产香甘薯长喙壳真菌及其应用的制作方法

本发明涉及生物香料生产技术领域，具体而言，涉及一种产香甘薯长喙壳真菌及其应用。

背景技术：

香料物质历来受到人们的青睐，但由于天然动植物香料来源短缺、生产周期长、价格昂贵，目前85％左右的香味化合物均由化学合成法生产。近年来人们发现合成香料可能含有有毒杂质甚至致癌成分，由此激发了采用生物转化法合成天然香料香精的研究与开发。生物合成法是模拟天然动植物代谢过程生产香料化合物，具有周期短、规模化、安全的特点。这些香料化合物已被欧洲和美国食品法规界定为“天然的”。

甘薯长喙壳作为一种世界范围内广泛分布的重要病原真菌，其自身生长过程中会产生具有香气的代谢产物。国外有报道甘薯长喙壳在不同的液体培养基上产生香气味道不同且香气浓度也有差异，不同地区来源，不同遗传特性的甘薯长喙壳的香气也自然不同，因此选育出优质的甘薯长喙壳用于提炼生产香料物质就显得尤为重要。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明提供了一株产果香的甘薯长喙壳真菌，以解决上述问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种产香真菌，所述产香真菌为甘薯长喙壳，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno:m2016711；保藏时间为：2016年12月1日。

本发明筛选得到的该真菌菌株，本文对一株甘薯长喙壳真菌的生物学特性进行了初步研究，并利用gc-ms联用技术分析其挥发性物质组成。

筛选该菌的样品为石榴的发病茎部，具有浓郁水果香味，菌株编号为pp1-1石榴。该菌易于培养，在固体psa培养基上生长10天则能产浓郁香蕉香味，经气质联仪检测该菌株能够产生乙酸乙酯、乙酸异丁酯、安息香醛、3-甲基丁酸丁酯、萘丁美酮、苯乙烯等果香物质。该菌的发现为替代植物原料生产香料提供了一种新的微生物资源。

上述的经过分离纯化的甘薯长喙壳真菌，子囊壳黑色，约130-300um，具有一个长喙450-800um；成串粘稠的子囊孢子从长喙的顶端溢出呈卷状盘绕，子囊孢子小而透明，帽形，长约3.8-5um，宽2.3-4um；分生孢子圆形，透明，暗绿色，通常10个或10个以上这样的分生孢子连成链状，单个分生孢子长8-17um，宽6-15um；厚垣孢子球形或椭圆形，深绿褐色，直径8-20um。

含有所述的甘薯长喙壳的菌剂也属于本申请要求保护的范围。对于该菌株而言，只要对其进行培养就可收获香料物质。然而在实际应用的过程中，考虑到其可能需要运输及生长培养效率等原因，有必要将其扩大培养制成微生物菌剂的形式以扩大其应用范围。

该菌剂中，可优选添加培养基、或者进一步添加葡萄糖、硫胺素、生物素和烟酸等营养物。

如上所述的产香真菌或如上所述的真菌菌剂在生产香料中的应用。

如上所述的产香真菌或如上所述的真菌菌剂生产得到的香料。

一种香料的生产方法，将权利要求1所述产香真菌在25℃～30℃的条件下培养7～15天后提取香料成分。

优选的，如上所述的香料的生产方法，在所述培养所用培养基为psa或pda。

优选的，如上所述的香料的生产方法，将所述产香真菌在psa培养基中27℃～29℃的条件下培养10～12天后提取香料成分。

优选的，如上所述的香料的生产方法，所述提取香料成分的方法为固相萃取法。

如上所述的香料用于食品、化妆品、香水制品、清洁用品、香薰制品增香的应用。

所述食品包括小吃、点心、原料(stock)、汤、炖品(stew)、酱、肉汁或饮料；

所述香薰质谱包括固体香薰(檀香、沉香、麝香、艾香、花香等)和液体香薰(精油、香氛)等；

所述清洁用品包括：

清洁剂，如工业清洁剂、商业清洁剂、医用清洁剂、日用清洁剂、汽车清洁剂等等；

商用清洁用品，如空气清新香片、擦手纸纸架、抽取式餐巾纸盒、玻璃清洁器、洗涤用品等等；

纸类清洁用品，如手帕纸、无芯卷纸、有芯卷纸、大盘纸、餐巾纸、婴幼儿用纸、面巾纸等等；

厨房清洁用品，如台面刷、各类厨布、超细纤维、百洁布、钢丝球、手套等等；

日化用品，如香皂、干发器、洗漱包、洗衣服、沐浴露、洗衣液、杯刷、宠物清洁液等等；

石材翻新护理用品，如石材防护剂、石材翻新用品、人造石养护剂等等。

化妆品包括：

液体：洗面乳、浴液、洗发液、化妆水、香水、洁肤水、卸妆液、精华液、原液等；

乳液：蜜类、奶类、护发乳、精华乳；

膏霜类：润面霜、粉底霜、洗发膏、遮瑕膏、焗发膏、精华霜、妆前霜；

粉类：香粉、爽身粉、散粉、洁肤粉、蜜粉；

块状：粉饼、化妆盒、口红、发蜡；

油状：卸妆油、润肤油、润发油、精华油。

本申请提供的甘薯长喙壳(ceratocystisfimbriata)，菌株名为pp1-1石榴，保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号cctccno:m2016711；经保藏中心于2016年12月1日检测为存活菌株并保藏。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为甘薯长喙壳的形态学鉴定；a：子囊壳perithecium(100×)；b：孔口须ostrich(400×)；c：子囊孢子ascospore(2000×)；d：链状分生孢子chainsofconidia(1000×)；e：桶状分生孢子barrelconidia(1600×)；f：厚垣孢子chlamydospore(900×)；

图2为甘薯长喙壳挥发性物质的gc-ms分析结果。

具体实施方式

除非另有限定，本发明使用的所有技术和科学术语具有与所公开的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本发明所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本实施方式的实践或测试中，但下文仍然描述了合适的方法和材料。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起支配作用。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而不旨在限制。实施方式的其他特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求中变得明显。

为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例

1.材料与方法

1.1实验材料

1.1.1供试菌株

供试菌株由本实验室从石榴的发病茎部分离得到，具有浓郁水果香味，菌株编号为pp1-1石榴。

1.1.2培养基

psa培养基：马铃薯200g、琼脂粉17g、蔗糖20g、水1000ml。

1.2产香真菌的鉴定

1.2.1形态学鉴定

将菌株15接种在psa培养基上并于25℃恒温培养，15d。

光学显微镜观察：用1％的乳酚油棉兰测定子囊孢子外面是否有胶质鞘。为了测定子囊孢子外面是否有胶质鞘，在玻片上滴人1％的乳酚油棉兰，有胶质鞘的子囊孢子遇到乳酚油棉兰后，子囊孢子变为黑色，胶质鞘仍为无色。

扫描电镜观察：将发病组织块放在戊二醛中固定2h，用磷酸缓冲液(0.05mol/l)清洗3次，再放人1％锇酸中，室温下固定2h，然后经30％～100％乙醇系列脱水，临界点干燥，粘台喷镀，在sem一505扫描电镜下观察与照相。

1.2.4分子生物学鉴定

2.1.1.4分子鉴定

病原菌dna的提取：基因组dna提取采用chelex-100法快速提取真菌dna。置于-20℃冰箱保存备用。置于-20℃冰箱保存备用。

核糖体rdna-its区段扩增：以病菌基因组rdna为模板进行pcr扩增，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。its-pcr扩增反应在25μl反应体系中进行(见下表)。

引物：its1f5′-cttggtcatttagaggaagtaa-3′

its45′-tcctccgcttattgatatgc-3′

反应体系如表1所示：

表1

扩增循环反应条件为：94℃预变性95s；94℃变性35s，52℃退火60s，72℃延伸60s；35个循环；最终72℃延伸15min，4℃保存。

取2μlpcr扩增产物和3μl核酸染料混合，于1.2％的琼脂糖凝胶上电泳检测，电泳缓冲液为0.5×tbe，在120v电压下进行45min，置于upv紫外成像系统上观察成像，并拍照。

pcr产物测序和序列分析：将pcr扩增产物送华大基因公司进行正反双向测序，测序结果在genbank(http://www.ncbi.nih.gov)中进行blast比对分析。

1.3香气成分提取及gc-ms分析

1.3.1香气成分提取

将培养基切碎，装入固相微萃取瓶中。将平衡后的dvb/car/pdms固相微萃取头插入萃取瓶中，压下活塞使纤维头伸出，暴露于样品上层空气中，40℃条件下固相微萃取1小时。

1.3.2挥发性物质gc-ms分析条件

色谱条件：色谱柱为db-wax石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，程序升温，柱初温40℃，保持5min，以5℃的升温速率升至200℃，再以10℃的升温速率升至240℃，保持5min；载气为高纯氦气，流速1.0ml/min；进样模式为分流进样，分流比为10:1；质谱条件：ei离子源，电子能量70ev，扫描范围33-350amu。

2.结果与分析

2.1菌株鉴定

2.1.1形态学鉴定

子囊壳黑色，约130-300um，具有一个长喙450-800um；成串粘稠的子囊孢子从长喙的顶端溢出呈卷状盘绕，子囊孢子小而透明，帽形，长约3.8-5um，宽2.3-4um；分生孢子圆形，透明，暗绿色，通常10个或10个以上这样的分生孢子连成链状，单个分生孢子长8-17um，宽6-15um；厚垣孢子球形或椭圆形，深绿褐色，直径8-20um。

1.2.4.2rdna-its产物测序结果

基因转录间隔区引物对(its1f和its4)扩增到600bp左右的基因转录间隔区及核糖体rna基因片段。由北京三博远志生物技术有限公司对rdna–its扩增产物进行了双向测序。结果在ncbi上进行对比，结果表明所扩增的片段与genbank中已发表的甘薯长喙壳基因af395683、ay585345、af453438、af453439、af453439的同源性达到了100％。从分子水平证明引起石榴枯萎病的病原就是甘薯黑斑病菌。genebank注册号：ky418056。

表2测序结果与genbank中已发表的基因对比结果

2.4产香真菌挥发性物质gc-ms分析结果

产香真菌在psa培养基上第4天开始产香，10天左右香气浓度达到最大。利用gc-ms技术，从该菌挥发性成分中鉴定出9种已知化合物，

菌株pp1-1石榴，挥发性物质成分>1％的物质有：乙酸乙酯(ethylacetatec4h8o2)含量46.17％；乙酸异丁酯(isobutylacetatec6h12o2)含量8.53％；安息香醛(苯甲醛)(benzaldehydec7h6o)含量5.36％；3-甲基丁酸丁酯(butanoicacid,3-hydroxy-,butylesterc8h16o3)含量2.06％；4,4'-(1-甲基-1,2-亚乙基)二苯酚(phenol,萘丁美酮4,4'-(1-methylethylidene)bis-c15h16o2)含量1.52％。苯乙烯(styrenec8h8)含量0.99％；丁羟甲苯(butylatedhydroxytoluenec15h24o)含量0.19％；7个组分占总含量为64.82％。

由上可知，乙酸乙酯(ethylacetate)与乙酸异丁酯(isobutylacetate)二者之和占挥发性物质总量54.70％；其中乙酸乙酯具有类似于果香和酒香的味道，乙酸异丁酯有水果味道。

表3定性分析结果

表4菌株pp1-1石榴挥发性香气组分

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。