污水处理厂活性污泥中自养菌与异养菌的分离方法与流程

文档序号:12056228阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种污水处理厂活性污泥中自养菌与异养菌的分离方法,其特征在于:分离自养菌时,将活性污泥混合液均分为两份,一份中加入13C标记的无机物作为实验组,另一份中加入12C标记的无机物作为对照组,分别原位培养;分离异养菌时,将活性污泥混合液均分为两份,一份中加入13C标记的有机物作为实验组,另一份中加入12C标记的有机物作为对照组,分别原位培养;提取培养后活性污泥微生物的基因组DNA;将DNA样品与氯化铯溶液混合并进行超高速密度梯度离心;采用重力法在离心管的顶部匀速注水,在离心管底部接收流出的离心液,分离得到不同密度层级的DNA溶液;用PEG6000和乙醇溶液纯化各层级的DNA样品;利用普通PCR技术、实时定量PCR技术和高通量测序技术测定分离后实验组中5-9层级的DNA样品,分析自养或异养微生物的群落特征,并与对照组进行比较;

上述超高速密度梯度离心过程如下:

(1)用分光光度计测定原位培养后活性污泥微生物的基因组DNA;

(2)采用Gradient Buffer缓冲液将2.0μg的活性污泥基因组DNA定容到100μL;

(3)在15mL的离心管中,依次加入4.9mL浓度为1.85g/mL的CsCl溶液、0.9mL Gradient Buffer缓冲液和步骤(2)中得到的100μL含2.0μg活性污泥DNA的溶液;

(4)采用涡旋振荡仪将上述溶液完全混合;

(5)采用折光仪测定折光率,使上述溶液的目标折射率为1.4029±0.0002,这一折射率对应的浮力密度为1.725g/mL,如果目标折射率偏大,添加Gradient Buffer缓冲液,20μL为一个添加单位;如果目标折射率偏小,添加1.85g/mL的CsCl溶液,20μL为一个添加单位;

(6)采用10mL注射器移取步骤(5)的溶液5.1mL至6mL的离心管中,密封离心管;

(7)将离心试管放入超高速离心转子,并使用螺帽将试管密封于转子中;超高速离心的基本参数是:44小时;20℃;速度45krpm或190000×g;Time:hold;Accel:9;Decel:no break;

(8)离心完成后,将离心后的超高速密度梯度离心管固定于三脚架上,在超高速离心管底部放置15个1.5mL离心管,用6号针头在超高速离心管底部扎一个小孔,然后在试管顶部未填充离心溶液的空隙处,将另外一个6号针头插入并把它与固定流速泵相连,随后启动固定流速泵;固定流速泵的流速设置为340μL/min;启动固定流速泵后,从离心管底部第一滴溶液流出开始计时,每隔1min更新放置于超高速离心管底部的1.5mL离心管的位置;均匀收集从超高速离心管流出的不同密度层级的DNA,得到15个不同密度层级的DNA用于后续分析;

上述各层级的DNA样品的纯化步骤如下:

(1)利用折光仪测定15层液体每层的折光率,评价分层效果;通过离心溶液密度计算的经验公式ρ=-75.9318+99.2031x-31.2551x2,推导各层液体的浮力密度,上述公式中ρ表示浮力密度,x表示折光值,使浮力密度的范围在1.690~1.760g/mL之间;

(2)每层中加入550μL的PEG6000溶液,头尾倒置若干次混匀溶液,室温静置2h或37℃加热1h,沉淀DNA;

(3)在15-20℃下13000×g高速离心30min,除去上清液;

(4)加入500μL质量百分比为70%乙醇清洗DNA沉淀,离心10min,除去上清液;

(5)再次加入500μL质量百分比为70%乙醇清洗DNA沉淀,离心10min,除去上清液;

(6)将沉淀的DNA室温干燥15min;

(7)确保DNA沉淀中无液体存在后,将其溶于30μL TE缓冲液,零下20℃保存。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:

上述用稳定性同位素标记的底物原位培养活性污泥的过程如下:

(1)取活性污泥系统的污泥混合液,用蒸馏水淘洗离心3次,将离心后的污泥定容至淘洗前体积的一半;

(2)取2个150mL锥形瓶,各加入50mL淘洗后的污泥,分别加入12C标记的底物作为对照组、13C标记的底物作为实验组;搅拌培养3个周期,每周期10小时,保持温度为25℃;前2个周期结束后淘洗离心污泥,将污泥定容至50mL后,加入对应的基质进行下一个周期的培养。

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