花生光敏色素相互作用因子AhPIF3及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及花生光敏色素相互作用因子ahpif3及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术：

作为我国最重要的油料作物和经济作物之一，花生为人类提供了高品质的植物油和优质的蛋白资源。发展花生生产对于促进农民增收和增加出口创汇等方面也具有重要意义。尽管我国花生生产、出口、加工形势良好，但也面临着十分严峻的问题：流行病害发生加剧、黄曲霉毒素污染严重、油亚比偏低，另外，干旱、盐碱等非生物胁迫也给花生生产造成了很大的危害。长期以来这些问题一直未能解决，已经成为了限制我国花生产业发展的瓶颈。花生抗性、品质等农艺性状大多数是由复杂的数量性状基因座(qtls)控制等因素，使得传统育种方法的应用受到了很大的限制。因此，通过现代生物技术手段，有针对性地掌握一批决定高产、稳产、优质和抗逆性的功能基因，通过转基因技术在花生中高水平表达，提高花生的抗逆性和品质，是突破我国花生产业发展瓶颈的根本途径。然而一直以来，花生功能基因组学的研究落后于水稻、玉米、小麦等粮食作物以及同为油料作物的大豆和油菜。特别是在重要农艺性状基因的挖掘等研究方面发展缓慢，成为了阻碍花生现代分子育种的关键因素。

荚果是花生的收获器官，荚果的正常发育是影响花生产量和质量的直接因素，鉴定和研究影响荚果发育过程的关键控制基因，阐明花生荚果发育和种子形成以及种子中物质积累的分子机理，是利用基因工程提高花生产量、改善花生品质的理论基础。花生是地上开花，地下结果的作物，如果人为阻止花生果针入土，花生果针在光照条件下不能膨大形成荚果。可见，光在花生荚果发育中起着非常关键的作用。

光敏色素(phytochrome)是光信号受体，光敏色素蛋白功能的发挥主要通过诱导pif家族转录因子的磷酸化和蛋白酶体的快速降解来改变pif蛋白积累水平，进而调控下游基因表达，影响光形态的建成等一系列植物生长发育过程。由此可见，pifs是光信号转导过程的关键转录因子。在黑暗条件下，pifs蛋白积累最高水平，同时植物处于最快生长状态(al-sadyetal.,2006；shenetal.,2008)。pif家族转录因子属于bhlh大家族的第15个亚家族，其蛋白积累水平在黑暗条件下明显升高，而光照时间的延长，其含量逐渐降低。pif3是利用拟南芥phybc-端作为诱饵，通过酵母双杂交发现的第一个pif家族成员(nietal.,1998)，pif3能够与phya和phyb的pfr相互作用。有研究发现，pif3的mrna积累是不受光调控的，但它的蛋白是受光调控的。这个蛋白在黑暗中比较稳定，在光照下很不稳定，在红光条件下的半衰期大约只有10～15min(parketal.,2004)。pif3的功能主要是控制植物的形态表型以及参与光反应过程中的一些生化途径。采用t-dna插入技术分离到许多独立突变株pif3，在连续红光的情况下，这些突变株表现为相对短的下胚轴和相对伸展的子叶。因此推测在红光下的光形态建成中pif3主要起负调控的作用。由于pif3植株中的叶绿素和花青素的积累都发生缺陷，因此又有人认为pif3基因在叶绿素的积累和光诱导的花青素积累中主要起正调控的作用(monteetal.,2004)。

由于花生荚果发育的特殊性以及光在花生荚果发育中的关键作用，拟南芥pif3对其生长发育的调控机理不能直接用于阐明花生pif3对花生荚果发育的调控作用，因此，克隆花生pif3基因并对其功能及在花生长发育中的作用进行研究，具有重要的理论意义和应用价值。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供花生光敏色素相互作用因子ahpif3及其编码基因与应用，为研究光调控花生荚果发育的信号途径以及通过基因工程改良花生奠定了基础。

一种花生光敏色素相互作用因子ahpif3，氨基酸序列如seqidno.1所示。

花生光敏色素相互作用因子ahpif3为花生中与光敏色素相互作用的转录调控因子。

花生光敏色素相互作用因子ahpif3的编码基因，核苷酸序列如seqidno.2所示。

一种重组载体，插入了核苷酸序列如seqidno.2所示的花生光敏色素相互作用因子ahpif3的编码基因。

上述重组载体可采用市售载体，经过常规手段，将目的基因seqidno.2导入载体，即可获得含有seqidno.2所示核苷酸序列的载体。

一种重组细胞，含有上述编码花生光敏色素相互作用因子ahpif3的基因或者上述重组载体。

上述花生光敏色素相互作用因子ahpif3的编码基因、重组载体和/或重组细胞在改良花生或其他经济作物品质中的应用。

有益效果

本发明首次公开了一种花生光敏色素相互作用因子ahpif3及其编码基因，从而为阐明光影响花生荚果发育的分子机理提供了重要的理论依据，并且在利用生物技术培育高产、优质花生等方面具有重要指导意义。

附图说明

图1花生与其它物种光敏色素相互作用因子pif3序列的对比图；

图中：蛋白登录号为atpif3np_172424.1、aipif3xp_016175382.1、adpif3xp_015939568.1、gmpif3xp_006605776.1、mtpif3xp_003626129.2；

图2花生光敏色素相互作用因子ahpif3在不同组织中的表达量柱状图；

其中：1、幼根，2、幼茎，3、幼叶，4、成年茎，5、成年叶，6、花，7、果针入土0天，8、果针入土3天，9、果针入土9天，10、种子；

图3花生光敏色素相互作用因子ahpif3正义表达载体的构建过程示意图；

图4不同光质条件下拟南芥野生型(col)、过量表达花生光敏色素相互作用因子ahpif3(ahpif3-oe)以及pif3-3突变体下胚轴长度测定照片；

图5不同光质条件下拟南芥野生型(col)、过量表达花生光敏色素相互作用因子ahpif3(ahpif3-oe)以及pif3-3突变体下胚轴长度柱状图；

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

以下实验步骤及涉及的培养基均为本领域常规技术，试剂均为市售产品。

实施例1、花生中pif3的克隆

通过分析花生果针和荚果发育早期转录组高通量测序的信息，将短片段拼接成较长的基因片段，获得uni-est，通过设计简并引物获得5’序列，通过3’race获得3’序列，然后进行拼接获得花生光敏色素相互作用因子pif3基因全长开放读码框(orf)。

经检测，该基因长度2196bp，编码产物光敏色素相互作用因子pif3，核苷酸序列如seqidno.2所示，其编码731个氨基酸残基，氨基酸序列如seqidno.1所示，预测其分子量约为78.7kda。与其它物种光敏色素相互作用因子pif3序列对比发现，ahpif3与两个花生野生品种pif3的同源性分别高达99.86％(arachis)和98.22％(arachisduranensis)，与大豆和苜蓿的同源性分别为64.04％和46.34％，与拟南芥atpif3的同源性最低，仅为28.55％，对比结果如图1所示。这一结果表明，花生光敏色素相互作用因子pif3可能具有与拟南芥atpif3不同的功能。

拟南芥中鉴定到atpif3与光敏色素b的互作位点(apbmotif)，序列为el××××gq，而在花生及两个野生花生品种中apbmotif的序列为el××××gn。花生与其它物种basichelixloophelix(bhlh)结构域同源性较高。

3'race反应使用的是takara宝生物公司3'-fullracecoresetver.2.0试剂盒，该试剂盒应用了套式pcr原理，增加了pcr扩增的特异性与灵敏度，可以从较少样品中扩增得到低丰度的基因，并且对长片段的3'race扩增具有明显优势。使用takaralataq扩增得到的pcr产物3'端附有一个“a”碱基，其产物可直接克隆于t-vector中。反转录引物3'raceadaptorprimer含有由takara独特设计的dt区域，反转录效率高。具体步骤如下：

1.1植物中rna的提取：

(1)参照ctab-licl法，称取0.2g新鲜花生叶片组织或-70℃保存的样品，在液氮中充分研磨至粉末状，研磨中不断缓慢加入液氮，防止材料解冻；

(2)将研好的组织迅速转移至预热(65℃)的含有600μlctab提取液的ep管中，立即剧烈涡旋振荡30s，使其混匀；

(3)65℃水浴2～5min，期间剧烈涡旋振荡3～5次。

(4)稍微冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡1min，混匀，4℃，12000rpm离心15min。

(5)将上清转移到另一新的ep管中，加入2μl的dnasei，37℃水浴15min。

(6)在加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡1min，混匀，4℃，12,000rpm离心15min。

(7)将上清转移到另一新的ep管中，加入1/3体积的8mlicl，使其终浓度为2m，4℃过夜沉淀。

(8)4℃，12,000rpm离心20min，弃上清。

(9)分别用体积浓度70％乙醇溶液，无水乙醇洗沉淀，晾干，加30～50μldepc-h2o，溶解沉淀。

1.2反转录反应

①反转录反应，反应体系如下：

②反应条件：42℃，60min；70℃，15min；

③反应结束后可以进行下一步实验或将反应液保存于-20℃；

1.3套式pcr反应

通过已经测序得到的片段，利用olige6.0软件在此片段上分别设计与3'race试剂盒中的outer引物和inner引物配对；

3’race：

3o：5’-atgtggaaagtatgaataaaggtgctgttgt-3’

3i：5’-gctgttgaaagaagtacgga-3’

使用了takaralataq(takaracode:drr02)*1进行pcr反应时的实验操作如下：①先进行outerpcr反应，反应体系如下：

②按以下条件进行pcr反应

置pcr仪上按以下程序进行扩增：94℃预变性3min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min；

pcr反应结束后，取5～10μl的pcr反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认pcr扩增产物，于-20℃保存，若没有得到目的扩增产物，可进行innerpcr反应；

③innerpcr反应，反应体系如下：

④以下条件进行pcr反应

置pcr仪上按以下程序进行扩增：94℃预变性3min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min；

⑤pcr反应结束后，取5～10μl的pcr反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认3'racepcr扩增产物，于-20℃保存。

实施例2、花生光敏色素相互作用因子ahpif3基因在不同组织中的表达模式分析

1、植物中rna的提取同实施例1中的1.1步骤

2、单链cdna的获得及表达模式分析：

以花生的幼根(15d)、幼茎(15d)、幼叶(15d)、成年茎(45d)、成年叶(45d)、花、果针入土0d，3d，9d以及种子的rna为材料，利用primescripttm1ststrandcdnasynthesiskit(购自takara公司)试剂盒反转录成单链cdna，用于之后的qrt-pcr。

以actin为体系内标，引物序列为：

t63(f):5’-gcccaactagcgagtcgaac-3’；

t63(r):5’-cagaacccagaaggctctcc-3’；

用于花生光敏色素相互作用因子ahpif3荧光定量的引物为：

ahpif3qf：5’-tagtcaaactgcggatctggcg-3’；

ahpif3qr：5’-gcttcacactgggtaggcatctgac-3’；

荧光定量pcr反应条件为：95℃10min；之后95℃15s，60℃1min，共进行40个循环。

结果显示：花生光敏色素相互作用因子ahpif3在花生的根、茎、叶、花、果针和种子中均有表达，在成年叶中表达量最高，花中次之，入土后9天和入土0天的果针中表达量最低，结果如图2所示。

实施例3、花生光敏色素相互作用因子ahpif3正义表达载体pcambia2300-ahpif3的构建，过程如图3所示：

1、分别用kpni和xbai酶切pcambia2300质粒和pmd18-t-ahpif3，37℃酶切4h：

(1)xbai对质粒进行酶切，体系如下：

(2)酶切完后，加入6μl3mnaac(ph5.2)，然后加入150μl无水乙醇，于-20℃沉淀1.5小时；

(3)12,000rpm离心8min，弃上清，400μl体积浓度75％的乙醇溶液洗涤1次；

(4)12000rpm离心5min，干燥10min后，加水52μl溶解15min；

(5)kpni对质粒进行酶切4h，酶切体系如下：

上述(4)所述溶解液17μl

kpni1μl

1×l缓冲液2μl

2、对酶切产物电泳后分别切取9494bp的pcambia2300质粒和2196bp的ahpif3片段，用博大泰克公司的b型小量dna片段快速胶回收试剂盒进行回收，具体步骤如下：

(1)将凝胶放在紫外灯下用干净的刀片将条带切下，装入灭菌的离心管中，称取胶的重量，每个管中胶的重量不能超过300mg；

(2)按100mg胶加300μl溶胶液的比例，室温溶胶(或50℃溶胶)，其间偶尔摇动；装柱，9000rpm，离心30s；去掉废液；

(3)500μl漂洗液(washbuffer)漂洗，12000rpm离心30s；重复漂洗一次，倒掉废液以后，再于12000rpm离心2min；

(4)将柱子放入一个新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加入合适体积的洗脱缓冲液(elutionbuffer，通常用30μl～50μl)，室温放置2～5min，12000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的dna片段，其中质粒pcambia2300回收的dna片段为pcambia2300片段、质粒pmd18-t-ahpif3回收的dna片段为ahpif3片段；

3、将两个回收片段用t4连接酶连接，构建成ahpif3正义表达载体pcambia2300-ahpif3。连接体系如下：

将上述a、b、c、d反应物混匀，16℃反应过夜，制得正义表达载体pcambia2300-ahpif3，用于转化大肠杆菌dh5α；

4、大肠杆菌感受态细胞的制备

(1)挑取e.coildh5α(购自天根生化科技有限公司)单菌落接种到5ml的lb液体培养基，于37℃，250rpm震荡培养过夜；

lb液体培养基组分如下：

10g胰蛋白胨(typtone)，5g酵母提取物(yeastextract)，5gnacl，用1mnaoh调ph7.0，加双蒸水定容至1000ml，121℃灭菌20min；

(2)次日将菌液以1％的接种量转移至100ml的液体培养基中，继续培养至吸光度(od)600＝0.4。

(3)将此菌液冰浴10min，在无菌条件下转移至预先冰冷的50ml离心管中，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

(4)重悬于10ml预冷的0.1mol/l的cacl2中，冰浴10min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

(5)重悬于2ml(含15％甘油)的预冷的0.1mol/l的cacl2中，分装成100μl/管，-70℃保存备用。

5、转化

(1)从-70℃冰箱取出大肠杆菌感受态细胞置于冰上溶解；

(2)将正义表达载体pcambia2300-ahpif35μl加至感受态细胞中，混匀，冰上放置30min；

(3)42℃热激90s，在此过程中不要晃动离心管；

(4)热激完毕后立即取出放于冰上2min；

(5)加入890μl的lb液体培养基，37℃，200rpm孵育1h；

(6)将菌液涂布在卡那(kan)抗性的lb固体平板上，37℃培养12h；

(7)将平板放入4℃保存。

6、阳性克隆的菌液pcr检测

(1)从转化的平板上挑取白色菌落接种到lb液体培养基中，37℃，250rpm震荡培养3～4h；

(2)pcr反应体系：taq酶缓冲液(含有mg²⁺)2.5μl，浓度2.5mm的dntp1μl，浓度10μm的ahgpif3f引物1μl、浓度10μm的ahgpif3r引物1μl，菌液2μl，taq酶(博大泰克公司产)0.3μl，加灭菌双蒸水至25μl；

上述引物序列如下：

ahgpif3f：5’-atgcctttttatgagttataccg-3’；

ahgpif3r：5’-tcaatcatcataaccagtcacaag-3’；

(3)pcr反应程序：98℃10min；94℃45s，55℃45s，72℃1.5min，34循环；72℃10min，4℃保存。取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果，有一条2196bp左右的条带；

7、质粒的提取

(1)将菌液pcr阳性的菌液于37℃，250rpm震荡培养过夜；

(2)将菌液转移到离心管中，室温8000rpm离心2min,收集菌体；

(3)倒取上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，使残余的液体流出；

(4)加入100μl预冷的溶液i，在涡旋振荡器上剧烈震荡重悬菌体，其中所述溶液i配方为：50mmol/l葡萄糖、25mmol/ltris-hcl(ph8.0)、10mmol/ledta(ph8.0)；

(5)加入200μl新鲜配制的溶液ⅱ，快速颠倒混匀10次，冰浴5min，其中所述溶液ⅱ配方为：0.2mol/lnaoh、1％十二烷基硫酸钠(sds)；

(6)加入150μl预冷的溶液ⅲ，温和地颠倒10次，冰浴5min，4℃12000rpm离心10min，其中所述溶液ⅲ配方为：5mol/l乙酸钾60ml、3mol/l冰乙酸11.5ml、h2o28.5ml、ph5.2；

(7)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(体积比为25:24:1)，反复混匀，4℃12000rpm离心10min；

(8)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比为24:1)，反复混匀，4℃12000rpm离心10min；

(9)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积预冷(-20℃)的异丙醇，混匀后-20℃沉淀1h，4℃12000rpm离心10min；

(10)倒掉上清，加入500μl体积浓度70％的乙醇溶液洗涤沉淀两次，空气中干燥；

(11)加入适当体积的te溶液和2μlrnasea，37℃消化0.5h，制得质粒。

8、质粒的酶切检测

(1)kpni和xbai对质粒进行酶切，同实施例3.1；

(2)37℃酶切2h，取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果，有一条2196bp左右的条带和9494bp左右的条带。

9、序列测定

以上步骤中获得的阳性克隆pcambia2300-ahpif3进行测序。

实施例4：pcambia2300-ahpif3正义植物表达载体转化农杆菌

1、农杆菌感受态细胞的制备

(1)挑取单菌落(gv3101，购自天根生化科技有限公司)接种到约3ml的yep液体培养基中，于28℃，220rpm震荡培养至od600＝0.5；

yep液体培养基组分如下：

称取10g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5gnacl，用1mnaoh调ph值约7.0，加双蒸水定容至1000ml，121℃灭菌20min；

(2)吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；

(3)5000rpm离心30s，弃去上清液；

(4)沉淀用1.5ml0.5mnacl悬浮，冰浴20min；

(5)5000rpm离心30s，弃去上清液；

(6)每管用100μl20mmcacl2悬浮，用于转化，-70℃保存备用；

2、dna直接转化农杆菌

(1)50μl农杆菌感受态细胞中加入pcambia2300-ahpif3表达载体质粒dna0.1～1μg(5～10μl)，之后冰浴30min；

(2)放入液氮中1.5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；

(3)取出离心管，加入0.5ml的yep，于28℃，220rpm震荡培养3至5小时；

(4)取出菌液于含有相应抗生素的yep平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养，2天左右菌落可见。

3、重组农杆菌鉴定

(1)挑取单菌落，接种于含有50mg/l的卡那霉素和50mg/l的利福平的yep液体培养基中，28℃震荡培养过夜。

(2)菌液pcr鉴定步骤同实施例3中步骤3.6。

实施例5：农杆菌介导转化拟南芥野生型(columbia)和pif3-3突变体植株(拟南芥野生型和pif3-3突变体植株购自美国拟南芥资源中心)

(1)当拟南芥花序形成时，将花序顶端减掉以诱导侧花序生成，转化前一天将材料浇透水；

(2)转化前一天，取2ml活化过的含有表达载体的农杆菌gv3101加到200mlyep液体培养基中(含50μg/l卡那霉素和50μg/l利福平)，28℃振荡培养至od600＝1.0～1.2；

yep液体培养基组分如下：

称取10g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5gnacl，用1mnaoh调ph值约7.0，加双蒸水定容至1000ml，121℃灭菌20min；

(3)4℃离心收集菌体，并用侵染液(5％蔗糖，10mmmgso4·6h2o，0.02％silwetl-77)重悬菌体，调od600约为0.8；

(4)将花序浸入侵染液30sec，其间轻轻摆动花序，使花序上形成一层膜；

(5)用保鲜膜覆盖花序，避光培养24h后揭去保鲜膜，置于19～22℃培养室培养；

(6)隔5～7d再用相同的方法浸染一次，重复3～4次；

(7)种子成熟后收获浸染过的拟南芥种子，制得wt/ahpif3拟南芥种子。

实施例6：不同光质处理对拟南芥野生型(col)，pif3-3突变体，wt/ahpif3下胚轴的影响

将过量表达花生光敏色素相互作用因子基因ahpif3的拟南芥纯合株系(wt/ahpif3)、pif3-3突变体以及野生型(columbia，col)拟南芥种子消毒，均匀铺撒到1/2ms培养基含蔗糖和琼脂)(购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)上，4℃春化3d，21℃光照1h后，分别转移到红光、远红光、白光和黑暗条件下培养，培养皿竖直放置，4d后统计下胚轴长度，使用imagej软件测量拟南芥下胚轴，使用spss软件进行显著性分析；结果如图4、图5所示，对不同光照处理下col野生型拟南芥，pif3-3突变体以及两个ahpif3转基因株系(ahpif3-oe)的下胚轴长度进行了统计；

结果表明，黑暗条件下野生型col和pif3-3突变体下胚轴的长度相似，两个过量表达ahpif3拟南芥株系(wt/ahpif3)的下胚轴长度大于col及pif3-3突变体的下胚轴；在白光下，两个过量表达ahpif3转基因株系(wt/ahpif3)的下胚轴长度显著长于col，pif3-3突变体下胚轴最短。在持续红光和远红光下，过量表达ahpif3转基因株系的下胚轴长度显著长于col及pif3-3突变体的下胚轴长度。

sequencelisting

<110>山东省农业科学院生物技术研究中心

<120>花生光敏色素相互作用因子ahpif3及其编码基因与应用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>731

<212>prt

<213>arachishypogaealinn.

<400>1

metprophetyrgluleutyrargleuserargglulysleuaspglu

151015

gluileasnglythrargalathraspglnserglnserserserpro

202530

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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