本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
胆固醇可作为人体脂类代谢检测的重要指标。血液中的胆固醇和甘油三酯一般与蛋白质结合，以脂蛋白的形式存在。脂蛋白包括：乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)，其中低密度脂蛋白主要负责将胆固醇运输至外周组织，而高密度脂蛋白是清除动脉壁上的胆固醇向肝脏运输。
流行病学及临床研究证明HDL-C与冠心病、动脉粥样硬化等疾病发生机率呈负相关，作为脂类代谢异常的危险因素之一。根据我国《血脂异常防治建议》提出的判断标准，HDL-C的理想范围为：>1.04mmol/L(>40mg/dL)。当高密度脂蛋白胆固醇浓度降低时，心血管疾病的危险性增加。高密度脂蛋白胆固醇浓度偏高的原因可能是由于原发性高密度脂蛋白血症，也可能是由于体力劳动透支、注射雌激素胰岛素、服用避孕药等，也可能是由于慢性肝炎、肝硬化、酒精中毒性肝损伤、脂肪肝等疾病。因此，高密度脂蛋白胆固醇是一个重要的中间指标，在临床上可用于高胆固醇血症、冠心病和动脉粥样硬化的辅助诊断。
高密度脂蛋白胆固醇的传统检测方法包括离心法、电泳法和沉淀法等，但存在操作较繁琐、检测结构不够准确等缺点。随着检测技术的快速发展，高密度脂蛋白胆固醇已实现了全自动化检测，高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒被开发并得到广泛的应用。中国专利申请CN 105137098公开了一种血清高密度脂蛋白中胆固醇的测定试剂，包括高亲和性酶化合物、稳定剂、色原、表面活性剂、牛血清白蛋白和防腐剂，使用EDTA-Na和β-环糊精的组合物作为稳定剂，通过特定的制备方法提高酶的活性，提高了测定试剂的灵敏度，但酶的处理过程较繁琐。中国专利申请CN 105255993公开了一种测定样品中高密度脂蛋白胆固醇含量的方法和试剂盒，该试剂盒包括试剂1、试剂2和说明书，试剂1包括：聚乙烯硫酸三钾、聚乙二醇独甲醚、α-环糊精硫酸盐；试剂2包括：胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、HDAOS、至少一种表面活性剂；该试剂盒的检测结果与对照试剂具有良好的相关性。
高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒中用到的酶试剂的活性容易受到pH、温度、化学试剂的干扰，从而导致检测试剂存在稳定性差的问题，影响临床的稳定使用。因此，提供一种检测稳定的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒具有重要意义。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的问题(试剂的稳定性较差、酶的处理过程较繁琐等)，本发明提供一种高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，试剂的稳定性好，无需对酶进行复杂的处理，成本较低，可以实现对高密度脂蛋白胆固醇的准确检测，与上市产品的检测结果无明显差异。
本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
本发明提供一种高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括如下组分及其浓度：2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液5～20g/L、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3'5-二甲氧基苯胺钠(DAOS)0.05～0.2g/L、萘磺酸甲醛聚合物(DEMOL T-45)：1～10g/L；所述试剂R2包括如下组分及其浓度：2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液5～20g/L、4-氨基安替比林(4AAP)0.1～1g/L、胆固醇酯酶1～10KU/L、胆固醇氧化酶(CO)1～10KU/L、过氧化物酶(POD)1～10KU/L、氯化镁或六水合氯化镁1～10g/L。
优选地，所述试剂R1包括如下组分及其浓度：2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液10～15g/L、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3'5-二甲氧基苯胺钠0.08～0.15g/L、萘磺酸甲醛聚合物4～8g/L；所述试剂R2包括如下组分及其浓度：2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液10～15g/L、4-氨基安替比林0.2～0.8g/L、胆固醇酯酶1～5KU/L、胆固醇氧化酶1～5KU/L、过氧化物酶4～8KU/L、六水合氯化镁4～10g/L。
更优选地，所述试剂R1包括如下组分及其浓度：2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液12g/L、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3'5-二甲氧基苯胺钠0.1g/L、萘磺酸甲醛聚合物5g/L；所述试剂R2包括如下组分及其浓度：2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液12g/L、4-氨基安替比林0.5g/L、胆固醇酯酶3KU/L、胆固醇氧化酶3KU/L、过氧化物酶6KU/L、六水合氯化镁5g/L。
优选地，所述试剂R1还包括：NaOH 1～5g/L、山梨酸钾0.5～2g/L；所述试剂R2还包括：NaOH 1～5g/L、山梨酸钾0.5～2g/L、聚氧乙烯硬化蓖麻油5～20g/L。
优选地，所述试剂R1还包括：NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L；所述试剂R2还包括：NaOH2g/L、山梨酸钾1g/L、聚氧乙烯硬化蓖麻油10g/L。
优选地，还包括人血清标准品。
此外，本发明还提供高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：分离血清样品，向血清样品中加入试剂R2，混匀，孵育3～5min后，于540nm～600nm波长下检测吸光度值A1，然后加入试剂R1，混匀，孵育3～5min后，于540nm～600nm波长下检测吸光度值A2，通过血清标准品数据计算高密度脂蛋白胆固醇的含量。
检测过程中，反应分二步进行：血清中含载脂蛋白B(APOB)的脂蛋白(LDL、IDL、VLDL、CM和lpa)首先与试剂R2中的酶反应而被清除，因缺乏色原而不显色；然后加入试剂R1，试剂中的特异性表面活性剂释放高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)中的胆固醇，与酶试剂作用形成完整的Trinder反应而显色。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：发明人首先对现有的检测试剂进行改进得到检测结果准确性好的配方一，并发现配方一的稳定性不够理想(经破坏性实验后酶的活性以及检测结果显著降低，通过补加实验发现是由于胆固醇氧化酶的失活)，进而通过大量实现发现在试剂R2中加入一定量的氯化镁可以显著增强胆固醇氧化酶的活性，从而实现高密度脂蛋白胆固醇的稳定检测，于2～8度条件的保质期长达18个月，且不会对检测造成干扰，成本较低，与现有上市产品的检测结果无明显差异。
附图说明
图1配方一的反应曲线图。
图2配方二的反应曲线图。
图3配方六的反应曲线图。
图4配方七的反应曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明中，所涉及的组分均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。
实施例一 高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒(配方二)
高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括如下组分及其浓度：2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液12g/L、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3'5-二甲氧基苯胺钠0.1g/L、萘磺酸甲醛聚合物5g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L；所述试剂R2包括如下组分及其浓度：2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液12g/L、4-氨基安替比林0.5g/L、胆固醇酯酶3KU/L、胆固醇氧化酶3KU/L、过氧化物酶6KU/L、六水合氯化镁5g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、聚氧乙烯硬化蓖麻油10g/L。
实施例二 高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒
高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2和人血清标准品，所述试剂R1包括如下组分及其浓度：2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液15g/L、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3'5-二甲氧基苯胺钠0.15g/L、萘磺酸甲醛聚合物8g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L；所述试剂R2包括如下组分及其浓度：2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液15g/L、4-氨基安替比林0.8g/L、胆固醇酯酶5KU/L、胆固醇氧化酶5KU/L、过氧化物酶8KU/L、六水合氯化镁8g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、聚氧乙烯硬化蓖麻油20g/L。
实施例三 高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒
高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括如下组分及其浓度：2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液10g/L、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3'5-二甲氧基苯胺钠0.08g/L、萘磺酸甲醛聚合物4g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L；所述试剂R2包括如下组分及其浓度：2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液10g/L、4-氨基安替比林0.2g/L、胆固醇酯酶1KU/L、胆固醇氧化酶1KU/L、过氧化物酶4KU/L、六水合氯化镁4g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、聚氧乙烯硬化蓖麻油5g/L。
对比例1 高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒(配方一)
高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括如下组分及其浓度：2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液12g/L、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3'5-二甲氧基苯胺钠0.1g/L、萘磺酸甲醛聚合物5g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L；所述试剂R2包括如下组分及其浓度：2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液12g/L、4-氨基安替比林0.5g/L、胆固醇酯酶3KU/L、胆固醇氧化酶3KU/L、过氧化物酶6KU/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、聚氧乙烯硬化蓖麻油10g/L。
配方一与配方二的区别在于：不含氯化镁。
试验例一 不同检测试剂的样品检测对比
实验试剂：上述配方一和配方二，以及广州科方生物技术有限公司生产的HDL-C测定试剂盒(包括试剂R1和R2，但成分与本发明不同，以下简称为市售组)。分别将上述实验试剂用于高密度脂蛋白胆固醇的检测，用奥林巴斯AU400生化分析仪同时定标同时测定40例血清样品，结果如表1所示。
表1不同检测试剂测定40例血清样品的结果(单位：mmol/L)
经统计，市售组测定结果与配方一测定结果的相关系数r＝0.9991、市售组测定结果与配方二测定结果相关系数r＝0.9991、配方一测定结果与配方二测定结果相关系数r＝0.9998，说明相关性良好，试剂R2中加入5g/L六水合氯化镁不会对检测结果造成干扰，配方一和配方二与经国家食品药品监督管理局批准上市的产品无明显差异，结果准确可靠。
试验例二 不同检测试剂的加速稳定性考察
对配方一和配方二进行37度加速破坏性实验，以考察其组分的稳定性，结果如表2所示。
表2配方一和配方二经加速破坏性实验1周后的样品检测结果(单位：mmol/L)
37度加速破坏性实验：指把试剂装在瓶子里并密封保存，放在37度水浴箱里面，进行加速破坏性实验，37度破坏性实验1周的时间相当于一般储存温度(2～8度)保存1年。
从表2可知，未加速时，配方一的40例样品检测结果平均值为1.49，配方二的检测结果平均值为1.50，与配方一基本相当；经37度加速破坏性实验1周后，配方一的检测结果平均值为0.74，配方二的检测结果平均值为1.48。
配方一经破坏性实验1周后的样品检测结果均显著下降，平均下降幅度达到了50％，而配方二由于含量一定量的氯化镁作为保护剂，经破坏性实验1周后的样品检测结果并未发生明显变化，平均下降幅度仅为1.2％，属于合理范围。平均下降幅度＝(未加速时的均值－加速1周的均值)/未加速时的均值。
此外，本发明提供的试剂盒(配方二)于2～8度条件保存18个月后，进行40例样品检测的平均结果与保存0个月的平均结果相比仅下降1.9％，属于合理范围，仍能实现准确的检测。
为考察配方一经37度加速1周后的检测结果显著下降的具体原因，进行以下实验：分别在配方一经过37度加速1周后的R1和R2中分别补加其主要组分DEMOL T-45或胆固醇氧化酶，加入量分别为相应初始浓度的50％，然后分别检测试剂1至试剂4的结果如表3所示。
试剂1：R1和R2都未经加速；
试剂2：R1和R2均经37度加速1周；
试剂3：R1和R2均37度加速1周，并在R1中补加入2.5g/L DEMOL T-45；
试剂4：R1和R2均37度加速1周，并在R2中补加入1.5KU/L胆固醇氧化酶。
表3试剂1至试剂4的样品检测结果(单位：mmol/L)
从表3可知：1.试剂2(不补加DEMOL T-45和胆固醇氧化酶)经加速实验后测值与试剂1有明显差异；2.试剂3(单独补加入DEMOL T-45)经加速实验后测值与试剂1有明显差异，与试剂2测值基本一致，说明试剂R1中DEMOL T-45没有失活；3.试剂4(单独补加入胆固醇氧化酶)经加速实验后测值与试剂1无明显差异，与试剂2的测值相比有明显增加，说明试剂R2中胆固醇氧化酶有明显失活。
进一步，通过活性测定法分别检测配方一的R2试剂和配方二的R2试剂在未加速和37度加速1周时的胆固醇氧化酶的活力，各检测20次，结果如表4和表5所示。
表4配方一的R2试剂检测的CO活力(单位：KU/L)
表5配方二的R2试剂检测的CO活力
从表4和表5可以看出，配方一经加速1周，CO失活严重，失活比例达到了48.8％，而配方二由于加入一定量的六水合氯化镁作为保护剂后CO失活仅为2.0％，说明六水合氯化镁对CO有较好的保护作用。
试验例三 保护剂六水合氯化镁在试剂R2中的用量考察
配方一如下：R1:MES 12g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、DAOS 0.1g/L、DEMOL T-45 5g/L；R2:MES 12g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、4AAP 0.5g/L、胆固醇酯酶3KU/L、胆固醇氧化酶(CO)3KU/L、POD 6KU/L、EMANON CH-40 10g/L。
配方二如下：R1:MES 12g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、DAOS 0.1g/L、DEMOL T-45 5g/L；R2:MES 12g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、4AAP 0.5g/L、胆固醇酯酶3KU/L、胆固醇氧化酶(CO)3KU/L、POD 6KU/L、EMANON CH-40 10g/L、六水合氯化镁5g/L。
配方三如下：R1:MES 12g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、DAOS 0.1g/L、DEMOL T-45 5g/L；R2:MES 12g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、4AAP 0.5g/L、胆固醇酯酶3KU/L、胆固醇氧化酶(CO)3KU/L、POD 6KU/L、EMANON CH-40 10g/L、六水合氯化镁1g/L。
配方四如下：R1:MES 12g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、DAOS 0.1g/L、DEMOL T-45 5g/L；R2:MES 12g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、4AAP 0.5g/L、胆固醇酯酶3KU/L、胆固醇氧化酶(CO)3KU/L、POD 6KU/L、EMANON CH-40 10g/L、六水合氯化镁2g/L。
配方五如下：R1:MES 12g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、DAOS 0.1g/L、DEMOL T-45 5g/L；R2:MES 12g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、4AAP 0.5g/L、胆固醇酯酶3KU/L、胆固醇氧化酶(CO)3KU/L、POD 6KU/L、EMANON CH-40 10g/L、六水合氯化镁10g/L。
配方六如下：R1:MES 12g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、DAOS 0.1g/L、DEMOL T-45 5g/L；R2:MES 12g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、4AAP 0.5g/L、胆固醇酯酶3KU/L、胆固醇氧化酶(CO)3KU/L、POD 6KU/L、EMANON CH-40 10g/L、六水合氯化镁15g/L。
配方七如下：R1:MES 12g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、DAOS 0.1g/L、DEMOL T-45 5g/L；R2:MES 12g/L、NaOH 2g/L、山梨酸钾1g/L、4AAP 0.5g/L、胆固醇酯酶3KU/L、胆固醇氧化酶(CO)3KU/L、POD 6KU/L、EMANON CH-40 10g/L、六水合氯化镁20g/L。
为考察保护剂六水合氯化镁在试剂R2中的用量，通过活性测定法分别检测配方一至配方七在未加速和37度加速1周时CO的活力，结果如表6所示。
表6配方一至配方七在未加速和37度加速1周时CO的活力(单位：KU/L)
从表6可以看出，配方一的CO失活严重，失活比例达到了49.0％，分别加入保护剂六水合氯化镁1g/L、2g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L后分别为：35.4％，21.2％，1.0％，1.7％，2.7％，2.4％。说明保护剂六水合氯化镁在试剂R2中的加样量1～20g/L时均能起到一定的保护作用，但加样量为1～2g/L时，保护效果不是很理想。
此外，分别对配方一至配方七的配方反应曲线进行检测，配方一至配方五反应迅速，而配方六与配方七反应较慢，配方一的反应曲线如图1所示，配方二的反应曲线如图2所示，配方六的反应曲线如图3所示，配方七的反应曲线如图4所示。说明六水合氯化镁的加入量超过10g/L时会对配方中成份产生一定的抑制，导致反应不能迅速进行。
因此，配方二(氯化镁的加入量为5g/L)的综合效果最佳。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。