本发明涉及利用来自曲霉属菌的辅酶的花色素苷低聚物的制造方法，更详细而言，涉及用作为曲霉属菌的一种的黑曲霉
背景技术：
花色素苷除了作为天然色素的功能以外还显示出多种生理活性，即显示出抗氧化、降低胆固醇、改善视力的效果、血管保护功能、预防动脉硬化、预防心脏病、抗溃疡功能、抗癌、抗炎、抑制糖尿病、保护机体免受紫外线影响的功能等多种生理活性，在医药品方面也积极应用，从而作为健康食品和新医药品研发的新的对象而受到关注。
花色素苷在中性或碱性溶液中不稳定，在酸性溶液中如果暴露在光下则显示出颜色缓慢脱色的现象，因此视为结构上最不稳定的物质中的一种。特别是作为对花色素苷色素的稳定性造成影响的主要因素，可举出花色素苷的化学结构、色素的浓度、溶液的ph、温度、共存色素的有无、金属离子、酶、氧、抗坏血酸(ascorbicacid)、糖等，根据这些主要因素的差异，在色度的维持，即结构稳定性上显示出先差异。由于该结构不稳定性，所以在作为食品和医药品的积极应用中发生很多困难，因此正在进行用于提高稳定性的研究。
大部分食材中含有的花色素苷为单体形态，该形态存在对中性和碱性不稳定且对光和热不稳定的缺点。聚合物形态在食品中少量存在，但与单体相比，功能性和稳定度高，现有的代表性的抗氧化功能也成倍增加。对于最近的近视和弱视的问题，报告了关于改善主观性的症状和对比敏感度的花色素苷低聚物的研究。
作为相关现有技术，有韩国授权专利第10-1182630号(2012.09.07)、韩国公开专利第10-2012-0079040号(2012.07.11)等。
曲霉(aspergillus)属丝状菌是生产酶、有机酸和具有药理活性的代谢产物的有用的微生物，一直以来不仅在食品产业、酒类产业、医药业，而且在农业上也有用地被利用，很久以前开始就用于传统发酵食品生产，被认为是安全的菌株。另外，菌类由于向外部排出的外切酶(exo-enzyme)多，功能多样，因此利用它时，能够利用天然酶经济地生产有用的物质。以往报告了利用曲霉(aspergillus)属丝状菌生产花色素苷低聚物的研究，但是如果直接使用菌株，则存在在生产花色素苷低聚物的过程中发生污染的缺点。
本发明为了确认不直接使用曲霉(aspergillus)属菌而利用向外部排出的酶是否能够制造花色素苷低聚物，研究了利用从培养了黑曲霉(aspergillusniger)菌的培养液中提取的辅酶和分析辅酶而获得的葡萄糖苷酶(glucosidase)和复合多糖酶l(viscozymel)酶的制造方法，确认其功效，从而完成了本发明。
技术实现要素：
技术课题
本发明的目的是利用黑曲霉(aspergillusniger，
解决课题的手段
为了实现上述目的，本发明提供一种花色素苷低聚物的制造方法，其中，包括：(1)在培养曲霉(aspergillus)属菌株的培养液总分离水溶性辅酶的步骤；以及(2)对花色素苷单体添加在上述步骤(1)中分离的辅酶而进行发酵的步骤。
优选地，上述步骤(1)的曲霉(aspergillus)属菌株为黑曲霉(aspergillusniger)。
优选地，上述步骤(1)的菌株在15～30℃的温度下培养4～8天。
优选地，上述步骤(1)的辅酶是如下被分离的：在培养液中加入有机溶剂而进行沉淀后，将得到的沉淀物溶解于蒸馏水而以酶的形式分离。
优选地，上述步骤(2)的发酵是如下进行的：将花色素苷单体和蒸馏水以1:8至1:15的质量比混合而准备花色素苷单体溶液后，将上述花色素苷单体溶液和在上述步骤(1)中分离的辅酶以基质与酶之比为40:1至60:1的质量比混合而进行。
优选地，上述步骤(2)的发酵在15～30℃的温度下进行5～10天。
另外，本发明提供一种花色素苷低聚物的制造方法，其中，包括以下步骤：将存在于培养曲霉(aspergillus)属菌株的培养液中并包含葡萄糖苷酶(glucosidase)作为有效成分的辅酶和复合多糖酶l(viscozymel)添加到花色素苷单体中进行发酵的步骤。
发明效果
根据如上所述的本发明，为了克服在利用黑曲霉(aspergillusniger，
另外，确认了利用辅酶中所包含的酶中的葡萄糖苷酶(glucosidase)而进行发酵的花色素苷低聚物的发酵效率和自由基清除能力优异，在包含葡萄糖苷酶(glucosidase)的酶的发酵中也确认了花色素苷低聚物的聚合。
附图说明
图1是根据本发明的实施例1用黑曲霉
图2是根据本发明的实施例1将花色素苷单体作为对照组并确认esi质谱(esimass)结果的图表。
图3是根据本发明的实施例1的、通过esi质谱(esimass)确认花色素苷低聚物最终合成与否的图表。
图4是根据本发明的实施例1将花色素苷单体和用黑曲霉
图5是根据本发明的实施例2在黑曲霉
图6是根据本发明的实施例2用由黑曲霉
图7是根据本发明的实施例2将花色素苷单体作为对照组确认esi质谱(esimass)结果的图表。
图8是根据本发明的实施例2的、通过esi质谱(esimass)确认花色素苷低聚物最终合成与否的图表。
图9是根据本发明的实施例2将黑曲霉
图10是根据本发明的实施例2的、为了分析黑曲霉
图11是根据本发明的实施例3用从黑曲霉
图12是根据本发明的实施例3将花色素苷单体作为对照组确认esi质谱(esimass)结果的图表。
图13是根据本发明的实施例3利用葡萄糖苷酶(glucosidase)作为酶时通过esi质谱(esimass)而确认花色素苷低聚物最终合成与否的的图表。
图14是根据本发明的实施例3利用复合多糖酶l(viscozymel)作为酶时通过esi质谱(esimass)而确认花色素苷低聚物最终合成与否的的图表。
图15是根据本发明的实施例3将用由黑曲霉
具体实施方式
下面详细说明本发明。
本发明提供一种花色素苷低聚物的制造方法，包括：(1)在培养曲霉(aspergillus)属菌株的培养液中分离水溶性辅酶的步骤；以及(2)对花色素苷单体添加上述步骤(1)中分离的辅酶而进行发酵的步骤。
上述步骤(1)的曲霉(aspergillus)属菌株优选为黑曲霉(aspergillusniger)。
上述步骤(1)的菌株优选在15～30℃的温度下培养4～8天。更优选在25℃的温度下培养5天。
上述步骤(1)的辅酶优选如下分离：在培养液中加入有机溶剂而进行沉淀后，将得到的沉淀物溶剂溶于蒸馏水而以酶的形式进行分离。
上述步骤(2)的发酵优选如下进行：将花色素苷单体和蒸馏水以1:8至1:15的质量比混合而准备花色素苷单体溶液后，将上述花色素苷单体溶液和在上述步骤(1)中分离的辅酶以基质与酶之比为40:1至60:1的质量比混合而进行。基质为花色素苷单体。更优选地，将花色素苷单体与蒸馏水以1:10的质量比混合而准备花色素苷单体溶液后，将上述花色素苷单体溶液和在上述步骤(1)中分离的辅酶以50:1的质量比混合而进行。
上述步骤(2)的发酵优选在15～30℃的温度下进行5～10天。更优选在25℃的温度下培养7天。确认了直到7天为止，花色素苷低聚物合成量增加，但是在8天以后的条件下即使经过一定时间后花色素苷低聚物合成量也差不多。
在上述步骤(1)中分离的辅酶包含葡萄糖苷酶(glucosidase)作为有效成分。
另外，本发明提供一种花色素苷低聚物的制造方法，将存在于培养曲霉(aspergillus)属菌株的培养液中并包含葡萄糖苷酶(glucosidase)作为有效成分的辅酶和复合多糖酶l(viscozymel)添加到花色素苷单体中进行发酵的步骤。
下面，通过实施例进一步详细说明本发明。本领域技术人员应当理解这些实施例仅用于例示本发明，不应解释为本发明的范围限于这些实施例。
实施例1.曲霉属菌培养液的低聚物合成能力确认
如(图1)中整理的那样，以1:10的质量比混合花色素苷单体和蒸馏水而准备花色素苷单体溶液。并且，以95:5的质量比混合花色素苷单体溶液和黑曲霉(aspergillusniger，
发酵后，将其用滤纸(filterpaper)进行过滤而将菌株等花色素苷以外的其他物质过滤，从而分离花色素苷低聚物，进行冷冻干燥，获得花色素苷低聚物。为了纯化花色素苷低聚物，优选利用管(tubular)、毛细管(capillary)、盘绕螺旋(coiledspiral)、放置膜(placemembrane)进行过滤。
以花色素苷单体为对照组，通过esi质谱(esimass)观察峰。如(图2)所示，可以确认分子量在300附近的峰非常高。与此相比，以获得的花色素苷低聚物为对象，通过esi质谱(esimass)观察峰，结果如(图3)所示，在分子量600附近观察到了高的峰，接着在900和1200附近也观察到了峰。这是花色素苷单体发酵的结果，表示变化为二聚物(dimer)、三聚物(trimer)、四聚物(tetramer)等花色素苷低聚物(oligomer)，确认进行了合成。
为了比较花色素苷单体和低聚物的功效，如(图4)所示，改变单体和低聚物的浓度，实验了清除羟基自由基的功效。实验结果，低聚物的抑制中间值(inhibitoryconcentration,ic50)与单体相比仅为一半左右，确认了以低浓度也具有自由基清除功效。
实施例2.从曲霉属菌培养液中得到的辅酶的低聚物合成能力确认
如(图5)中整理的那样，为了从黑曲霉(aspergillusniger，
然后按照(图6)中整理的那样，以1:10的质量比混合花色素苷单体和蒸馏水而准备花色素苷单体溶液。并且以500:1的质量比混合花色素苷单体溶液和辅酶，在25℃的温度下发酵5天。
发酵后，将其用滤纸(filterpaper)进行过滤而将花色素苷以外的其他物质过滤，从而分离花色素苷低聚物，进行冷冻干燥，获得花色素苷低聚物。为了纯化花色素苷低聚物，优选利用管(tubular)、毛细管(capillary)、盘绕螺旋(coiledspiral)、放置膜(placemembrane)进行过滤。
以花色素苷单体为对照组，通过esi质谱(esimass)观察峰。(图7)为其结果。与此相比，以获得的花色素苷低聚物为对象，通过esi质谱(esimass)观察峰，结果如(图8)所示，观察到了与(图7)相比，在分子量600、900和1200附近峰变高。这是花色素苷单体发酵的结果，表示变化为二聚物(dimer)、三聚物(trimer)、四聚物(tetramer)等花色素苷低聚物(oligomer)，确认进行了合成。
将制造花色素苷低聚物的辅酶进行分离，为了确认其特性和培养条件，可以得到如(图9)所示的sds-page接过照片。将培养时间设为4～8天而提取的辅酶的量通过sds-page进行比较的结果，在6～8天的条件下，即使经过一定时间，提出出来的辅酶的量相似。因此，可以确认，为了准备用于合成花色素苷低聚物的辅酶，将黑曲霉(aspergillusniger，
另外，如(图10)中以四边形表示的那样，得到9个薄的碎片，分别利用胰蛋白酶蛋白分解酶分解后，在q-starpulsaresi-hybridq-tof设备中实施了lc-ms/ms分析。其结果，确认了数十个蛋白质，将它们的ms/ms谱峰用analystqs(v1.1,appliedbiosystems)分析而鉴定了蛋白质。鉴定的蛋白质如下述表中的内容。黑曲霉(aspergillusniger，
[表1]
[表2]
实施例3.从曲霉属菌培养液中得到的辅酶中的葡萄糖苷酶(glucosidase)和复合多糖酶l(viscozymel)的低聚物合成能力确认
如(图11)中整理的那样，以1:10的质量比混合花色素苷单体和蒸馏水而准备花色素苷单体溶液。并且，分别以1000:1和500:1的质量比混合花色素苷单体溶液与从黑曲霉(aspergillusniger，
复合多糖酶l(viscozymel)是包含葡萄糖苷酶(glucosidase)的酶，是市售的酶。
发酵后，将其用滤纸(filterpaper)进行过滤而将花色素苷以外的其他物质过滤，从而分离花色素苷低聚物，进行冷冻干燥，获得花色素苷低聚物。为了纯化花色素苷低聚物，优选利用管(tubular)、毛细管(capillary)、盘绕螺旋(coiledspiral)、放置膜(placemembrane)进行过滤。
以花色素苷单体为对照组，通过esi质谱(esimass)观察峰。(图12)为其结果。与此相比，以利用从黑曲霉(aspergillusniger，
为了比较用酶得到的花色素苷低聚物的功效，如(图15)所示，改变用葡萄糖苷酶(glucosidase)得到的低聚物和用复合多糖酶l(viscozymel)得到的低聚物的浓度，实验了清除羟基自由基的功效。实验结果，用葡萄糖苷酶(glucosidase)得到的低聚物的抑制中间值(inhibitoryconcentration,ic50)0.217mg/ml与用复合多糖酶l(viscoaymel)得到的低聚物的抑制中间值0.278mg/ml相比是明显低的值，因此确认了以低浓度也具有自由基清除功效。
以上，详细叙述了本发明内容的特定部分，本领域技术人员清楚这种具体的技术仅是优选的实施方式，本发明的范围步骤其限制。因此，应该说本发明的实质性的范围由所附的权利要求及其等价物所定义。