本发明涉及培养细胞的分化促进方法以及培养细胞分化促进剂。
背景技术：
近年来，利用ES细胞、iPS细胞等万能细胞、干细胞及间充质干细胞的再生医疗备受瞩目。万能细胞、干细胞即没有进行分化的未分化状态的细胞。在再生医学中，使这些未分化状态的细胞分化成目标的脏器、组织、细胞，使用得到的脏器、组织、细胞对患者进行治疗。例如，从患者的皮下的脂肪组织提取的脂肪干细胞能够通过分化诱导培养而使其经由前脂肪细胞分化为脂肪细胞，或使其向骨细胞、软骨细胞进行分化。实现了使用那样的干细胞的整形外科治疗、美容行为。此外，通过从皮肤取出表皮的基底细胞、棘细胞并对其进行分化诱导培养，从而使其分化为颗粒细胞、角质细胞而制作表皮层并应用于治疗。例如，对通过作为外科美容手术的皮下脂肪抽吸而回收的脂肪组织中所包含的脂肪干细胞进行分化诱导培养而用于肥胖治疗的目的(专利文献1)、骨治疗的目的(专利文献2)。
如上所述，干细胞的利用和实用化日益推进，但干细胞的分化培养需要几周的长时间，存在实用化的问题。
此外，在上述的分化诱导操作中，作为培养容器，通常通用实施了亲水化处理的聚苯乙烯制的皿、烧瓶等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2014-520531号公报(WO2013/003595A1)；
专利文献2：日本特表2012-525377号公报(US20120020937A1)。
技术实现要素：
发明要解决的问题
本发明是鉴于这样的现有技术的实际情况而完成的，目的在于提供可以进一步促进培养细胞的分化的方法以及培养细胞分化促进剂。
用于解决问题的方案
本发明人为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现，当使作为分化的对象的细胞一边与降冰片烯系加成聚合物接触一边进行培养时，作为分化标记的mRNA增加，从而完成了本发明。
像这样，根据本发明，可提供下述(1)、(2)的培养细胞的分化促进方法以及(3)的培养细胞分化促进剂。
(1)一种培养细胞的分化促进方法，其特征在于，使降冰片烯系加成聚合物成型体与被培养的细胞接触。
(2)根据(1)所述的培养细胞的分化促进方法，其中，被培养的细胞是干细胞。
(3)一种培养细胞分化促进剂，由降冰片烯系加成聚合物成型体形成。
发明效果
根据本发明可提供可以进一步促进培养细胞的分化的方法以及优选使用于上述方法的培养细胞分化促进剂。
附图说明
图1是表示PPARγ表达量的图表。
图2是表示在本发明的皿中培养的分化细胞的电子显微镜照片。
图3是表示在比较例的皿中培养的细胞的电子显微镜照片。
具体实施方式
本发明为培养细胞的分化促进方法，其特征在于使降冰片烯系加成聚合物成型体与被培养的细胞接触。
本发明中使用的细胞只要是能够分化的细胞则没有特别限制。作为能够分化的细胞，可举出：胚性干细胞；分化多能性干细胞；骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞等以间充质干细胞为首的各种干细胞；各种前细胞；由外胚层、中胚层、内胚层分化的细胞而非最终分化状态的细胞等。其中，作为优选的例子可举出从皮下脂肪组织得到的脂肪干细胞。脂肪干细胞能够以从皮下脂肪回收的脂肪组织为基础，通过离心处理操作等而得到。
在培养细胞时通常使用液体培养基。
作为液体培养基，通常可以使用具有pH缓冲作用、对细胞的渗透压合适、包含细胞的营养成分并且对细胞没有毒性的液体培养基。
作为对液体培养基赋予pH缓冲作用的成分，可举出三羟甲基氨基甲烷(Tris)盐酸盐、各种磷酸盐、各种碳酸盐等。
液体培养基的渗透压调节通常可以使用调节了钾离子、钠离子、钙离子、葡萄糖等的浓度的水溶液而进行，以使其与细胞渗透压大致相同。
作为这样的水溶液，可举出磷酸缓冲生理盐水、Tris缓冲生理盐水、HEPES缓冲生理盐水等生理盐水；乳酸林格氏液、醋酸林格氏液、碳酸氢林格氏液等林格氏液等。
作为细胞的营养成分，可举出氨基酸、核酸、维生素类、矿物质类等。
作为液体培养基，能够利用RPMI-1640、HAM、α-MEM、DMEM、EMEM、F-12、F-10、M-199等各种市售品。
液体培养基中也能够配合添加剂。作为添加剂，可举出：蛋白质等的诱导因子、具有分化诱导活性的低分子化合物、矿物质、金属、维他命成分等。这些中，优选配合用于分化诱导的添加剂。
作为用于分化诱导的添加剂，可举出：作用于细胞表面的受体的配体、激动剂、拮抗剂；作用于核内受体的配体、激动剂、拮抗剂；胶原蛋白、纤连蛋白等细胞外基质；细胞外基质的一部分或模拟细胞外基质的化合物；作用于与细胞内信息传导通路相关的蛋白质的成分；作用于细胞内的初级代谢或次级代谢的酶的成分；影响细胞内的核内或线粒体内的基因的表达的成分；能够与病毒载体等组合而导入细胞内的DNA、RNA等。
这些添加剂能够单独使用一种或组合两种以上使用。
当然，也可以使用包含这些添加剂的市售的干细胞用的各种分化培养基。
细胞的培养条件没有特别限定，能够根据使用的细胞、目的而适当确定。例如，能够使用固定维持在二氧化碳浓度为5％左右、温度为20℃～37℃的范围的、经加湿的恒温器来培养细胞。
本发明中使用的降冰片烯系加成聚合物成型体是将降冰片烯系加成聚合物成型为任意形状而成的。
降冰片烯系加成聚合物为将降冰片烯系单体加成聚合而得到的聚合物，具体而言可举出降冰片烯系单体的加成聚合物和降冰片烯单体与能够与其共聚的其它单体的加成聚合物等。
作为降冰片烯系单体，可举出：双环[2.2.1]庚-2-烯(常用名：降冰片烯)、5-甲基-双环[2.2.1]庚-2-烯、5,5-二甲基-双环[2.2.1]庚-2-烯、5-乙基-双环[2.2.1]庚-2-烯、5-乙叉基-双环[2.2.1]庚-2-烯、5-乙烯基-双环[2.2.1]庚-2-烯、5-丙烯基双环[2.2.1]庚-2-烯、5-甲氧羰基-双环[2.2.1]庚-2-烯、5-氰基双环[2.2.1]庚-2-烯、5-甲基-5-甲氧羰基-双环[2.2.1]庚-2-烯等2环式单体；三环[4.3.01,6.12,5]癸-3,7-二烯(常用名：二环戊二烯)、2-甲基二环戊二烯、2,3-二甲基二环戊二烯、2,3-二羟基二环戊二烯等3环式单体；四环[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯(四环十二碳烯)、四环[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、8-甲基四环[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、8-乙基四环[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、8-乙叉基四环[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、8,9-二甲基四环[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、8-乙基-9-甲基四环[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、8-乙叉基-9-甲基四环[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、8-甲基-8-羧甲基四环[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二碳烯、7,8-苯并三环[4.3.0.12,5]癸-3-烯(常用名：桥亚甲基四氢芴(methanotetrohydr ofluorene)：也称为1,4-桥亚甲基-1,4,4a,9a-四氢芴)、1,4-桥亚甲基-8-甲基-1,4,4a,9a-四氢芴、1,4-桥亚甲基-8-氯-1,4,4a,9a-四氢芴、1,4-桥亚甲基-8-溴-1,4,4a,9a-四氢芴等4环式单体等。
作为能够与降冰片烯系单体加成共聚的其它单体，可举出乙烯、丙烯、1-丁烯、1-戊烯、1-己烯等碳原子数为2～20的α-烯烃系单体；环丁烯、环戊烯、环己烯、环辛烯、四环[9.2.1.02,10.03,8]十四碳-3,5,7,12-四烯(也称为3a,5,6,7a-四氢-4,7-桥亚甲基-1H-茚)等环烯烃系单体；1,4-己二烯、4-甲基-1,4-己二烯、5-甲基-1,4-己二烯、1,7-辛二烯等非共轭二烯烃系单体等。这些中，优选α-烯烃系单体，更优选乙烯。
这些单体也可以具有1种或2种以上的取代基。作为取代基，可举出烷基、亚烷基、芳基、甲硅烷基、烷氧基羰基、烷叉基等。
降冰片烯系单体的加成聚合物、或降冰片烯系单体与能够与其共聚的其它单体的加成聚合物可以在公知的加成聚合催化剂的存在下对单体成分进行聚合而得到。
作为加成聚合催化剂，能够使用例如由钛、锆或钒化合物和有机铝化合物形成的现有公知的加成聚合催化剂。
从成型体的强度的观点出发，本发明中使用的降冰片烯系加成聚合物在135℃的十氢萘中所测定的极限粘度[η]通常为0.01～20dl/g，优选为0.03～10dl/g，进一步优选为0.05～5dl/g，从成型性的观点出发，根据ASTM D1238在260℃、负载2.16kg的条件下测定的熔体流动指数(MFR)通常为0.2～200g/10分钟，优选为1～100g/10分钟，进一步优选为5～50g/10分钟。
降冰片烯系加成聚合物的玻璃化转变温度只要根据使用目的适当选择即可，通常为50～300℃，优选为70～280℃，特别优选为70～250℃，进一步优选为80～200℃。当玻璃化转变温度为该范围内时，耐热性与成型加工性高度平衡，因此优选。
在本发明中，玻璃化转变温度基于JIS K 7121进行测定。
从成型性的观点出发，降冰片烯系加成聚合物的软化点以用热机械分析仪测定的软化点(TMA)计，通常为30℃以上，优选为70℃以上，进一步优选为80～260℃。从透明性、成型体的尺寸控制性的观点出发，降冰片烯系加成聚合物的通过X射线衍射法而测定的结晶度通常为20％以下，优选为10％以下，进一步优选为2％以下。
这些降冰片烯系加成聚合物能够各自单独使用或组合2种以上使用。
此外，在降冰片烯系加成聚合物中能够以通常采用量添加通常用于热增塑剂树脂材料的配合剂，例如，软质聚合物、抗氧化剂、紫外线吸收剂、光稳定剂、近红外线吸收剂、脱模剂、染料或颜料等着色剂、增塑剂、防静电剂、荧光增白剂等配合剂。
此外，在降冰片烯系加成聚合物中也可以混合除软质聚合物以外的其它聚合物(以下，简称为“其它聚合物”)。相对于100重量份的降冰片烯系加成聚合物，混合在降冰片烯系加成聚合物中的其它聚合物的量通常为200重量份以下，优选为150重量份以下，更优选为100重量份以下。
对降冰片烯系加成聚合物配合的各种配合剂、其它聚合物的比例过多时，细胞的分化促进性会降低，因此优选均在不损害降冰片烯系加成聚合物的性质的范围进行配合。
与配合剂、其它聚合物的混合方法只要是在聚合物中充分分散配合剂的方法则没有特别限定。此外，配合的顺序没有特别限制。作为混合方法，可举出例如：使用混合机、一轴混炼机、双轴混炼机、辊式混炼机、布拉本德混炼机、挤出机等将树脂在熔融状态下混炼的方法；在适当的溶剂中溶解使其分散后，通过凝固法、浇铸法或直接干燥法而除去溶剂的方法等。
在使用双轴混炼机的情况下，多以如下方式使用：在混炼后，通常以熔融状态挤出为棒状，用线料切粒机切成适当的长度，使其颗粒化。
降冰片烯系加成聚合物的成型方法能够根据与细胞接触时使用的降冰片烯系加成聚合物成型体的形状而任意选择。作为成型方法，可举出例如注塑成型法、挤出成型法、浇铸成型法、吹胀成型法、吹塑成型法、真空成型法、压制成型法、压缩成型法、旋转成型法、calender成型法、压延成型法、切削成型法、纺丝等，也能够组合这些成型法或在成型后根据需要进行拉伸等后处理。
这样进行而得到的成型体是本发明的培养细胞分化促进剂。
本发明中使用的降冰片烯系加成聚合物成型体只要至少细胞接触的面由降冰片烯系加成聚合物成型体形成即可，可以不是整体由含脂环结构的聚合物形成的成型体。
降冰片烯系加成聚合物成型体的形状没有特别限制，可以是板状、粉状、粒状、绳状、片状、其它任何的形状。此外，其表面可以平坦，也可以具有凹凸形状，还可以是中空状的成型体。此外，也能够使不同形状的成型体经由或不经由粘结剂进行组合而制成其它成型体。
此外，只要能够与细胞接触则可以是构成下述的一部分或全部的构件：皿、板、袋、管、支架、杯、发酵缸等培养容器；搅拌翼、搅拌子、挡板、连接管等培养装置的零件；移液管、搅拌子、滤器、细胞刮刀等培养操作中使用的培养器具等。
在本发明的方法中，培养中的细胞不论是粘附型细胞还是悬浮细胞，都有在培养基中以悬浮状态生存的倾向。因此，降冰片烯系加成聚合物成型体与细胞接触的方法的选择面广。
在本发明中，在使成型体与培养细胞接触时，优选对成型体进行灭菌处理。灭菌处理的方法没有特别限定，能够根据成型体的形状、使用的细胞从高压蒸汽法、干热法等加热法；辐照γ射线、电子束等放射线的放射线法、辐照高频波的辐照法；接触环氧乙烯气体(EOG)等气体的气体法；使用灭菌滤器的过滤法等在医疗领域通常采用的方法中进行选择。
此外，也能够对这些成型体表面进行等离子体处理、电晕放电处理、臭氧处理、紫外线照射处理等对培养容器通常实施的除灭菌目的以外的处理。
使培养细胞与本发明的作为培养细胞分化促进剂的降冰片烯系加成聚合物成型体接触的方法只要根据培养细胞分化促进剂的形状采用任意的方法即可。可举出例如：在混合了作为细胞分化促进剂的降冰片烯系加成聚合物成型体的培养基中培养细胞的方法；在使用降冰片烯系加成聚合物而成型的培养容器内培养细胞的方法；将使用降冰片烯系加成聚合物而成型的培养器具用于进行培养操作的方法等，也能够组合这些方法。
另外，由于细胞有信息传输能力，因此不需要培养中的全部的培养细胞接触降冰片烯系加成聚合物成型体，此外，也不需要在整个培养期间使两者接触。但是，由于接触所带来的效果随时间降低，因此优选接触时间长。
培养细胞与降冰片烯系加成聚合物成型体的接触温度只要是细胞能够增殖的温度则没有特别限制。
实施例
以下，举出实施例对本发明具体地说明，但是本发明并不限定于这些实施例。
[制造例1]
使用三井化学公司制“APEL(注册商标)APL6013T”和Polyplastics公司制“TOPAS(注册商标)6013”作为降冰片烯系加成聚合物，通过注塑成型，成型了底面直径为3cm的培养用皿(以下各自称为“TOPAS制皿”以及“APEL制皿”)后，通过使用EOG(环氧乙烷气体)的气体法，进行了TOPAS制皿以及APEL制皿的灭菌处理。
[实施例1]
使用含有DMEM/Ham’s F-12(1∶1、v/v)、缓冲剂(HEPES；4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、胎牛血清、青霉素、链霉素以及两性霉素B的脂肪干细胞用的培养基(pH7.4)，在TOPAS制皿以及APEL制皿中以1×104cells/cm2的细胞密度各自接种脂肪干细胞(ZENBIO公司制造)，在CO2培养箱内培养10天。以下，将该TOPAS制皿中培养的试样称为“TOPAS制皿前培养试样”，将APEL制皿中培养的试样称为“APEL制皿前培养试样”。
[比较例1]
在实施例1中，代替TOPAS制皿或APEL制皿而使用Corning公司制造的细胞培养用皿[Falcon(注册商标)(型号为353001)](以下称为“聚苯乙烯制皿”)，除此之外，与实施例1同样地进行10天的细胞培养。以下，将该试样称为“聚苯乙烯制皿培养试样”。
[比较例2]
使用与比较例1同样的培养基，在聚苯乙烯制皿中以1×104cells/cm2的细胞密度接种脂肪干细胞(ZENBIO公司制造)，在CO2培养箱内培养3天后，除去全部培养基，代之以添加含有DMEM/Ham’s F-12(1∶1、v/v)、缓冲剂(HEPES)、胎牛血清、青霉素、链霉素、两性霉素B、生物素、泛酸盐、人胰岛素、地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤、PPARγ激动剂的向脂肪细胞的分化培养培养基，在CO2培养箱内进一步培养7天。以下，将该试样称为“聚苯乙烯制皿分化培养试样”。
[细胞的分化状态的评价]
在实施例1和比较例1中，为了评价细胞的分化状态，如下进行细胞内表达的分化标记的分析。作为分化标记，将作为脂肪细胞的分化调节基因的PPARγ设为指标。
经过培养期后，从各试样中回收细胞，通过以下的方式利用Real Time PCR法定量包含在细胞内的PPARγmRNA的量。作为内部标准，使用GAPDH的mRNA。
从细胞提取RNA是使用Cell Amp Direct Prep Kit for RT-PCR(Real Time)(Takara Bio公司制造)而进行的，将该提取试样作为模板试样，使用Cell Amp Direct RNA Prep Kit for One Step RT-PCR(Real Time)(Takar a Bio公司制造)作为Real Time PCR反应试剂，在PCR-CFX96(Bio Rad公司制造)系统中进行PCR反应。
PPARγmRNA的表达量(以GAPDH mRNA表达量补正)的测定结果如图1所示。示出了相对于比较例1的聚苯乙烯制皿培养试样中的PPARγ的表达量，实施例1的TOPAS制皿培养试样中的PPARγ的表达量及APEL制皿培养试样中的PPARγ的表达量、以及比较例2的聚苯乙烯制皿分化培养试样的相对值。
可知：作为向脂肪细胞的分化标记的PPARγ，与在聚苯乙烯制的培养容器中的表达相比，在TOPAS制皿培养试样以及APEL制皿培养试样中的表达增加(实施例1、比较例1)，即使在APEL制皿中不使用分化用培养基，也与在聚苯乙烯制皿中使用分化用培养基的情况相同程度地检测出分化标记(实施例1、比较例2)。
由此示出了通过使降冰片烯系加成聚合物接触，从而可促进细胞的分化。
此外，用相位差显微镜观察实施例1的APEL制皿培养试样(培养的第10天)。其结果示于表2。
此外，用相位差显微镜观察比较例1的聚苯乙烯制皿培养试样(培养的第10天)。其结果示于图3。
示出了与图3所示的聚苯乙烯制皿培养试样相比，图2的APEL制皿培养试样中形成了细胞块且进行了油滴蓄积。