；agilenttechnologies,inc.；ilumina,inc.；gehealthcare,inc.；appliedbiosystems,inc.；以及beckmancoulter,inc.获得。
“光老化基因标签”意指来源于光老化皮肤状况的基因表达谱分析的基因标签。
“光老化皮肤状况”意指全部或部分地来源于暴露于日光和/或紫外线(例如，uvr、uva、uvb和/或uvc)的皮肤老化状况。“光老化”皮肤因此是指暴露于阳光和/或紫外线的皮肤。
“安全有效量”意指一定量的化合物或组合物，该量足以显著地引起积极的益处，优选积极的皮肤或感觉益处，以独立或组合的形式包括本文所公开的益处，但该量又足够低以避免严重的副作用，即在技术人员合理判断的范围内提供合理的效险比。
“皮肤”是指哺乳动物的最外侧的保护层，其由诸如角质细胞、成纤维细胞和黑素细胞的细胞组成。皮肤包括外侧的表皮层和下面的真皮层。皮肤还可包括通常与皮肤相关联的毛发和指/趾甲以及其它类型的细胞，诸如例如肌细胞、梅克尔细胞、朗格汉斯细胞、巨噬细胞、干细胞、皮脂腺细胞、神经细胞和脂肪细胞。
“皮肤老化”意指由基因的表达或抑制、环境因素(例如，阳光暴露、uva和/或uvb暴露、吸烟)、内在因素(例如，内源性自由基生成或细胞衰老)或它们之间的相互作用引起的人类皮肤组织状况，其生成细纹和/或皱纹、干燥的皮肤、发炎的皮肤、粗糙的皮肤、黄褐色的皮肤、毛细管扩张、下垂的皮肤、扩大的毛孔以及它们的组合。
“护肤”是指调节和/或改善皮肤状况。“护肤产品”的一些非限制示例包括护肤霜、保湿剂、洗剂和沐浴剂。“护肤组合物”意指调控和/或改善皮肤状况的组合物。
“局部施用”是指将本发明的组合物施用或铺展到角质组织的表面上。
现在已经发现了新基因标签，其可以用于鉴定或评价测试剂提供护肤益处的潜在功效。此外，本文提供了可用于筛检和生产与皮肤的昼夜节律同步工作以治疗老化皮肤的潜在化妆剂的新方法。这些新方法利用新发现的基因标签来鉴定或评价测试剂对皮肤的特定部分或皮肤细胞的类型提供靶向益处的潜在能力。因此，这些新方法允许鉴定或评价可以提供最大功效并允许改善护肤治疗的化妆剂。本文公开的感兴趣的基因及其子集可以用作鉴定可以对光老化和/或内在老化的皮肤的表皮层和/或真皮层提供昼夜节律依赖性dna修复益处的化妆剂的基因组。此外，这些独特的基因标签可以充当先前未鉴定出的与dna修复相关联的通路的指示物，并且因此可以提供鉴定新类别的化妆剂的机会。
基因表达可以以各种方式检测和/或测量。在某些实施方案中，该方法包括测量由基因标签中的一个或多个感兴趣基因编码的信使核糖核酸(“mdna”)。任选地，该方法可以包括反转录由这些基因中的一个或多个编码的mrna和测量对应的互补cdna(“cdna”)。在本文中可以使用任何合适的定量核酸测定。例如，可以使用常规定量杂交、northern印迹和聚合酶链反应过程来定量测量生物样本中mrna转录物或cdna的量。任选地，mrna或cdna在杂交前可以通过聚合酶链反应(pcr)扩增。mrna或cdna样本随后通过例如与由一个或多个基因板编码的mrna或cdna特异性的寡核苷酸杂交进行检查，所述基因任选地固定在基板(例如阵列或微阵列)上。生物标志物核酸与对生物标志物具有特异性的寡核苷酸探针的结合允许鉴定和定量生物标志物。定量基因表达的方法的合适示例公开在美国专利公布2012/0283112；美国申请序列号13/851,858、13/851,864、13/851,873和13/851,886；以及2012年8月15日mills等人提交的美国序列号13/966,418中。
基因表达谱分析的非限制性示例包括测量基因表达并比较基因表达测量结果与参考基因表达测量结果(例如，取自对照样本)的方法，该方法包括暴露测试细胞(例如，角质细胞和/或其它皮肤细胞)到诸如化妆品测试剂的测试剂。测试剂可以溶解在诸如二甲基亚砜(dmso)的合适载体中。任选地，可以使用通常与测试细胞是相同类型的细胞但仅暴露于载体(即，没有测试剂)的参考细胞作为对照。在暴露于测试剂和/或对照之后，从测试细胞和参考细胞中提取mrna。从细胞中提取的mrna可以任选地被反转录成cdna并用荧光染料标记(例如，如果要进行双色微阵列分析，则为红色和绿色)。在一些情况下，可以为单色微阵列分析准备cdna样本，并且如果需要，则可以处理多个重复样本。cdna样本可以与包含多个探针(例如，数十个、数百个或数千个探针)的微阵列共杂交。在一些实施方案中，微阵列上的每个探针具有独特的探针集标识符。微阵列用扫描仪进行扫描，该仪器激活染料并测量荧光量。计算装置分析原始图像以确定代表基因的表达水平的cdna存在量。扫描仪可以结合计算装置的功能。通常，由系统收集的基因表达数据可以包括：i)基因表达的上调(例如，与参考材料(例如，cdna)相比，测试材料(例如，cdna)与探针结合程度更大)，ii)基因表达的下调(例如，与测试材料(例如，cdna)相比，测试材料(例如，cdna)与探针的结合程度降低)，iii)非波动的基因表达(例如，与测试材料(例如，cdna)相比，测试材料(例如，cdna)与探针的结合程度类似)，和iv)没有可检测的信号或噪音。上调或下调的基因可以被称为“差异表达的。”差异表达的基因可以被进一步分析和/或在一起分组(例如，通过已知的统计方法)以鉴定代表特定皮肤状况或对化妆品测试剂的生物学应答的基因。
针对本文的方法开发的独特基因标签通过对感兴趣的皮肤老化状况的基因表达谱、人类皮肤组织的昼夜节律模式的基因表达谱和dna修复基因的生物信息学分析和比较来确定。用于生成感兴趣的独特基因标签的基因标签可以例如从来自皮肤的全厚皮肤活检或其它供体皮肤组织(例如，手术废物)生成，与对照相比，它们表现出感兴趣的皮肤老化状况。可以用于提供本发明公开的新筛检方法的基因标签可以涉及分析来自全部或部分的人类皮肤组织样本或来自从此类样本除去(诸如，通过激光捕获显微切割或物理细胞或细胞层去除或本领域已知的其它方式)的简单细胞类型的rna，该筛检方法用于鉴定对人类皮肤有效提供昼夜节律依赖性dna修复益处的测试剂。真皮层和表皮层可以被单独地或一起除去并分析。另外，可以使用细胞系来生成这样的基因表达谱和所得标签，诸如角质细胞系或成纤维细胞系。可以由这样的单个细胞、层或者由一(多)种人类皮肤组织样本的多个细胞、层、部分(或全部)生成谱。
用于皮肤老化的两种基因标签类型包括内在老化基因标签和光老化基因标签，其可以通过比较来自具有感兴趣的状况的皮肤的全厚皮肤活检的基因表达数据与对照而得到。下面的实施例2和3更详细地描述了得到这些基因标签的非限制性方法。一般来讲，对于光老化基因标签，可以从多个老年受试者的阳光暴露的皮肤(例如，前臂伸肌、脸颊、额头)和防晒皮肤(例如，臀部、腋下、上臂内侧、大腿内侧)取得活检。受试者的年龄可能不同，但一个年龄范围在约45岁至70岁之间。可以进行活检样本的基因表达谱分析，并从结果的统计分析中得到一个或多个光老化基因标签。在一些情况下，光老化基因标签可以通过比较老年个体(例如，45至80岁)的阳光暴露部位与年轻个体(例如，18至25岁)的阳光暴露部位得到。
一般来讲，对于内在老化基因标签，可以从多个老年受试者和年轻受试者的防晒皮肤(例如，臀部)取得活检。受试者的年龄可能不同，但老年受试者的一个年龄范围在约45岁至80岁之间，并且年轻受试者的一个年龄范围在18岁至25岁之间。可以进行活检样本的基因表达谱分析，并从微阵列结果的统计分析中得到一个或多个内在老化基因标签。在一些实施方案中，光老化基因标签可以通过比较老年个体(例如，45至80岁)的防晒部位与年轻个体(例如，18至25岁)的防晒部位得到。
一般来讲，对于人类皮肤组织的昼夜节律的基因标签，可以在四个时间点从健康志愿者身上取得活检：午夜12时、上午6时、中午12时和下午6时。受试者的年龄可能不同，但一个范围为20至74岁。另一范围为20至40岁。受试者可以是男性或女性。在一些实施方案中，昼夜节律基因标签可以通过比较四个时间点而得到。在其它实施方案中，活检可以从防晒部位获得，或者可以从阳光暴露部位获得。
基因标签也可以来源于用阳性对照皮肤试剂处理的成纤维细胞和/或角质细胞的基因表达谱分析，以表示引起用基准皮肤试剂处理的皮肤组织状况改善的细胞扰动，所述标签包括基准皮肤试剂在细胞中体外上调和下调的多个基因。作为一个例证示例，其中阳性对照剂是已知的皮肤抗衰老剂金丝提取物(“gse”)(inci名称：glycerin,hydrolyzedsilk.登记号56-81-5)的微阵列基因表达谱数据可以使用本发明方法分析。因此，可以得到响应于gse或任何其它对照剂或基准皮肤试剂的激发而强烈上调和强烈下调的基因的列表。所述基因列表(皮肤抗衰老的代表)可以与感兴趣的皮肤老化状况的基因表达谱和人类皮肤组织的昼夜节律模式的基因表达谱组合使用，以提供独特且新型的基因标签，该基因标签可以充当查询标签以筛检将提供最大功效并且允许治疗的优化的皮肤抗衰老剂。此外，这些独特的基因标签可以充当先前未鉴定出的与dna修复相关联的通路的指示物，并且因此可以提供鉴定新类别的化妆剂的机会。应当了解，在基因谱分析期间可以分析多个基因，但是重要的是认识到，只有在下面讨论的各种基因标签中鉴定的基因被选择用于本发明方法的转录谱中的进一步分析。
现在将描述皮肤筛检方法的各种实施方案的非限制性方面和实施例。在某些实施方案中，这些方法允许筛检与皮肤的昼夜节律同步工作的化妆剂。在更特定的实施方案中，这些方法允许筛检与皮肤的昼夜节律的黑暗周期同步工作的化妆剂。这些新方法还允许鉴定或评价化妆剂，所述化妆剂可以针对它们对皮肤老化状况的选择性治疗以及针对诸如角质细胞或成纤维细胞的特定皮肤细胞类型的特异性靶向来筛检。皮肤老化状况的示例包括通常是年龄依赖性的内在皮肤老化状况以及光老化皮肤状况，这些光老化皮肤状况是在皮肤暴露于uv辐射的情况下皮肤老化的形式。
在一些情况下，提供了鉴定或评价化妆品测试剂对人类皮肤提供昼夜节律依赖性dna修复益处的潜在效力的筛检方法。例如，该方法可以包括：(a)使皮肤组织样本(例如，全厚组织样本或其部分)与化妆品测试剂接触；(b)生成该皮肤组织样本的转录谱(“测试谱”)，其中该测试谱包含与选自下列的至少两个基因的转录有关的数据：apitd1、actr5、ap5z1、apex1、apex2、aplf、aptx、atxn3、bccip、brca1、c11orf30、cdc14b、chek1、cul4a、dclre1c、dtl、epc2、exo5、eya3、fam175a、fan1、fancc、fancf、fancg、fancl、fignl1、gadd45a、gtf2h1、h2afx、ints3、kiaa0430、kiaa0101、kin、mcm9、mdc1、mgme1、morf4l2、mre11a、msh2、mum1、neil1、neil3、nono、npm1、nsmce1、ogg1、parpbp、pif1、pml、pms1、pms2、pold1、pold2、pole、polk、polr2f、rad50、rad51b、rad51c、rad52、rbm14、recql5、rfc4、rfc5、rpa2、sfpq、sfr1、smarca5、smc4、smg1、swi5、ticrr、tp53bp1、tp73、ube2t、ube2w、usp28、usp47、wdr33和zfyve26；(c)将皮肤组织样本的转录谱与对照转录谱进行比较；以及(d)当相对于对照转录谱，皮肤组织样本的转录谱对应于直接指示对人类皮肤的昼夜节律依赖性dna修复益处的至少两个基因的调控(即，上调或下调)时，将化妆品测试剂鉴定为具有对人类皮肤提供昼夜节律依赖性dna修复益处的潜在效力。例如，如果测试转录谱和阳性对照转录谱(即，通过使测试样本与阳性对照接触生成的对照转录谱)一致，这意味着基因在各自转录谱中的表达沿相同方向调控，则可以将测试剂鉴定为表现出提供所述益处的潜在效力。
在前述实施例中，测试谱可以基本上由与选自基因标签的至少两个基因的转录有关的数据组成。也就是说，转录谱不包括与未列出的其它基因的转录有关的数据。
尽管上述实施例和下面的一些实施例利用阳性对照，但是应该了解，其中使用溶媒对照或阴性对照生成转录谱的实施方案也可以在本文中想到，并且通过比较测试转录谱与用溶媒或阴性对照生成的对照转录谱来确定测试剂是否具有对人类皮肤提供昼夜节律依赖性dna修复益处的潜在效力在普通技术人员的技术范围内。例如，如果测试转录谱和阴性对照转录谱(即，通过使测试样本与阴性对照接触生成的对照转录谱)一致，这意味着基因在各自转录谱中的表达沿通常相反的方向调控，则可以将测试剂鉴定为具有对人类皮肤提供昼夜节律依赖性dna修复益处的潜在效力。
在一些情况下，与化妆品测试剂接触的皮肤组织样本(第一皮肤组织样本)的转录谱可以和与对照剂接触的第二皮肤组织样本比较。在一个这样的实施方案中，当第一皮肤组织样本和第二皮肤组织样本的转录谱的比较指示直接对应于对人类皮肤的昼夜节律依赖性dna修复益处的选自基因标签中的一种的至少两个基因的调控时，化妆品测试剂可以被鉴定为对人类皮肤有效提供昼夜节律依赖性dna修复益处。
在一些情况下，可能期望选择基因标签，其中人类皮肤组织样本的转录谱包含与选自下列的至少两个基因的转录有关的数据：cul4a、eya3、fan1、nono、ogg1、pms2、rfc4、wdr33、kin、npm1、rad50、apex1、bccip、dtl、mgme1、nsmce1、pif1、polk、rad51c、sfr1、ube2w、zfyve26、chek1、gadd45a、msh2、parpbp、rfc5、smc4、ube2t、apitd1、chek1、kiaa0101、atxn3和brca1。在一个特别合适的实施例中，转录谱可以包含与选自h2afx、nsmce1、rad51c、ube2t和wdr33的至少两个基因的转录有关的数据。
在一些情况下，可能期望鉴定或评价化妆品测试剂对内在老化的人类皮肤提供昼夜节律依赖性dna修复益处的潜在效力。例如，该方法可以包括：(a)使皮肤组织样本与化妆品测试剂接触；(b)生成该皮肤组织样本的转录谱，其中该转录谱包含与选自下列的至少两个基因的转录有关的数据：apitd1、apex1、aptx、atxn3、brca1、c11orf30、cdc14b、chek1、dclre1c、dtl、epc2、exo5、eya3、fam175a、fancf、gadd45a、gtf2h1、h2afx、kiaa0101、kin、morf4l2、neil3、npm1、nsmce1、ogg1、parpbp、pif1、pml、pold2、rad50、rad51b、rad51c、rfc4、smarca5、smc4、tp53bp1、ube2t、ube2w和wdr33；(c)将皮肤组织样本的转录谱与对照转录谱进行比较；以及(d)当相对于对照转录谱，皮肤组织样本的转录谱对应于直接指示昼夜节律依赖性dna修复益处的基因的调控时，将化妆品测试剂鉴定为表现出对内在老化的人类皮肤提供所述益处的潜在效力。在该实施例中，可能期望生成转录谱，该转录谱包含与选自诸如aptx、c11orf30、fancf、h2afx、kiaa0101、kin、npm1、nsmce1、rad50、rad51c、smarca5、smc4、ube2t和wdr33的上述基因列表的亚集的至少两个基因的转录有关的数据。在该实施例中，可能更期望使用0.1％gse作为阳性对照并生成皮肤样本的转录谱，该转录谱包含与选自apitd1、chek1、kiaa0101、nsmce1、pif1、rad50、rad51c、atxn3、brca1、dtl、parpbp、rfc4、smc4、ube2t和wdr33的至少两个基因的转录有关的数据。在该实施例中，可能甚至更期望使用0.01％gse作为阳性对照并生成皮肤样本的转录谱，该转录谱包含与选自eya3、kin、npm1、rad50、rfc4和wrd33中的至少两个基因的转录有关的数据。在一些情况下，可能期望鉴定或评价化妆品测试剂对光老化的人类皮肤提供昼夜节律依赖性dna修复益处的潜在效力。例如，该方法可以包括：(a)使皮肤组织样本与化妆品测试剂接触；(b)生成该皮肤组织样本的转录谱，其中该转录谱包含与选自下列的至少两个基因的转录有关的数据：actr5、ap5z1、apex1、apex2、aplf、aptx、atxn3、bccip、brca1、c11orf30、cdc14b、chek1、cul4a、dtl、epc2、eya3、fam175a、fan1、fancc、fancf、fancg、fancl、fignl1、gadd45a、gtf2h1、h2afx、ints3、kiaa0430、kiaa0101、kin、mcm9、mdc1、mgme1、morf4l2、mre11a、msh2、mum1、neil1、neil3、nono、npm1、nsmce1、ogg1、parpbp、pif1、pms1、pms2、pold1、pold2、pole、polk、polr2f、rad50、rad51b、rad51c、rad52、rbm14、recql5、rfc4、rfc5、rpa2、sfpq、sfr1、smarca5、smc4、smg1、swi5、ticrr、tp53bp1、tp73、ube2t、ube2w、usp28、usp47、wdr33和zfyve26；(c)将皮肤组织样本的转录谱与对照转录谱进行比较；以及(d)当相对于对照转录谱，皮肤组织样本的转录谱对应于直接指示昼夜节律依赖性dna修复益处的基因的调控时，将化妆品测试剂鉴定为表现出对光老化的人类皮肤提供所述益处的潜在效力。在该实施例中，也可能期望使用0.01％gse作为阳性对照并生成转录谱，该转录谱包含与选自下列的至少两个基因的转录有关的数据：apex1、bccip、cul4a、dtl、eya3、fan1、mgme1、nono、nsmce1、ogg1、pif1、pms2、polk、rad50、rad51c、sfr1、ube2w、zfyve26、chek1、gadd45a、msh2、parpbp、rfc4、rfc5、rpa1、smc4、ube2t和wdr33。在该实施例中，可能特别期望使用0.1％gse作为阳性对照并生成转录谱，该转录谱包含与选自下列的至少两个基因的转录有关的数据：apex1、chek1、dtl、eya3、fan1、h2afx、morf4l2、msh2、nono、nsmce1、pold2、rad51c、rfc4、swi5、tp53bp1、ube2t、ube2w和wdr33。
在一些情况下，可能期望鉴定或评价化妆品测试剂对表皮和/或其中所见的细胞提供昼夜节律依赖性dna修复益处的潜在效力。例如，可以将全厚皮肤样本分成表皮层和真皮层，从而可以单独地分析表皮。除此之外或另选地，角质细胞可以根据本发明方法进行培养和测试。.在这样的实施方案中，该方法还包括：(a)使角质细胞的样本与化妆品测试剂接触；(b)生成该角质细胞样本的转录谱，其中该转录谱包含与选自下列的至少两个基因的转录有关的数据：aptx、c11orf30、cdc14b、chek1、epc2、eya3、fancf、gtf2h1、h2afx、kin、neil3、nsmce1、pif1、rad50、rad51c、smarca5、ube2t和wdr33；(c)将角质细胞样本的转录谱与对照转录谱进行比较；以及(d)当相对于对照转录谱，角质细胞样本的转录谱对应于直接指示昼夜节律依赖性dna修复益处的基因的调控时，将该测试剂鉴定为表现出对人类皮肤的表皮层提供所述益处的潜在效力。
在一些情况下，可能期望鉴定或评价化妆品测试剂对内在老化的人类皮肤的表皮层提供昼夜节律依赖性dna修复益处的潜在效力。例如，该方法可以包括：(a)使测试样本(例如，角质细胞或表皮组织)与化妆品测试剂接触；(b)生成该测试样本的转录谱，其中该转录谱包含与选自下列的至少两个基因的转录有关的数据：apitd1、aptx、c11orf30、cdc14b、chek1、dclre1c、epc2、exo5、eya3、fancf、gadd45a、gtf2h1、h2afx、kiaa0101、kin、neil3、npm1、nsmce1、pif1、rad50、rad51b、rad51c、smarca5、smc4、ube2t和wdr33；(c)将测试样本的转录谱与对照转录谱进行比较；以及(d)当相对于对照转录谱，测试样本的转录谱对应于直接指示昼夜节律依赖性dna修复益处的基因的调控时，将该化妆品测试剂鉴定为表现出对内在老化的人类皮肤的表皮层提供所述益处的潜在效力。在该实施例中，可能期望使用0.1％gse作为阳性对照并生成测试样本的转录谱，该转录谱包含与选自apitd1、chek1、kiaa0101、nsmce1、pif1、rad50和rad51c的至少两个基因的转录有关的数据。在该实施例中，可能更期望使用0.01％gse作为阳性对照并生成测试样本的转录谱，该转录谱包含与eya3的转录有关的数据。
在一些情况下，可能期望鉴定或评价化妆品测试剂对光老化的人类皮肤的表皮层提供昼夜节律依赖性dna修复益处的潜在效力。例如，该方法可以包括：(a)使测试样本(例如，角质细胞或表皮组织)与化妆品测试剂接触；(b)生成该测试样本的转录谱，其中该转录谱包含与选自下列的至少两个基因的转录有关的数据：actr5、ap5z1、apex1、aplf、atxn3、bccip、brca1、c11orf30、cdc14b、chek1、cul4a、dtl、epc2、eya3、fam175a、fan1、fancf、fancg、fancl、fignl1、gtf2h1、h2afx、ints3、kiaa0430、kin、mcm9、mdc1、mgme1、morf4l2、mre11a、msh2、mum1、neil1、neil3、nono、nsmce1、ogg1、pif1、pms1、pms2、pold1、pold2、pole、polk、rad50、rad51c、rad52、rbm14、recql5、rfc4、sfr1、smarca5、smg1、swi5、ticrr、tp53bp1、ube2t、ube2w、usp47、wdr33和zfyve26；(c)将测试样本的转录谱与对照转录谱进行比较；以及(d)当相对于对照转录谱，测试样本的转录谱对应于直接指示昼夜节律依赖性dna修复益处的基因的调控时，将化妆品测试剂鉴定为表现出对光老化的人类皮肤的表皮层提供所述益处的潜在效力。在该实施例中，可能期望使用阳性对照(例如，gse)并生成测试样本的转录谱，该转录谱包含与选自apex1、bccip、cul4a、dtl、eya3、fan1、mgme1、nono、nsmce1、ogg1、pif1、pms2、polk、rad50、rad51c、srf1、ube2w和zfyve26的至少两个基因的转录有关的数据。在该实施例中，可能更期望使用0.1％gse作为阳性对照并生成测试样本的转录谱，该转录谱包含与选自apex1、bccip、cul4a、dtl、fan1、mgme1、nsmce1、pif1、pms2、polk、rad50、rad51c、sfr1、ube2w和zfyve26的至少两个基因的转录有关的数据。在该实施例中，可能甚至更期望使用0.01％gse作为阳性对照并生成测试样本的转录谱，该转录谱包含与选自cul4a、eya3、fan1、nono、ogg1和pms2的至少两个基因的转录有关的数据。
在一些情况下，与化妆品测试剂接触的角质细胞的样本(第一角质细胞样本)的转录谱可以和与对照剂接触的第二角质细胞样本比较。在这样的实施方案中，当第一角质细胞样本和第二角质细胞样本的转录谱相对于彼此对应于直接指示昼夜节律依赖性dna修复益处的至少两个感兴趣的基因的调控时，化妆品测试剂可以被鉴定为表现出对内在老化的人类皮肤的表皮层提供所述益处的潜在效力。上述基因标签中公开的感兴趣的基因可适用于该实施例。另外，上述公开的感兴趣的基因可以充当先前未鉴定出的与dna修复相关联的通路的指示物，并且因此可以提供鉴定新类别的化妆剂的机会。
在一些情况下，本发明的筛检方法可以用于鉴定或评价化妆品测试剂对人类皮肤的真皮层提供昼夜节律依赖性dna修复益处的潜在效力。例如，该方法可以包括：(a)使测试样本(例如，成纤维细胞或真皮组织)与化妆品测试剂接触；(b)生成该测试样本的转录谱，其中该转录谱包含与选自下列的至少两个基因的转录有关的数据：apex1、aptx、atxn3、brca1、c11orf30、dtl、fam175a、fancf、h2afx、kiaa0101、kin、morf4l2、npm1、nsmce1、ogg1、parpbp、pml、pold2、rad50、rad51c、rfc4、smarca5、smc4、tp53bp1、ube2t、ube2w和wdr33；(c)将测试样本的转录谱与对照转录谱进行比较；以及(d)当相对于对照转录谱，测试样本的转录谱对应于直接指示昼夜节律依赖性dna修复益处的基因的调控时，将该化妆品测试剂鉴定为表现出对人类皮肤的真皮层提供所述益处的潜在效力。在该实施例中，可能期望生成测试样本的转录谱，该转录谱包含与选自apex1、aptx、dtl、h2afx、kiaa0101、morf4l2、nsmce1、parpbp、pold2、rad51c、rfc4、smc4、tp53bp1、ube2t、ube2w和wdr33的至少两个基因的转录有关的数据。
在一些情况下，可能期望鉴定或评价化妆品测试剂对内在老化的人类皮肤的真皮层提供昼夜节律依赖性dna修复益处的潜在效力。例如，该方法可以包括：(a)使成纤维细胞的样本与化妆品测试剂接触；(b)生成该成纤维细胞样本的转录谱，其中该转录谱包含与选自下列的至少两个基因的转录有关的数据：apex1、aptx、atxn3、brca1、c11orf30、dtl、fam175a、fancf、h2afx、kiaa0101、kin、morf4l2、npm1、nsmce1、ogg1、parpbp、pml、pold2、rad50、rad51c、rfc4、smarca5、smc4、tp53bp1、ube2t、ube2w和wdr33；(c)将成纤维细胞样本的转录谱与对照转录谱进行比较；以及(d)当相对于对照转录谱，成纤维细胞样本的转录谱对应于直接指示昼夜节律依赖性dna修复益处的基因的调控时，将该化妆品测试剂鉴定为表现出对内在老化的人类皮肤的真皮层提供所述益处的潜在效力。在该实施例中，可能期望生成测试样本的转录谱，该转录谱包含与选自atxn3、brac1、dtl、kin、npm1、parpbp、rad50、rad51c、rfc4、smc4、ube2t和wdr33的至少两个基因的转录有关的数据。在该实施例中，可能更期望使用0.1％gse作为阳性对照并生成测试样本的转录谱，该转录谱包含与选自atxn3、brca1、dtl、parpbp、rad51c、rfc4、smc4、ube2t和wdr33的至少两个基因的转录有关的数据。在该实施例中，可能甚至更期望使用0.01％gse作为阳性对照并生成测试样本的转录谱，该转录谱包含与选自kin、npm1、rad50、rfc4和wrd33的至少两个基因的转录有关的数据。
在一些情况下，可能期望鉴定或评价化妆品测试剂对光老化的人类皮肤的真皮层提供昼夜节律依赖性dna修复益处的潜在效力。该方法包括：(a)使成纤维细胞的样本与化妆品测试剂接触；(b)生成该成纤维细胞样本的转录谱，其中该转录谱包含与选自下列的至少两个基因的转录有关的数据：apex1、apex2、aptx、chek1、dtl、eya3、fan1、fancc、gadd45a、h2afx、kiaa0101、morf4l2、msh2、nono、npm1、nsmce1、parpbp、pold2、polr2f、rad51b、rad51c、rfc4、rfc5、rpa2、sfpq、smc4、swi5、tp53bp1、tp73、ube2t、ube2w、usp28和wdr33；(c)将成纤维细胞样本的转录谱与对照转录谱进行比较；以及(d)当相对于对照转录谱，成纤维细胞样本的转录谱对应于直接指示昼夜节律依赖性dna修复益处的基因的调控时，将该化妆品测试剂鉴定为表现出对光老化的人类皮肤的真皮层提供所述益处的潜在效力。在该实施例中，可能期望生成转录谱，该转录谱包含与选自chek1、dtl、fan1、gadd45a、msh2、parpbp、rad51c、rfc4、rfc5、rpa2、smc4、ube2t和wdr33的至少两个基因的转录有关的数据。在该实施例中，可能更期望使用0.1％gse作为阳性对照并生成成纤维细胞样本的转录谱，该转录谱包含与选自chek1、dtl、fan1、gadd45a、msh2、parpbp、rad51c、rfc5、rpa2、smc4、ube2t和wdr33的至少两个基因的转录有关的数据。在该实施例中，可能甚至更期望使用0.01％gse作为阳性对照并生成成纤维细胞样本的转录谱，该转录谱包含与rfc5和wdr33有关的数据。
在一些情况下，与化妆品测试剂接触的成纤维细胞的样本(第一成纤维细胞样本)的转录谱可以和与对照剂接触的第二成纤维细胞样本比较。在这样的实施方案中，当第一成纤维细胞样本和第二成纤维细胞样本的转录谱相对于彼此对应于直接指示昼夜节律依赖性dna修复益处的至少两个感兴趣的基因的调控时，化妆品测试剂可以被鉴定为表现出对人类皮肤的真皮层提供所述益处的潜在效力。上述基因标签中公开的感兴趣的基因可适用于该实施例。另外，上述公开的感兴趣的基因可以充当先前未鉴定出的与dna修复相关联的通路的指示物，并且因此可以提供鉴定新类别的化妆剂的机会。
还公开了对受试者的皮肤提供昼夜节律依赖性dna修复益处的方法。这些方法通常描述在受试者的昼夜节律周期的黑暗周期中施用包含有效量的金丝提取物的组合物。在某些实施方案中，该组合物还包含皮肤病学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物包含0.01重量％至约0.1重量％的金丝提取物。在特定的实施方案中，组合物包含约0.01％的金丝提取物。在其它特定的实施方案中，组合物包含约0.1％的金丝提取物。在一些实施方案中，组合物对于受试者的昼夜节律周期的整个黑暗周期施用。
一般来讲，由本发明公开的方法鉴定的化妆品测试剂可以根据本领域公知的化妆品组合物和配制参数来施用。治疗、施用、调控或改善的各种方法都可以利用包含根据本发明方法鉴定的皮肤活性剂的皮肤护理组合物。
由于期望向消费者提供各种化妆品皮肤抗衰老益处，将通过本文所述的一种或多种筛检方法鉴定的化妆品测试剂或化合物掺入适于局部施用于皮肤的化妆品组合物可能是有益的。即，可能期望将化妆品测试剂作为成分包含在化妆品组合物中。在某些实施方案中，化妆品组合物可以包含皮肤病学上可接受的载体、测试剂和通常包含在所提供的特定化妆品组合物中的类型的一种或多种任选成分。“皮肤病学上可接受的载体”意指如下载体，其适合局部施用于角质组织，具有良好的美学性质，与组合物中的成分相容，并且不引起任何不合理的安全或毒性问题。合适的载体可以包括水和/或与水混溶的溶剂。化妆品皮肤护理组合物可以包含约1重量％至约95重量％的水和/或与水混溶的溶剂。合适的与水混溶的溶剂包括一元醇、二元醇、多元醇、甘油、二醇、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、以及它们的混合物。当皮肤护理组合物以乳液的形式时，水和/或与水混溶的溶剂为通常与水相相关联的载体。
合适的载体还包括油。皮肤护理组合物可以包含约1重量％至约95重量％的一种或多种油。油可用于溶解、分散或携带不适用于水或水溶性溶剂的材料。合适的油包括有机硅、烃、酯、酰胺、醚、以及它们的混合物。所述油可为挥发性的或非挥发性的。
本发明的组合物可以包含多种其它成分，前提条件是它们不会不可接受地改变本发明的益处。当存在时，本发明的组合物可以包含按组合物的重量计约0.0001％至约50％、约0.001％至约20％、或另选地约0.01％至约10％的任选组分。本文所列的量仅用作指导，因为用于组合物中的任选组分的最佳量将取决于所选的具体的活性物质，这是由于它们的功效的确相差很大。因此，可用于本发明中的一些任选组分的量可在本文所列的范围之外。
当掺入组合物中时，任选的组分应该适用于与人类皮肤组织接触，而没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、变应性应答等等。本发明的组合物可以包含任选组分，诸如抗痤疮活性物质、脱屑活性物质、抗蜂窝炎剂、螯合剂、类黄酮、美黑活性物质、非维生素抗氧化剂和自由基清除剂、毛发生长调节剂、抗皱纹活性物质、抗萎缩活性物质、矿物、植物甾醇和/或植物激素、n-酰基氨基酸化合物、抗微生物或抗真菌活性物质、以及其它可用的皮肤护理活性物质，可以适用于本发明组合物中的护肤剂的非限制性示例描述于us2006/0275237、us2004/0175347和国际化妆品成分词典和手册，第十三版。
皮肤护理组合物一般可通过常规方法如本领域已知的制备组合物和局部组合物的方法进行制备。此类方法通常涉及在一个或多个步骤中将成分混合至相对均一的状态，可使用或不使用加热、冷却、施加真空等。通常，乳液通过首先将水相材料与脂肪相材料单独地混合，然后视情况合并两相以获得所期望的连续相来制备。优选制备这些组合物，以使活性材料的稳定性(物理稳定性、化学稳定性、光稳定性等)和/或递送最优化。
组合物可以以各种各样的产品形式，包括但不限于溶液、悬浊液、洗剂、面霜、凝胶、爽肤水、棒状产品、笔状产品、喷剂、气溶胶、油膏、液体清洗液和固体棒、香波和毛发调理剂、软膏、泡沫、粉末、摩丝、剃刮膏、湿巾、试纸、遮瑕膏、电子粉末遮瑕膏、伤口敷料和粘性绷带、水凝胶、成膜产品、面部和皮肤面膜(有或没有不溶解的片)，诸如基础粉底、眼线和眼影的化妆品等等。组合物可以提供在尺寸被设定为储存用于一个治疗周期的足够量的组合物的包装中。包装的尺寸、形状和设计可以广泛地变化。某些包装示例描述于美国专利d570,707、d391,162、d516,436、d535,191、d542,660、d547,193、d547,661、d558,591、d563,221、2009/0017080、2007/0205226和2007/0040306中。
下面提供本文描述的方法的各个方面的非限制性实施例。实施例仅以说明性目的给出，并且不可解释为是对本发明的限制，因为其许多变型是可行的。
实施例1
测试潜在化妆品测试剂
个别实验(称为批次)通常包括使用affymetrix
人类调聚角质细胞(tkc)获自universityoftexas,southwesternmedicalcenter,dallas,tex。使tkc细胞在胶原i涂覆的细胞培养瓶和平板(bectondickinson,franklinlakes,n.j.)上具有1×人类角质细胞生长补充物(invitrogen,carlsbad,calif.)的
作为一个非限制性示例，将所有细胞在37℃下在具有5％co2的潮湿培养箱中温育。在t＝-24小时时，从t-75烧瓶中将细胞胰蛋白酶化，并且将其放置于基底生长培养基中的6孔板中。在t＝0时，移除培养基，并且根据实验设计，用适当的投配溶液替代。在前一天，在无菌4mlfalcon按扣盖试管中制备投配溶液。可以以1-200μm的浓度制备纯测试材料，并且可以以投配溶液的0.001重量％至1重量％的浓度制备植物提取物。在某些实施方案中，使用浓度为约0.01％至约0.1％的gse(金丝提取物)作为对照测试剂。在具体的实施方案中，gse以约0.01％使用，而在其它特定的实施方案中，gse以约0.1％使用。在化学暴露6至24小时之后，观察细胞并成像。在细胞裂解和rna分离之前用显微镜法检查孔以评价毒性的形态学证据。如果形态变化足以提出细胞毒性，则测试较低浓度的测试剂。细胞然后用包含β-巯基乙醇(qiagen,valencia,calif.)的350ul/孔的rlt缓冲液溶解，转移到96孔板中，并且在-20℃下储存。
来自细胞培养批次的rna使用
实施例2
得到光老化基因标签
进行临床调查研究，以获得用于探索与日光介导的皮肤老化(光老化)相关联的基因表达模式的活检标本。基线基因表达模式在来自年轻妇女和老年妇女的防晒皮肤和日光暴露皮肤中检查以检查与光老化相关联的基因表达谱。从每位女性志愿者(年龄20至74岁)的防晒身体部分(臀部)和日光暴露身体部位(前臂和面部)取得总共3个全厚皮肤活检(-4mm)。20至74岁的每十岁有大约25个受试者。老年妇女被选为中度至重度前臂光损坏。将活检在液氮中快速冷冻，并保存在-80℃下，直到rna分离。
从全厚活检或激光捕获显微切割的皮肤样本中提取rna。在某些样本中，将冷冻的皮肤活检组织在trizol(invitrogen)中匀化，并使用由invitrogen提供的方案提取rna。由于组织样本来自全厚活检，所以从全厚皮肤样本内的各种细胞类型中提取rna，这些细胞类型包括角质细胞、成纤维细胞、黑素细胞、内皮细胞、周细胞、神经、平滑肌、皮脂细胞、脂肪细胞和免疫细胞)。使用rneasy离心柱(qiagen)进一步纯化rna。在其它样本中，使用激光捕获显微切割从组织切片中分离细胞亚群。例如，激光捕获显微切割可以用于分离皮肤的表皮层或真皮层。收集活检样本和切割、分选和/或染色样本的方法的合适的非限制性示例更全面地描述在2013年3月15日由osoria等人提交的美国临时申请61/798,208中。在这一示例中，切片活检样本的表皮层和真皮层用palmmicrobeamivtm品牌激光捕获显微切割(“lcm”)系统(购自carlzeissmicroimaginggmgh,germany)根据制造商的说明书分离。当然，应该了解，可以使用从本领域已知的组织样本中提取rna的任何合适的手段。
使用nanodrop分光光度计(thermoscientific,waltham,mass.)定量rna，并使用agilent(santaclara,calif.)2100bioanalyzer确认质量。使用enzobioarray标记程序(enzolifesciences,farmingdale,n.y.)和提供的方案将总rna转化为genechip靶标。所有生物素标记的genechip靶标与affymetrixhumangenomehg-u133plus2.0genechips杂交过夜，然后将其洗涤，染色和使用affymetrix提供的方案扫描。当然，应该了解，可以使用从本领域已知的组织样本中定量并量化rna的任何合适的手段。
可以在affymetrixhg-u133plus2.0genechips上分析样本，其含有与超过20,000个基因的转录物互补的54,613个探针集。然而，在使用的所提供的数据库中的实例来源于使用包含22,214个探针集的affymetrixhg-u133a2.0genechips的基因表达谱分析实验，其为在plus2.0genechip上存在的那些探针集的子集。因此，在由临床数据开发基因标签时，探针集对于hg-u133a2.0基因芯片中包含的那些过滤。另选地，提取的rna在genetitanu219品牌微阵列上运行以鉴定表达的基因。在同一天使用相同制造批次的基因芯片处理前臂样本和臀部样本。
通常使用以下选择过程，对微阵列数据进行统计学分析以得到包含上调基因和下调基因的多个光老化基因标签。
基于absent/margin/presentcalls进行过滤。
该过滤器创建了包含在基因标签中的潜在基因列表。例如，合适的过滤器可以是一个治疗组中的至少50％的样本必须具有针对每个探针集的presentcalls。presentcalls来源于处理原始基因芯片数据并提供证据表明基因转录物与在生物样本中实际表达的探针集互补。所有样本中不存在的探针很可能只是噪声测量结果。这一步骤对于过滤出不会对标签提供显著性的数据的探针集。对于光老化基因标签和内在老化基因标签，对数据进行过滤以获得具有由affymetrixmas5软件提供的至少10％presentcalls的探针集。
根据统计量度过滤。
例如，合适的统计量度可以是来自t检验、anova、相关系数或其它基于模型的分析的p值。作为一个示例，可以选择p值作为统计量度，并且可以选择p＝0.05的截止值。将标签列表限制到与适当的对照相比具有统计学显著性的一些合理截止值的基因对于允许选择表征感兴趣的生物状态的基因是重要的。优选使用倍数变化值，因为倍数变化值没有考虑测量周围的噪音。使用t统计量来选择标签中的探针集，因为它是被标出的，并且提供了基因表达变化的方向性(即，上调或下调)以及统计显著性的指示。
分选探针集。
所有的探针集使用统计量度被分选到上调集和下调集。例如，如果使用t检验来计算p值，则使用t统计量的值(正值和负值)以分选列表，因为p值总是正值。分选的t统计量将具有最显著的p值的集放置在列表的顶部和底部，而将非显著的p值放置在靠近中间。
创建基因标签。
使用所创建的经过滤并分选的列表，从顶部和底部选择适当数量的探针集以创建基因标签，该基因标签优选具有大致相同数量的从顶部选择的集和从底部选择的集。例如，所创建的基因标签可以具有对应于芯片上的探针集的至少约10、50、100、200或300个和/或少于约800、600或约400个基因。探针集的数量大致对应于基因的数量，但是单个基因可以由多于一个探针集表示。应该理解，本文使用的词语“基因的数量”通常对应于词语“探针集的数量”。
实施例3
得到内在老化基因标签
进行临床调查研究，以获得用于探索与按时间顺序(内在)皮肤老化相关联的基因表达模式的活检标本。基线基因表达模式在来自年轻妇女和老年妇女的防晒皮肤中检查以检查与内在老化相关联的基因表达谱。从每位女性志愿者(年龄20至74岁)的防晒身体部分(臀部)取得总共3个全厚皮肤活检(-4mm)。20至74岁的每十岁有大约25个受试者。将活检在液氮中快速冷冻，并保存在-80℃下，直到rna分离。使用通常与实施例2中所述大致相同的分选方法，提取，纯化，定量和量化，并分析rna。类似于实施例2，对微阵列数据进行统计学分析以得到内在老化基因标签。
实施例4
开发昼夜节律基因标签
进行临床调查研究，以获得用于探索与确立健康人类皮肤在24小时段上的昼夜转录组相关联的基因表达模式的活检标本。活检取自20名21至55岁的i-iii型fitzpatrick皮肤且具有正常睡眠模式的健康男性受试者。从以6小时间隔取得的全厚2mm前臂穿孔活检的表皮和真皮隔室中分离总rna：午夜12时、上午6时、中午12时和下午6时。同样以6小时间隔收集外周血和皮肤的器械量度，并且每3小时收集一次唾液样本。所呈现的基因表达数据仅来自表皮。将活检在液氮中快速冷冻，并保存在-80℃下，直到rna分离。使用通常与实施例2中所述大致相同的分选方法，提取，纯化，定量和量化，并分析rna。类似于实施例2，对微阵列数据进行统计学分析以得到内在老化基因标签。通过anova模型评价显著性，而不用以日平均值的百分比变化截取每个样本的归一化表达值。
实施例5
dna修复主题和网络分析
使用主题分析作为工具来更好地理解光老化、内在老化和昼夜节律研究以及dna修复(dna修复过程)的联系和结果。主题分析的方法的一个合适的非限制性示例更全面地描述在2012年2月22日由binder等人提交的美国公布20120283112中。简而言之，该方法使用由geneontology(go)consortium开发的受控词汇术语的本体，该本体描述与基因产物相关联的生物过程、分子功能和细胞组分。分析包括调控的基因列表和所有表达基因的更大列表的统计学比较，以确定注释为特定go术语的基因是否在调控列表中显著富集。这种分析可以使用themeextractor专有软件和计算每个本体术语的p值的算法来执行。在这种情况下，术语涉及dna修复和/或dna修复过程。另外，对于昼夜节律基因标签，主题分析可以通过数据库进行以注释、可视化和综合发现基因，这些基因在每个时间点都以上调或下调的形式显著地区别于日平均值(p值<0.01和0.05)。当针对基因的多个探针集具有小于阈值的p值时，通过探针集的量和表达值选择代表性单个探针集。当假发现率(fdr)在某个时间点低于10％时，鉴定出过多的生物过程。对于昼夜节律的网络分析，与dna修复过程相关联。
本发明公开的筛检方法的各种实施方案列举了各种基因分组，这些基因分组在包括表皮层和真皮层的人类皮肤组织中显示显著的负年龄相关性(表达随年龄而降低，p值<0.01)，显示感兴趣的昼夜节律(与日平均值相比，表达在午夜或清晨显著升高，p值<0.05；或者与日平均值相比，表达在中午显著降低(p值小于0.05；在午夜和清晨均升高)；且显示强烈的昼夜模式(在昼夜研究中，根据单向anova检验，p值小于0.05)。在不同分组中列出的基因的序列是在2015年6月8日由家生物技术信息中心(“ncbi”)提供的
本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个这样的量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
除非明确排除或以其它方式限制，本文中引用的每一篇文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本申请对其要求优先权或其权益的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。任何文献的引用不是对其相对于任何本发明所公开的或本文受权利要求书保护的现有技术的认可，或不是对其单独地或以与任何其它参考文献或多个参考文献的组合提出、建议或公开了任何此类发明的认可。此外，如果此文献中术语的任何含义或定义与以引用方式并入本文的文献中相同术语的任何含义或定义相冲突，将以此文献中赋予该术语的含义或定义为准。
虽然已经举例说明和描述了本发明的特定实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出各种其它变化和修改。因此，本文旨在于所附权利要求中涵盖属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
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