本发明涉及氨基酸制备领域，具体地指一种L-半胱氨酸的生物转化方法。
背景技术：
L-半胱氨酸及其复合体在医疗方面的功效，已日渐引起关注，近年来的研究认为L-半胱氨酸主要有以下几种生理功能：1.在生物体内L-半胱氨酸对许多有害物质和毒素如甲醛、乙醛、氯仿、四氯化碳、铅、镉、氯化汞、过氧化酯和河豚毒素等具有有效的解毒作用；2.用L-半胱氨酸可以有效地预防和改善放射性物质对机体的伤害；3.当发生炎症或过敏时，机体内胆碱酯酶等巯基酶的活性降低，补给L-半胱氨酸可维持巯基酶的活性，改善炎症和过敏的皮肤症状；4.由于L-半胱氨酸具有软化和溶解角质的作用，所以L-半胱氨酸对角质肥厚的皮肤病也有效；5.L-半胱氨酸在皮肤蛋白的角蛋白生成中就维持巯基酶的活性，并且可以补充巯基，维持皮肤的正常代谢；6.L-半胱氨酸还具有防止生物体衰老的功能。
L-半胱氨酸在食品工业中的应用包括如下方面：1.食品增香剂与发色剂；2.面包添加剂；3.油脂抗氧化和保鲜剂；4.防止食品褐变。除此之外，研究表明，色素细胞中所含有的L-半胱氨酸的巯基具有还原能力和化学反应活性，可调节黑色素的生成另外当人的皮肤表面由于肝功能病变产生肝斑时，L-半胱氨酸也有还原黑色素、消除已经沉着的黑色素的性能。根据这些研究，采取增加表皮最下层部分的L-半胱氨酸含量就可满足人们对美白的要求，在美白化妆品中添加L-半胱氨酸，涂于表皮的L-半胱氨酸被表皮吸收，增加了表皮最下层部分的L-半胱氨酸含量。L-半胱氨酸还应用于高级卷发液、饲料、生物电化学等多个领域。
目前国内主要工艺为毛发水解后还原法，但是，其原料来源受限，能耗高，生产过程中，产生大量刺激性气体、废酸，环境污染严重。DL-ATC代谢途径法，工艺复杂，成本高，因此，研发出一种成本低、排污少、适合工业化生产的L-半胱氨酸的转化方法显得很有意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的问题就是要提供一种L-半胱氨酸的生物转化方法，该方法在保证高立体选择性、高转化率和高收率的基础上，能简化生产工艺和降低生产成本。
为解决上述技术问题，本发明所提供的一种L-半胱氨酸的生物转化方法，包括：以3-氯-丙酮酸为底物与溶剂构成反应体系，再向所述反应体系中加入生物催化剂、辅酶、添加剂和铵盐进行生物转化反应，得到含有3-氯-L-丙氨酸的转化液，提纯，得到3-氯-L-丙氨酸晶体，再以所得的3-氯-L-丙氨酸晶体与硫氢化钠为底物，以L-半胱氨酸脱巯基酶为催化剂，通过β-取代反应生成L-半胱氨酸。
优选地，生物催化剂为来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞；所述辅酶为NADP+，所述铵盐为甲酸铵。
进一步地，来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源3-氯-L-丙氨酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源甲酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
进一步地，溶剂为缓冲溶液，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的一种。
进一步地，添加剂为丁二醇、乳酸钠、葡萄皮提取粉和螺旋藻粉按重量比为3-5︰1.5-2.5︰1-3︰1组成的混合物。
进一步地，葡萄皮提取粉的制备方法为：将酿酒用葡萄剩余的皮渣经水洗，皮籽分离，所得葡萄皮在80℃下干燥6-8h后粉碎，过30目筛，得到葡萄皮提取粉。
进一步地，转化体系的pH值控制为6-8，控制所述转化体系的温度为20-50℃；所述转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为150-250r/min。
进一步地，转化体系的pH值控制为6-7，所述转化体系的温度控制为20-40℃；所述转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为180-220r/min。
进一步地，生物催化剂的浓度控制为10-30g/L；所述添加剂与生物催化剂的质量比控制为1-5％。
进一步地，生物催化剂的浓度控制为20-25g/L；所述添加剂与生物催化剂的质量比控制为2.5-5％。
生物催化剂为来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞，制备方法是：选择来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；将该序列通过全基因合成，全基因合成的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶编码基因经NcoI和BamHI双酶切后克隆入表达载体pETDuet-1的多克隆位点1，得到重组质粒1；选择Candida boidinii的甲酸脱氢酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；将该序列通过全基因合成，全基因合成的甲酸脱氢酶经NdeI和XhoI双酶切后克隆入重组质粒1的多克隆位点2，基因经测序确认后，转化至E.coli BL21(DE3)，置于氨苄青霉素平板上挑选单菌落，接入含氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含氨苄青霉素的TB培养基中，接种量为含氨苄青霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞。
L-半胱氨酸脱巯基酶可为商业购买，也可为鼠伤寒沙门氏菌湿菌体或产气肠杆菌湿菌体，或从鼠伤寒沙门氏菌或产气肠杆菌中纯化的L-半胱氨酸脱巯基酶，或从阴沟肠杆菌中分离得到L-半胱氨酸脱巯基酶，如Yamada H，Kumagai H，Seejima S.Elimination and replacement reactions ofβ-chloro-L-alanine by cysteine desulfhydrase from Aerobacter aerogenes.[J]Agric Boil Chem,1977,41(10):2071.所述。
本发明在生物转化过程中利用HPLC-MS和HPLC进行监控，直至底物完全利用。
本发明的优点主要体现在如下几方面：
其一，本发明工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产；
其二，本发明L-半胱氨酸晶体纯度达到98％以上，光学纯度为99％以上；
其三，本发明生物催化剂为来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞，催化效果好，用量少，专一高效；
其四，本发明解决了3-氯-L-丙氨酸价格昂贵而导致从3-氯-L-丙氨酸经L-半胱氨酸脱巯基酶催化得到L-半胱氨酸不能进行工业化生产的问题；
其五，本发明丁二醇、乳酸钠、葡萄皮提取物和螺旋藻粉复配作为添加剂，丁二醇、乳酸钠能吸附水分子进而在酶表面形成水化膜，增强酶活，葡萄皮提取物和螺旋藻粉具有很好的抗氧化性，丁二醇、乳酸钠、葡萄皮提取物和螺旋藻粉复配，可以缩短L-半胱氨酸的转化时间，L-半胱氨酸的收率也显著提高。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但该实施例不应该理解为对本发明的限制。
L-半胱氨酸的生物转化方法，包括：以3-氯-丙酮酸为底物与溶剂构成反应体系，再向所述反应体系中加入生物催化剂、辅酶、添加剂和铵盐进行生物转化反应，得到含有3-氯-L-丙氨酸的转化液，提纯，得到3-氯-L-丙氨酸晶体，再以所得的3-氯-L-丙氨酸晶体和硫氢化钠为底物，以L-半胱氨酸脱巯基酶为催化剂，通过β-取代反应生成L-半胱氨酸。
优选地，生物催化剂为来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞；所述辅酶为NADP+，所述铵盐为甲酸铵。
进一步地，来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源3-氯-L-丙氨酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源甲酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
进一步地，溶剂为缓冲溶液，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的一种。
进一步地，添加剂为丁二醇、乳酸钠、葡萄皮提取粉和螺旋藻粉按重量比为3-5︰1.5-2.5︰1-3︰1组成的混合物。
进一步地，葡萄皮提取粉的制备方法为：将酿酒用葡萄剩余的皮渣经水洗，皮籽分离，所得葡萄皮在80℃下干燥6-8h后粉碎，过30目筛，得到葡萄皮提取粉。
进一步地，转化体系的pH值控制为6-8，控制所述转化体系的温度为20-50℃；所述转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为150-250r/min。
进一步地，转化体系的pH值控制为6-7，所述转化体系的温度控制为20-40℃；所述转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为180-220r/min。
进一步地，生物催化剂的浓度控制为10-30g/L；所述添加剂与生物催化剂的质量比控制为1-5％。
进一步地，生物催化剂的浓度控制为20-25g/L；所述添加剂与生物催化剂的质量比控制为2.5-5％。
生物催化剂为来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞，制备方法是：选择来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；将该序列通过全基因合成，全基因合成的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶编码基因经NcoI和BamHI双酶切后克隆入表达载体pETDuet-1的多克隆位点1，得到重组质粒1；选择Candida boidinii的甲酸脱氢酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；将该序列通过全基因合成，全基因合成的甲酸脱氢酶经NdeI和XhoI双酶切后克隆入重组质粒1的多克隆位点2，基因经测序确认后，转化至E.coli BL21(DE3)，置于氨苄青霉素平板上挑选单菌落，接入含氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含氨苄青霉素的TB培养基中，接种量为含氨苄青霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞。
L-半胱氨酸脱巯基酶可为商业购买，也可为鼠伤寒沙门氏菌湿菌体或产气肠杆菌湿菌体，或从鼠伤寒沙门氏菌或产气肠杆菌中纯化的L-半胱氨酸脱巯基酶，或从阴沟肠杆菌中分离得到L-半胱氨酸脱巯基酶，如Yamada H，Kumagai H，Seejima S.Elimination and replacement reactions ofβ-chloro-L-alanine by cysteine desulfhydrase from Aerobacter aerogenes.[J]Agric Boil Chem,1977,41(10):2071.所述。
实施例1
L-半胱氨酸的制备过程，包括如下步骤：
L-半胱氨酸的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的3-氯-丙酮酸为底物，以MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)为溶剂，以23g/L的来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞为催化剂，来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源3-氯-L-丙氨酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源甲酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。加入辅酶NADP+和60g的甲酸铵和0.2415g添加剂进行转化反应，得到含有3-氯-L-丙氨酸的转化液，提纯，得到3-氯-L-丙氨酸晶体，再以3-氯-L-丙氨酸晶体和硫氢化钠为底物，以L-半胱氨酸脱巯基酶为催化剂，通过β-取代反应生成L-半胱氨酸。其中，添加剂为0.1144g的丁二醇、0.0508g的乳酸钠、0.0508g的葡萄皮提取粉和0.0255g的螺旋藻粉组成的混合物。葡萄皮提取粉的制备方法为：将酿酒用葡萄剩余的皮渣经水洗，皮籽分离，所得葡萄皮在80℃下干燥6-8h后粉碎，过30目筛，得到葡萄皮提取粉。转化体系的pH值控制为6.5，控制所述转化体系的温度为25℃；所述转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为200r/min。
转化时间为26.8h，转化率为86.2％，对含有L-半胱氨酸的转化液进行纯化，纯化后，L-半胱氨酸晶体纯度达到99.5％，光学纯度为99.8％。
实施例2
L-半胱氨酸的制备过程，包括如下步骤：
L-半胱氨酸的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的3-氯-丙酮酸为底物，以碳酸盐缓冲溶液为溶剂，以25g/L的来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞为催化剂，来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源3-氯-L-丙氨酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源甲酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。加入辅酶NADP+和60g的甲酸铵和0.375g添加剂进行转化反应，得到含有3-氯-L-丙氨酸的转化液，提纯，得到3-氯-L-丙氨酸晶体，再以3-氯-L-丙氨酸晶体和硫氢化钠为底物，以L-半胱氨酸脱巯基酶为催化剂，通过β-取代反应生成L-半胱氨酸。其中，添加剂为0.1736g的丁二醇、0.0799g的乳酸钠、0.0868g的葡萄皮提取粉和0.0347g的螺旋藻粉组成的混合物。葡萄皮提取粉的制备方法为：将酿酒用葡萄剩余的皮渣经水洗，皮籽分离，所得葡萄皮在80℃下干燥6-8h后粉碎，过30目筛，得到葡萄皮提取粉。转化体系的pH值控制为6，控制所述转化体系的温度为20℃；所述转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为180r/min。
转化时间为28.1h，转化率为84.1％，对含有L-半胱氨酸的转化液进行纯化，纯化后，L-半胱氨酸晶体纯度达到98.9％，光学纯度为99.6％。
实施例3
L-半胱氨酸的制备过程，包括如下步骤：
L-半胱氨酸的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的3-氯-丙酮酸为底物，以磷酸盐缓冲溶液为溶剂，以20g/L的来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞为催化剂，来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源3-氯-L-丙氨酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源甲酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，加入辅酶NADP+和60g的甲酸铵和0.15g添加剂进行转化反应，得到含有3-氯-L-丙氨酸的转化液，提纯，得到3-氯-L-丙氨酸晶体，再以3-氯-L-丙氨酸晶体和硫氢化钠为底物，以L-半胱氨酸脱巯基酶为催化剂，通过β-取代反应生成L-半胱氨酸。其中，添加剂为0.0723g的丁二醇、0.0325g的乳酸钠、0.0271g的葡萄皮提取粉和0.0181g的螺旋藻粉组成的混合物。葡萄皮提取粉的制备方法为：将酿酒用葡萄剩余的皮渣经水洗，皮籽分离，所得葡萄皮在80℃下干燥6-8h后粉碎，过30目筛，得到葡萄皮提取粉。转化体系的pH值控制为6，控制所述转化体系的温度为40℃；所述转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为220r/min。
转化时间为29.3h，转化率为82.2％，对含有L-半胱氨酸的转化液进行纯化，纯化后，L-半胱氨酸晶体纯度达到98.5％，光学纯度为99.5％。
实施例4
L-半胱氨酸的制备过程，包括如下步骤：
L-半胱氨酸的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的3-氯-丙酮酸为底物，以Tri-HCl缓冲溶液为溶剂，以30g/L的来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞为催化剂，来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源3-氯-L-丙氨酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源甲酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。加入辅酶NADP+和60g的甲酸铵和0.36g添加剂进行转化反应，得到含有3-氯-L-丙氨酸的转化液，提纯，得到3-氯-L-丙氨酸晶体，再以所得的3-氯-L-丙氨酸和硫氢化钠晶体为底物，以L-半胱氨酸脱巯基酶为催化剂，通过β-取代反应生成L-半胱氨酸。其中，添加剂为0.14g的丁二醇、0.06g的乳酸钠、0.12g的葡萄皮提取粉和0.04g的螺旋藻粉组成的混合物。葡萄皮提取粉的制备方法为：将酿酒用葡萄剩余的皮渣经水洗，皮籽分离，所得葡萄皮在80℃下干燥6-8h后粉碎，过30目筛，得到葡萄皮提取粉。转化体系的pH值控制为7.5，控制所述转化体系的温度为30℃；所述转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为250r/min。
转化时间为30.5h，转化率为78.4％，对含有L-半胱氨酸的转化液进行纯化，纯化后，L-半胱氨酸晶体纯度达到98.1％，光学纯度为99.4％。
实施例5
L-半胱氨酸的制备过程，包括如下步骤：
L-半胱氨酸的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的3-氯-丙酮酸为底物，以柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液为溶剂，以10g/L的来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞为催化剂，来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源3-氯-L-丙氨酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源甲酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。加入辅酶NADP+和60g的甲酸铵和0.03g添加剂进行转化反应，得到含有3-氯-L-丙氨酸的转化液，提纯，得到3-氯-L-丙氨酸晶体，再以所得的3-氯-L-丙氨酸晶体和硫氢化钠为底物，以L-半胱氨酸脱巯基酶为催化剂，通过β-取代反应生成L-半胱氨酸。其中，添加剂为0.012g的丁二醇、0.01g的乳酸钠、0.004g的葡萄皮提取粉和0.004g的螺旋藻粉组成的混合物。葡萄皮提取粉的制备方法为：将酿酒用葡萄剩余的皮渣经水洗，皮籽分离，所得葡萄皮在80℃下干燥6-8h后粉碎，过30目筛，得到葡萄皮提取粉。转化体系的pH值控制为8，控制所述转化体系的温度为50℃；所述转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为150r/min。
转化时间为31.7h，转化率为77.3％，对含有L-半胱氨酸的转化液进行纯化，纯化后，L-半胱氨酸晶体纯度达到98.0％，光学纯度为99.2％。
对比例1
L-半胱氨酸的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的3-氯-丙酮酸为底物，以MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)为溶剂，以23g/L的来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞为催化剂，来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源3-氯-L-丙氨酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源甲酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。加入辅酶NADP+和60g的甲酸铵进行转化反应，得到含有3-氯-L-丙氨酸的转化液，提纯，得到3-氯-L-丙氨酸晶体，再以所得的3-氯-L-丙氨酸晶体和硫氢化钠为底物，以L-半胱氨酸脱巯基酶为催化剂，通过β-取代反应生成L-半胱氨酸。转化体系的pH值控制为6.5，控制所述转化体系的温度为25℃；所述转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为200r/min。
转化时间为41.7h，转化率为66.4％，对含有L-半胱氨酸的转化液进行纯化，纯化后，L-半胱氨酸晶体纯度达到97.6％，光学纯度为99.0％。
对比例2
L-半胱氨酸的制备过程，包括如下步骤：
L-半胱氨酸的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的3-氯-丙酮酸为底物，以MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)为溶剂，以23g/L的来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌全细胞为催化剂，来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源3-氯-L-丙氨酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述来源于Saccharomyces cerevisiae的3-氯-L-丙氨酸脱氢酶、来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶共表达的基因工程菌中外源甲酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。加入辅酶NADP+和60g的甲酸铵和0.2415g添加剂进行转化反应，得到含有3-氯-L-丙氨酸的转化液，提纯，得到3-氯-L-丙氨酸晶体，再以所得的3-氯-L-丙氨酸晶体和硫氢化钠为底物，以L-半胱氨酸脱巯基酶为催化剂，通过β-取代反应生成L-半胱氨酸。其中，添加剂为丁二醇。葡萄皮提取粉的制备方法为：将酿酒用葡萄剩余的皮渣经水洗，皮籽分离，所得葡萄皮在80℃下干燥6-8h后粉碎，过30目筛，得到葡萄皮提取粉。转化体系的pH值控制为6.5，控制所述转化体系的温度为25℃；所述转化反应在摇床中进行，所述摇床的转速控制为200r/min。
转化时间为37.4h，转化率为69.6％，对含有L-半胱氨酸的转化液进行纯化，纯化后，L-半胱氨酸晶体纯度达到97.7％，光学纯度为99.1％。
对比例3
L-半胱氨酸的制备过程，添加剂为乳酸钠，其他制备条件如对比例2。
转化时间为38.8h，转化率为72.7％，对含有L-半胱氨酸的转化液进行纯化，纯化后，L-半胱氨酸晶体纯度达到96.9％，光学纯度为99.0％。
对比例4
L-半胱氨酸的制备过程，添加剂为葡萄皮提取粉，葡萄皮提取粉的制备方法为：将酿酒用葡萄剩余的皮渣经水洗，皮籽分离，所得葡萄皮在80℃下干燥6-8h后粉碎，过30目筛，得到葡萄皮提取粉。其他制备条件如对比例2。
转化时间为36.8h，转化率为73.3％，对含有L-半胱氨酸的转化液进行纯化，纯化后，L-半胱氨酸晶体纯度达到96.6％，光学纯度为99.1％。
对比例5
L-半胱氨酸的制备过程，添加剂为螺旋藻粉，其他制备条件如对比例2。
转化时间为35.9h，转化率为72.8％，对含有L-半胱氨酸的转化液进行纯化，纯化后，L-半胱氨酸晶体纯度达到96.5％，光学纯度为99.0％。
实施例1与对比例1中，L-半胱氨酸脱巯基酶均使用产气肠杆菌(Aerobacter aerogenes)野生菌，使用浓度一致。实施例1与对比例1对比可知，当转化体系中加入添加剂时，转化时间明显缩短，L-半胱氨酸的收率也显著提升，纯化后的L-半胱氨酸晶体的品质也显著改善。实施例1与对比例2、对比例3、对比例4、对比例5对比可知，添加剂为丁二醇、乳酸钠、葡萄皮提取物和螺旋藻粉复配组成的混合物与单一添加丁二醇、乳酸钠、葡萄皮提取物或螺旋藻粉相比，转化时间明显缩短，L-半胱氨酸的收率也显著提升，纯化后的L-半胱氨酸晶体的品质也显著改善，丁二醇、乳酸钠、葡萄皮提取物和螺旋藻粉复配添加转化达到了意想不到的技术效果。
本说明书中未作详细描述的内容，属于本专业技术人员公知的现有技术。
<110> 武汉茵茂特生物技术有限公司
<120> L-半胱氨酸的生物转化方法
<160> 2
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<110> 武汉茵茂特生物技术有限公司
<120> L-半胱氨酸的生物转化方法
<160> 2
<211> 1092
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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