采用锌指核酸酶技术破坏人bcr‑abl融合基因以抑制CML细胞增殖和促使其凋亡的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种采用锌指核酸酶技术破坏人bcr-abl融合基因以抑制cml细胞增殖和促使其凋亡。

背景技术：

慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia,cml)的致病根源是由于t(9；22)(q34；q11)平衡易位导致c-abl基因与bcr基因形成bcr-abl融合基因。该融合基因编码的bcr-abl融合蛋白具有强烈的酪氨酸激酶活性，持续激活下游的ras/mapk，pi3k/akt，stat5等促增殖抑凋亡信号，导致细胞的恶性转化。临床上的一线治疗药物伊马替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors，tkis)，可以使近70％的cml慢性期患者达到血液学甚至遗传学的完全缓解，但是，另外30％的患者由于bcr-abl激酶区突变引发耐药，尤其是t315i突变，即使是新开发的第二代酪氨酸激酶抑制剂，也束手无策；并且，酪氨酸激酶抑制剂只能抑制abl激酶活性，不能使bcr-abl基因转为阴性，特别是白血病干细胞(leukemiastemcell,lsc)对tkis不敏感，残留的lsc成为复发的根源。因此，探索新的根治cml的方法迫在眉睫。

细胞本身存在一种dna损伤-修复机制，当dna双链的一条链断裂后，以另外一条链为模板进行同源修复；当dna双链的两条链均断裂后，以同源染色体的dna双链为模板进行同源修复，从而确保基因组的稳定。当两条染色体的dna双链均断裂后，以非同源末端连接(nonhomologousendjoining,nhej)的方式进行修复，这种修复方式极易发生插入、缺失致移码突变。利用细胞的这种损伤-修复原理，诞生了一种可以定点操作基因组的核酸酶修饰技术。它由特异性的dna识别结合结构域和非特异性剪切dna的核酸酶组成。该技术可以靶向特定位点的染色体dna双链断裂(double-strandedbreaks,dsb)，以供体dna为模板，促发同源定向修复(homologydirectedrepair,hdr)，或者以极易出错的nhej方式进行修复。其中hdr可对靶基因进行定点插入、缺失、修正等操作，而nhej由于极易出错，很容易导致靶基因发生插入、缺失和移码突变，从而实现对靶基因的破坏(genedisruption)。

目前，主要的核酸酶修饰技术包括锌指核酸酶(zincfingernucleases,zfns)，类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,tal-ens)和规律成簇间隔短回文重复/cas核酸酶(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crispr-associatedsystems,crispr/cas)核酸酶。crispr/ca-s核酸酶技术起步较晚，该技术操作起来最简单，但是，其潜在的完全性问题尚未得到证实。talens的主要优势在于不受靶序列特征的限制，但是特异识别靶序列的talens片段太长，不利于后续载体的装载和表达，并且在靶细胞内引入大量的重复序列也是未知的安全隐患。相比而言，虽然zfns构建过程较复杂，但其是人类基因编辑最确立的技术，技术成熟，免疫原性低，特异性较高，较适用于体内疗法，且已在基因治疗领域显示出良好的前景，是本研究较为理想的工具。

技术实现要素：

针对以上问题，本发明一方面提供一种dna分子，其序列如seqidno:2所示。

本发明的另一方面在于提供如seqidno:2所示的dna分子作为靶点在抑制人bcr-abl融合基因表达或导致人bcr-abl基因功能丧失中的应用；所述抑制人bcr-abl基因表达或导致人bcr-abl基因功能丧失是由锌指核酸酶介导的bcr-abl融合基因同源重组技术带来的。

在上述技术方案中，所述人bcr-abl基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。

所述的锌指核酸酶的锌指蛋白的核苷酸编码序列如seqidno:3和4所示。

所述的同源重组为同源定向修复，使用到的供体dna的左臂扩增引物如seqidno:7和8所示，右臂扩增引物如seqidno:9和10所示。

本发明的有益效果是：本发明定位了bcr-abl基因中一段特异的靶序列位点dna片段，并针对此特异位点构建zfn质粒，将此质粒核转染k562细胞可以使bcr-abl基因发生定点断裂,并以供体dna为模板进行同源修复，使其插入8个碱基最终导致bcr-abl基因的破坏。本发明的显著优势表现在针对bcr-abl序列中特异的靶序列位点构建的zfn质粒可高效靶向bcr-abl基因发生dna双链断裂，以hdr方式进行修复使bcr-abl发生移码等突变而被破坏，从而丧失促增殖、抑凋亡等恶性转化潜能，证实zfns靶向破坏bcr-abl基因杀伤和抑制cml细胞的可行性。

附图说明

图1是鉴定转染zfn质粒的k562细胞基因组dna测序结果峰图。

图2是k562细胞相关蛋白westernblot检测结果图，blank：空白对照组；gfp:空载组。

图3是k562细胞、gfp和zfn-l/r+donor质粒核转染k562细胞克隆形成镜下图，k562细胞：未处理细胞，gfp：空载质粒，zfn-l/r+donor：zfns和donor同时作用于k562细胞。

图4是gfp和zfn-l/r+donor质粒核转染k562细胞后细胞克隆形成数柱状图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1、针对人bcr-abl基因特异靶位点序列的zfn质粒和donor质粒的设计与构建

一、针对人bcr-abl基因特异靶位点序列的锌指核酸酶的设计合成

根据ncbi的查询和拼接确定了人bcr-abl基因的基因序列(如seqidno:1所示)，通过生物信息学的方法，完成zfns设计，确定了该人bcr-abl基因的锌指核酸酶作用的特异靶位点序列为：

ggcgtcgacggcgactacgaggacgccgag(如seqidno:2所示)；中间部分序列(gactac)为foki内切核酸酶切割位点，也即zfn特异敲除的靶位点序列，且本发明中所用的foki内切核酸酶为专性异二聚化foki质粒，购自addgene公司，可避免同源二聚化导致的非特异切割。

本发明中设计的针对人bcr-abl基因的锌指核酸酶(zfns)由锌指蛋白(zfp)和foki酶构成

(1)锌指蛋白(zfp)的左臂(zfp-l)、右臂(zfp-r)序列

zfp-l的dna序列为(如seqidno:3所示)：

5’-gtcgacctggagcccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgaccccggcaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgaccccggcgccctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccacaccggcaagaagaccagctgcggccgc-3’。

zfp-r的dna序列为(如seqidno:4所示)：

5’-gtcgacctggagcccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagccgcagcgacaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgaccccggcaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagccgcagcgacaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcaagaagaccagctgcggccgc-3’。

在上述zfp-l和zfp-r的dna序列中，5’端的下划线部分为sali酶切位点。3’端的下划线部分为noti酶切位点，下划线前面的碱基t为防止移码添加的碱基。

(2)foki酶

foki-l质粒(质粒编号37198)和foki-r质粒(质粒编号37199)均购自addgene。

二、质粒pad-track-cmv-zfn-l的构建

按照如下步骤操作：

(1)将上述zfp-l的编码序列交由北京华大基因公司合成；用sali酶和noti酶(takara公司)对zfp-l和pad-track-cmv(重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室保存)进行双酶切，37℃，1h；

(2)随后将酶切产物分别进行纯化回收，具体步骤按照天根生化科技有限公司普通dna产物纯化试剂盒(货号dp204)；

(3)将酶切回收产物用t4连接酶(takara公司)进行连接，16℃，16h；

(4)连接产物转化入dh5α感受态后在kana抗性的平板上进行分区划线，随后在37℃孵箱中培养12h；

(5)在上述kana平板上挑取8-10个单克隆菌落进行扩大培养；

(6)在扩增得到的菌液中提取质粒，具体步骤按照天根生化科技有限公司质粒小提试剂盒(货号dp103)；

(7)提取得到的质粒进行测序验证，其中得到的测序结果正确的质粒就为pad-track-cmv-zfp-l；

(8)以foki-l质粒为模板，pcr扩增foki-l质粒，以表1所列的引物进行目的片段pcr扩增反应。反应体系为25μl，12.5μlpremixtaq、1μl10μm引物foki-senceprimer、1μl25μm引物foki-antisenceprimer、100ng质粒dna，加超纯水至25μl。pcr扩增程序：94℃5min；94℃30s，退火温度58℃，72℃30s，循环29次，最后72℃延伸5min；pcr扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测；

表1扩增foki质粒dna目的片段引物表

注：foki-senceprimer中gcggccgc为noti酶切位点，下划线为linker序列，5’端的aaggaaaaaa为保护碱基。foki-antisenceprimer中ctcgag为xhoi酶切位点，5’端的ccg为保护碱基。

(9)随后将pcr产物进行纯化回收，具体步骤按照天根生化科技有限公司普通dna产物纯化试剂盒(货号dp204)；

(10)用xhoi酶和noti酶(takara公司)对foki-l和pad-track-cmv-zfp-l质粒进行双酶切，37℃，1h；

(11)随后将酶切产物分别进行纯化回收，具体步骤按照天根生化科技有限公司普通dna产物纯化试剂盒(货号dp204)；

(12)将它们的酶切回收产物用t4连接酶(takara公司)进行连接，16℃，16h；

(13)连接产物转化入dh5α感受态后在kana抗性的平板上进行分区划线，随后在37℃孵箱中培养12h；

(15)在上述kana平板上挑取8-10个单克隆菌落进行扩大培养；

(16)在扩增得到的菌液中提取质粒，具体步骤按照天根生化科技有限公司质粒小提试剂盒(货号dp103)；

(17)提取得到的质粒进行测序验证，其中得到的测序结果正确的质粒就为pad-track-cmv-zfn-l。

三、质粒pad-track-cmv-zfn-r质粒的构建

过程与上述“质粒pad-track-cmv-zfn-l的构建”过程类似，不同处是将zfp-r合成后构建pad-track-cmv-zfp-r质粒，再与foki-r质粒相连接构建pad-track-cmv-zfn-r质粒。(扩增foki-r质粒所用的pcr引物\程序和产物长度同表1)。

四、同源模板donor质粒的构建

以k562细胞cdna为模板，pcr扩增donor(左臂bcr217～758，长542bp；右臂：bcr759～1523bp，长765bp)，左臂克隆入kpni和noti酶切位点，右臂克隆入noti和xbai酶切位点，将左、右臂同时克隆入质粒pad-track-cmv中。

按照如下步骤操作：

(1)以k562细胞(上海细胞所提供)cdna为模板，pcr扩增donor左臂(donor-l)，以表2所列的引物进行目的片段pcr扩增反应。反应体系为25μl，12.5μlpremixtaq、1μl10μm引物donor-l-f、1μl25μm引物donor-l-r、100ngcdna，加超纯水至25μl。pcr扩增程序：94℃5min；94℃30s，退火温度56℃，72℃30s，循环29次，最后72℃延伸5min，pcr扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测；

表2扩增donor左臂的引物

注：以上2条引物的下划线处碱基分别为kpni和noti酶切位点

(2)用kpni酶和noti酶(takara公司)对donor-l的pcr产物和pad-track-cmv进行双酶切，37℃，1h；

(3)随后将酶切产物分别进行纯化回收，具体步骤按照天根生化科技有限公司普通dna产物纯化试剂盒(货号dp204)；

(4)将它们的酶切回收产物用t4连接酶(takara公司)进行连接，16℃，16h；

(5)连接产物转化入dh5α感受态后在kana抗性的平板上进行分区划线，随后在37℃孵箱中培养12h；

(6)在上述kana平板上挑取8-10个单克隆菌落进行扩大培养；

(7)在扩增得到的菌液中提取质粒，具体步骤按照天根生化科技有限公司质粒小提试剂盒(货号dp103)；

(8)提取得到的质粒进行测序验证，其中得到的测序结果正确的质粒就为pad-track-cmv-donor-l；

(9)再以k562细胞cdna为模板，pcr扩增donor右臂(donor-r)，以表3所列的引物进行目的片段pcr扩增反应。反应体系为25μl，12.5μlpremixtaq、1μl10μm引物donor-r-f、1μl25μm引物donor-r-r、100ngcdna，加超纯水至25μl。pcr扩增程序：94℃5min；94℃30s，退火温度56℃(见表3)，72℃30s，循环29次，最后72℃延伸5min，pcr扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测；

表3扩增donor右臂的引物

注：以上2条引物的下划线部分碱基分别为noti和xbai酶切位点

(10)随后将pcr产物进行纯化回收，具体步骤按照天根生化科技有限公司普通dna产物纯化试剂盒(货号dp204)；

(11)用noti酶和xbai酶(takara公司)对donor-r的pcr产物和pad-track-cmv-donor-l质粒进行双酶切，37℃，1h；

(12)随后将酶切产物分别进行纯化回收，具体步骤按照天根生化科技有限公司普通dna产物纯化试剂盒(货号dp204)；

(13)将它们的酶切回收产物用t4连接酶(takara公司)进行连接，16℃，16h；

(14)连接产物转化入dh5α感受态后在kana抗性的平板上进行分区划线，随后在37℃孵箱中培养12h；

(15)在上述kana平板上挑取8-10个单克隆菌落进行扩大培养；

(16)在扩增得到的菌液中提取质粒，具体步骤按照天根生化科技有限公司质粒小提试剂盒(货号dp103)；

(17)提取得到的质粒进行测序验证，其中得到的测序结果正确的质粒就为pad-track-cmv-donor。

实施例2、锌指核酸酶定点切割bcr-abl基因并插入noti酶切位点促发同源定向修复

1、冻存细胞的复苏与培养

从液氮中取出装有k562细胞的冻存小管，立即投入37℃的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解；在2min内完成复温；将细胞悬液移入无菌的离心管，加入5ml培养液，轻轻吹匀；将细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清；向含有细胞沉淀的离心管加入1ml完全培养基。

2、细胞培养条件及传代培养：

细胞培养条件

培养基组成成分：1640(gibcolot:1737734)

10％fbs(bilot:1616756)

传代培养：

(1)k562细胞密度达约80％左右；

(2)用移液器反复吹打数次，至细胞全部均匀重悬在培养基中，将其转移到离心管中；500rpm离心5min；

(3)弃上清，加入2ml培养基重悬细胞，分两份加到有培养基的培养瓶中；

(4)晃动培养瓶使细胞分布均匀后，至37℃、5％co2培养箱中培养。

3、核转染方法

使用lonza公司提供的电转试剂celllinenucleofectorkitv及核转染仪进行转染实验，具体操作按照试剂说明书进行。

4、细胞基因组dna提取：按照天根生化科技有限血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(货号：dp304)操作步骤说明，提取步骤3得到的培养48小时的细胞基因组dna。

5、目的片段pcr扩增反应和pcr产物测序验证

以上述步骤4得到的细胞基因组dna为模板，以下表4所列的引物进行目的片段pcr扩增反应。反应体系为25μl，12.5μlpremixtaq、1μl10μm引物senceprimer、1μl25μm引物anti-senceprimer、100ng基因组dna，加超纯水至25μl。pcr扩增程序：94℃5min；94℃30s，退火温度56℃，72℃30s，循环29次，最后72℃延伸5min。pcr扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

表4扩增bcr-abl基因组dna目的片段引物表

将pcr产物直接进行测序，将测序所得的序列结果与bcr-abl基因中的靶位点序列进行同源性比较分析，以鉴定转染zfn质粒k562细胞基因组dna中靶位点是否被定点插入noti酶切位点。测序结果峰图如图1所示，k562细胞基因组dna的靶位点被定点插入noti酶切位点。

6、westernblot检测相关蛋白变化

提取细胞总蛋白与浓度测定：

(1)收集前述步骤3得到的培养48小时的细胞到10ml离心管里，1000rpm离心10min，弃尽上清液；

(2)再加入2mlpbs于离心管中将细胞悬液，吹打混匀，1000rpm离心10min，弃尽上清液；

(3)加入1mlpbs重新混匀，将细胞悬液转至新的1.5mlep管中；

(4)配制裂解液：pmsf：naf：navo4：ripa＝1:1:1:100，每个dish加60μl裂解液。冰上裂解30分钟，每10分钟振荡一次(5-10s)；

(5)将ep管放入4℃离心机，12000rpm离心40分钟，上清液转移至另一个新的ep管中，记录体积，加上清液1/4体积的5×蛋白上样buffer，沸水煮5分钟，-80℃超低温冰箱保存；

(6)bca试剂盒测蛋白浓度：配制bca标准品工作液，终浓度0.5mg/ml。将标准品和待测品加入96孔板，按照说明书向每孔加工作液，振荡混匀后37℃水浴箱孵育35分钟，测定560nm处吸光度值，绘制标准曲线并计算蛋白浓度及上样量(见表5)。

表5蛋白浓度测定

westernblot：

(1)配制10％分离胶加入安装好的电泳仪中，1ml无水乙醇压线，37℃烤箱静置30min取出，弃去无水乙醇，配制5％浓缩胶，根据实验需求加入适量孔梳，再将配好的浓缩胶加入，37℃烤箱静置20min。待浓缩胶完全凝固后去掉胶条放入电泳槽中，加入内槽液(1×sds)后拔掉梳子，加入外槽液后排气泡。每孔加入30μg蛋白样品，两步法电泳：80v电泳30分钟，120v电泳90分钟；

(2)提前预冷湿转液并将滤纸浸泡在湿转液中，按目的条带分子量切胶浸润湿转液待用。剪与切胶大小相等的膜，甲醇活化1min，双蒸水2min转入湿转液中。转膜：按照三层滤纸、膜、胶和三层滤纸的顺序放入转膜仪，210ma恒流，小分子蛋白按照分子量大小相同时间转膜，大分子量蛋白按照分子量×0.85时间转膜；

(3)配制5％的封闭奶粉待转膜结束时将pvdf膜放入进行封闭，4℃冰箱4h；

(4)tbst去除膜上封闭液放置于蜡板上，加入一抗(1:1000稀释)后密封，4℃冰箱充分反应14-18h；

(5)取出pvdf膜，tbst洗3次/5min，加入二抗(1:2000稀释)，4℃90分钟后再用tbst洗2次/5min，tbs洗5min；

(6)配制发光液：a液：b液＝1:1，加在膜上避光于发光仪内显像。

westernblot检测相关蛋白结果如图2所示，与空白组，空载组以及各种质粒单独作用组对比zfn-l/r和donor共同作用于cml细胞后能使p-bcr-abl蛋白明显下调，且bcr-abl蛋白下游的效应分子p-stat5和p-erk都明显下调；与空白组，空载组以及各种质粒单独作用组对比zfn-l/r和donor共同作用于cml细胞后能激活parp和caspase-3蛋白，说明其能促进cml细胞凋亡。

7、克隆形成实验

(1)分别用空载质粒gfp和zfn-l/r+donor质粒核转染k562细胞，并且设对照组(无质粒转染)，每组处理设置5个复孔，每孔铺300个细胞于24孔板，调整每孔终培养基至750μl；

(2)在每孔中加入750μl2.7％甲基纤维素，混匀；

(3)37℃、5％co2恒温细胞孵箱内培养7-10天观察结果。结果如图3、4所示：zfn-l/r和donor共同作用于k562细胞后能明显抑制k562细胞的克隆大小和克隆数量，即抑制k562细胞的克隆形成能力。

序列表

<110>重庆医科大学

<120>采用锌指核酸酶技术破坏人bcr-abl融合基因以抑制cml细胞增殖和促使其凋亡

<130>1

<160>12

<210>1

<211>6021

<212>dna

<213>人工序列

<223>人bcr-abl基因

<400>1

atggtggacccggtgggcttcgcggaggcgtggaaggcgcagttcccggactcagagccc60

ccgcgcatggagctgcgctcagtgggcgacatcgagcaggagctggagcgctgcaaggcc120

tccattcggcgcctggagcaggaggtgaaccaggagcgcttccgcatgatctacctgcag180

acgttgctggccaaggaaaagaagagctatgaccggcagcgatggggcttccggcgcgcg240

gcgcaggcccccgacggcgcctccgagccccgagcgtccgcgtcgcgcccgcagccagcg300

cccgccgacggagccgacccgccgcccgccgaggagcccgaggcccggcccgacggcgag360

ggttctccgggtaaggccaggcccgggaccgcccgcaggcccggggcagccgcgtcgggg420

gaacgggacgaccggggaccccccgccagcgtggcggcgctcaggtccaacttcgagcgg480

atccgcaagggccatggccagcccggggcggacgccgagaagcccttctacgtgaacgtc540

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agctccctgggcagccaggccatgcagatggagcgcaaaaagtcccagcacggcgcgggc660

tcgagcgtgggggatgcatccaggcccccttaccggggacgctcctcggagagcagctgc720

ggcgtcgacggcgactacgaggacgccgagttgaacccccgcttcctgaaggacaacctg780

atcgacgccaatggcggtagcaggcccccttggccgcccctggagtaccagccctaccag840

agcatctacgtcgggggcatgatggaaggggagggcaagggcccgctcctgcgcagccag900

agcacctctgagcaggagaagcgccttacctggccccgcaggtcctactccccccggagt960

tttgaggattgcggaggcggctataccccggactgcagctccaatgagaacctcacctcc1020

agcgaggaggacttctcctctggccagtccagccgcgtgtccccaagccccaccacctac1080

cgcatgttccgggacaaaagccgctctccctcgcagaactcgcaacagtccttcgacagc1140

agcagtccccccacgccgcagtgccataagcggcaccggcactgcccggttgtcgtgtcc1200

gaggccaccatcgtgggcgtccgcaagaccgggcagatctggcccaacgatggcgagggc1260

gccttccatggagacgcagatggctcgttcggaacaccacctggatacggctgcgctgca1320

gaccgggcagaggagcagcgccggcaccaagatgggctgccctacattgatgactcgccc1380

tcctcatcgccccacctcagcagcaagggcaggggcagccgggatgcgctggtctcggga1440

gccctggagtccactaaagcgagtgagctggacttggaaaagggcttggagatgagaaaa1500

tgggtcctgtcgggaatcctggctagcgaggagacttacctgagccacctggaggcactg1560

ctgctgcccatgaagcctttgaaagccgctgccaccacctctcagccggtgctgacgagt1620

cagcagatcgagaccatcttcttcaaagtgcctgagctctacgagatccacaaggagttc1680

tatgatgggctcttcccccgcgtgcagcagtggagccaccagcagcgggtgggcgacctc1740

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gccatggaaatggctgagaagtgctgtcaggccaatgctcagtttgcagaaatctccgag1860

aacctgagagccagaagcaacaaagatgccaaggatccaacgaccaagaactctctggaa1920

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ctgaagcacactcctgccagccaccctgaccaccccttgctgcaggacgccctccgcatc2040

tcacagaacttcctgtccagcatcaatgaggagatcacaccccgacggcagtccatgacg2100

gtgaagaagggagagcaccggcagctgctgaaggacagcttcatggtggagctggtggag2160

ggggcccgcaagctgcgccacgtcttcctgttcaccgagctgcttctctgcaccaagctc2220

aagaagcagagcggaggcaaaacgcagcagtatgactgcaaatggtacattccgctcacg2280

gatctcagcttccagatggtggatgaactggaggcagtgcccaacatccccctggtgccc2340

gatgaggagctggacgctttgaagatcaagatctcccagatcaagagtgacatccagaga2400

gagaagagggcgaacaagggcagcaaggctacggagaggctgaagaagaagctgtcggag2460

caggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaac2520

ggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaac2580

atccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcag2640

atgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaat2700

aaggaagaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaa2760

gccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaac2820

cttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaa2880

ggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaacc2940

aaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaa3000

cactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcggg3060

atcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcg3120

ctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctc3180

tacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacg3240

gtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccact3300

gtctatggtgtgtcccccaactacgacaagtgggagatggaacgcacggacatcaccatg3360

aagcacaagctgggcgggggccagtacggggaggtgtacgagggcgtgtggaagaaatac3420

agcctgacggtggccgtgaagaccttgaaggaggacaccatggaggtggaagagttcttg3480

aaagaagctgcagtcatgaaagagatcaaacaccctaacctggtgcagctccttggggtc3540

tgcacccgggagcccccgttctatatcatcactgagttcatgacctacgggaacctcctg3600

gactacctgagggagtgcaaccggcaggaggtgaacgccgtggtgctgctgtacatggcc3660

actcagatctcgtcagccatggagtacctggagaagaaaaacttcatccacagagatctt3720

gctgcccgaaactgcctggtaggggagaaccacttggtgaaggtagctgattttggcctg3780

agcaggttgatgacaggggacacctacacagcccatgctggagccaagttccccatcaaa3840

tggactgcacccgagagcctggcctacaacaagttctccatcaagtccgacgtctgggca3900

tttggagtattgctttgggaaattgctacctatggcatgtccccttacccgggaattgac3960

ctgtcccaggtgtatgagctgctagagaaggactaccgcatggagcgcccagaaggctgc4020

ccagagaaggtctatgaactcatgcgagcatgttggcagtggaatccctctgaccggccc4080

tcctttgctgaaatccaccaagcctttgaaacaatgttccaggaatccagtatctcagac4140

gaagtggaaaaggagctggggaaacaaggcgtccgtggggctgtgagtaccttgctgcag4200

gccccagagctgcccaccaagacgaggacctccaggagagctgcagagcacagagacacc4260

actgacgtgcctgagatgcctcactccaagggccagggagagagcgatcctctggaccat4320

gagcctgccgtgtctccattgctccctcgaaaagagcgaggtcccccggagggcggcctg4380

aatgaagatgagcgccttctccccaaagacaaaaagaccaacttgttcagcgccttgatc4440

aagaagaagaagaagacagccccaacccctcccaaacgcagcagctccttccgggagatg4500

gacggccagccggagcgcagaggggccggcgaggaagagggccgagacatcagcaacggg4560

gcactggctttcacccccttggacacagctgacccagccaagtccccaaagcccagcaat4620

ggggctggggtccccaatggagccctccgggagtccgggggctcaggcttccggtctccc4680

cacctgtggaagaagtccagcacgctgaccagcagccgcctagccaccggcgaggaggag4740

ggcggtggcagctccagcaagcgcttcctgcgctcttgctccgcctcctgcgttccccat4800

ggggccaaggacacggagtggaggtcagtcacgctgcctcgggacttgcagtccacggga4860

agacagtttgactcgtccacatttggagggcacaaaagtgagaagccggctctgcctcgg4920

aagagggcaggggagaacaggtctgaccaggtgacccgaggcacagtaacgcctcccccc4980

aggctggtgaaaaagaatgaggaagctgctgatgaggtcttcaaagacatcatggagtcc5040

agcccgggctccagcccgcccaacctgactccaaaacccctccggcggcaggtcaccgtg5100

gcccctgcctcgggcctcccccacaaggaagaagctggaaagggcagtgccttagggacc5160

cctgctgcagctgagccagtgacccccaccagcaaagcaggctcaggtgcaccagggggc5220

accagcaagggccccgccgaggagtccagagtgaggaggcacaagcactcctctgagtcg5280

ccagggagggacaaggggaaattgtccaggctcaaacctgccccgccgcccccaccagca5340

gcctctgcagggaaggctggaggaaagccctcgcagagcccgagccaggaggcggccggg5400

gaggcagtcctgggcgcaaagacaaaagccacgagtctggttgatgctgtgaacagtgac5460

gctgccaagcccagccagccgggagagggcctcaaaaagcccgtgctcccggccactcca5520

aagccacagtccgccaagccgtcggggacccccatcagcccagcccccgttccctccacg5580

ttgccatcagcatcctcggccctggcaggggaccagccgtcttccaccgccttcatccct5640

ctcatatcaacccgagtgtctcttcggaaaacccgccagcctccagagcggatcgccagc5700

ggcgccatcaccaagggcgtggtcctggacagcaccgaggcgctgtgcctcgccatctct5760

aggaactccgagcagatggccagccacagcgcagtgctggaggccggcaaaaacctctac5820

acgttctgcgtgagctatgtggattccatccagcaaatgaggaacaagtttgccttccga5880

gaggccatcaacaaactggagaataatctccgggagcttcagatctgcccggcgacagca5940

ggcagtggtccggcggccactcaggacttcagcaagctcctcagttcggtgaaggaaatc6000

agtgacatagtgcagaggtag6021

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<223>人bcr-abl基因的锌指核酸酶作用的特异靶位点

<400>2

ggcgtcgacggcgactacgaggacgccgag30

<210>3

<211>375

<212>dna

<213>人工序列

<223>zfp-l

<400>3

gtcgacctggagcccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagc60

gactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgc120

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accggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgaccccggcgcc240

ctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggc300

aagagcttcagcgactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccacaccggcaagaag360

accagctgcggccgc375

<210>4

<211>375

<212>dna

<213>人工序列

<223>zfp-r

<400>4

gtcgacctggagcccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagc60

cgcagcgacaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgc120

cccgagtgcggcaagagcttcagcgactgccgcgacctggcccgccaccagcgcacccac180

accggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggcaagagcttcagcgaccccggcaac240

ctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcgagaagccctacaagtgccccgagtgcggc300

aagagcttcagccgcagcgacaacctggtgcgccaccagcgcacccacaccggcaagaag360

accagctgcggccgc375

<210>5

<211>78

<212>dna

<213>人工序列

<223>foki-senceprimer

<400>5

aaggaaaaaagcggccgcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgccctggtgaag60

agcgagctggaggagaag78

<210>6

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<223>foki-antisenceprimer

<400>6

ccgctcgagtcagaagttgatctcgccgttgttgaacttgcgccgc46

<210>7

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<223>donor-l-f

<400>7

cggggtacccagcgatggggcttccggcg29

<210>8

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<223>donor-l-r

<400>8

aaggaaaaaagcggccgcgggttcaactcggcgtcctcgtagtcg45

<210>9

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<223>donor-r-f

<400>9

aaggaaaaaagcggccgcccgcttcctgaaggacaacctgatcg44

<210>10

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<223>donor-r-r

<400>10

gctctagagccaggattcccgacaggacccattttc36

<210>11

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<223>senceprimer

<400>11

gacgccgagaagcccttc18

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>anti-senceprimer

<400>12

aatcctcaaaactccggggg20