本发明涉及肿瘤学和诊断领域。更具体地，本发明涉及一种转移性乳腺癌标记物及其在诊断和治疗中的应用。
背景技术
乳腺癌的远端转移是导致乳腺癌治疗失败和患者死亡的主要原因。乳腺癌主要的远端转移靶器官是骨和肺。临床上的一个重要现象是乳腺癌的转移具有器官特异性，即一部分病人从原位瘤发生侵袭迁移的肿瘤细胞易发生骨转移而另一部分病人的则易发生肺转移。所以发展针对转移器官特异性的生物学标记(biomarker)对预测患者转移风险和确定治疗方案具有重要作用。过去的研究发现了一些骨或肺转移特异的关联基因1-3，但是只针对单一靶器官的特异关联基因仍不能满足同时预测病人多靶器官转移风险的临床需求。并且，这些基因即使作为生物学标记，它们多依赖穿刺等有创的检测方法，易对病人造成附加的伤害。
另外，过去虽然有一些治疗器官特异性转移的药物方案，但只是针对单一靶器官。
综上所述，寻找新的具有诊断或联合诊断价值的转移性乳腺癌标志物，并针对性地进行靶向药物的研发是当务之急。因此，本领域迫切需要开发可用于检测或判断转移性乳腺癌的特异标志物。
技术实现要素：
本发明的目的就是提供一种可用于转移性乳腺癌特异标志物及其在临床诊断和肿瘤治疗中的用途。
本发明第一方面提供了一种dkk1基因、mrna、cdna、或蛋白或其检测试剂的用途，(i)用作检测转移性乳腺癌或乳腺癌转移风险的标志物；和/或(ii)用于制备检测转移性乳腺癌或乳腺癌转移风险的诊断试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述诊断试剂包括抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如dna芯片)或蛋白质芯片。
在另一优选例中，所述的蛋白包括全长蛋白或蛋白片段。
在另一优选例中，所述的dkk1基因、mrna、cdna、或蛋白来源于哺乳动物，较佳地来源于啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人，更佳地，来源于被诊断患有乳腺癌的患者或被诊断患有转移性乳腺癌的患者。
在另一优选例中，所述dkk1基因、mrna、cdna、或蛋白来源于乳腺癌患者。
在另一优选例中，所述dkk1基因的登录号为22943。
在另一优选例中，所述dkk1mrna的登录号为nm_012242。
在另一优选例中，所述dkk1蛋白的登录号为aaq89364.1。
在另一优选例中，所述检测是体液样本检测。
在另一优选例中，所述检测是血液样本检测和/或血清样本检测。
在另一优选例中，所述检测试剂包括dkk1的特异性抗体、dkk1的特异性结合分子、特异性扩增引物、探针或芯片。
在另一优选例中，所述的dkk1蛋白或其特异性抗体或特异性结合分子偶联有或带有可检测标记。
在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在另一优选例中，所述dkk1的特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在另一优选例中，所述乳腺癌转移选自下组：骨转移、肺转移、脑转移、肝转移、或其组合。
在另一优选例中，所述的乳腺癌转移选自下组：乳腺癌骨转移、乳腺癌肺转移、或其组合。
在另一优选例中，所述转移性乳腺癌包括骨转移性乳腺癌和/或肺转移性乳腺癌。
在另一优选例中，所述的转移风险指n年的转移风险，其中n为1-5的任意数字(包括小数)。
本发明第二方面提供了一种用于检测转移性乳腺癌或乳腺癌转移风险的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测dkk1基因、mrna、cdna、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测转移性乳腺癌或乳腺癌转移风险。
在另一优选例中，所述的检测转移性乳腺癌或乳腺癌转移风险指检测乳腺癌转移是否已发生、发生的转移部位，和/或
判断发生乳腺癌转移的可能性(易感性)大小。
在另一优选例中，所述的乳腺癌转移包括乳腺癌骨转移、乳腺癌肺转移、乳腺癌脑转移、乳腺癌肝转移、或其组合。
在另一优选例中，所述的乳腺癌转移包括乳腺癌骨转移和/或乳腺癌肺转移。
在另一优选例中，所述判断包括预先判断(预测)。
在另一优选例中，所述的检测dkk1基因、mrna、cdna、或蛋白的检测试剂包括：
(a).抗dkk1蛋白的特异性抗体；和/或
(b).特异性扩增dkk1的mrna或cdna的特异性引物。
在另一优选例中，所述检测是体液样本检测。
在另一优选例中，所述检测是血液样本检测和/或血清样本检测。
在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：
(i)当检测对象(subject)的血清dkk1的浓度≤2.3ng/ml(较佳地，0.05-2.3ng/ml，或0.5-2.0ng/ml)，则提示该检测对象发生乳腺癌肺转移的风险高(3年内风险≥30％)，而发生乳腺癌骨转移的风险低(3年内风险≤10％)；
在另一优选例中，该血清dkk1的浓度还提示，该检测对象发生乳腺癌肺转移几率高于一般乳腺癌患者；
(ii)当检测对象的血清dkk1的浓度＞2.3ng/ml且≤3.0ng/ml时(较佳地，2.3-3.0ng/ml)则提示该检测对象发生乳腺癌肺转移的风险较低(3年内风险≤20％)，而发生乳腺癌骨转移的风险较高(3年内风险≥20％)；
在另一优选例中，该血清dkk1的浓度还提示，该检测对象发生乳腺癌骨转移几率高于一般乳腺癌患者；
(iii)当检测对象的血清dkk1的浓度＞3ng/ml(如3.0-5.5ng/ml)，则提示该检测对象发生骨转移的风险高(3年内风险≥30％)，发生肺转移的几率低(3年内风险<10％)；
在另一优选例中，该血清dkk1的浓度还提示，该检测对象发生乳腺癌骨转移几率高于一般乳腺癌患者。
在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：
(i)当检测对象的血清dkk1的浓度≤2.3ng/ml，则提示该检测对象发生肺转移的几率高于一般乳腺癌患者，而发生骨转移的几率低于一般乳腺癌患者；
(ii)当检测对象的血清dkk1的浓度在2.3-3.0ng/ml之间，则提示该检测对象发生肺转移的几率略低于一般乳腺癌患者；
(iii)当检测对象的血清dkk1的浓度在＞3.0ng/ml，则提示该检测对象发生肺转移的几率低于一般乳腺癌患者，而发生骨转移的几率高于一般乳腺癌患者。
在另一优选例中，所述的检测对象为人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的试剂盒还用于预测转移性乳腺癌患者的生存时间或预后。
本发明第三方面提供了一种检测转移性乳腺癌或乳腺癌转移风险的方法，所述方法包括：
a)提供来自受试者的测试样品；
b)检测测试样品中dkk1蛋白的浓度；和
c)将步骤b)中所测定的dkk1蛋白的浓度与对照进行比较，
其中与所述对照相比，所述样品中dkk1蛋白的浓度低于参比值，表明受试者发生肺转移的几率高于一般乳腺癌患者人群(对照组人群)；和/或dkk1蛋白的浓度高于参比值，表明受试者发生骨转移的几率高于一般乳腺癌患者人群(对照组人群)。
在另一优选例中，所述的受试者为人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述测试样品为乳腺癌患者的体液样本。
在另一优选例中，所述的测试样品包括乳腺癌患者的血液样本和/或血清样本。
在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述参比值为截断值(cut-off值)。
在另一优选例中，所述参比值为2.3ng/ml和3.0ng/ml。
本发明第三方面提供了一种确定治疗方案的方法，包括：
a)提供来自受试者的测试样品；
b)检测测试样品中dkk1蛋白的浓度；和
c)基于所述样品中的dkk1蛋白的浓度来确定治疗方案。
在另一优选例中，所述的受试者为人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，当所述样品中的dkk1蛋白的浓度≤2.3ng/ml(较佳地，0.05-2.3ng/ml，或0.5-2.0ng/ml)，则提示该受试者发生乳腺癌肺转移的几率高于一般乳腺癌患者，所述治疗方案包括jnk抑制剂疗法。
在另一优选例中，当受试者发生乳腺癌肺转移的几率高于一般乳腺癌患者时，所述治疗方案还包括tgfβ抑制剂疗法与jnk抑制剂疗法的联用。
在另一优选例中，当所述样品中的dkk1蛋白的浓度＞2.3ng/ml且≤3.0ng/ml时(较佳地，2.3-3.0ng/ml)，则提示该受试者发生乳腺癌骨转移的几率高于一般乳腺癌患者，所述治疗方案包括tgfβ抑制剂疗法或tgfβ抑制剂疗法与jnk抑制剂疗法的联用。
在另一优选例中，当所述样品中的dkk1蛋白的浓度＞3ng/ml(如3.0-5.5ng/ml)，则提示该受试者发生乳腺癌骨转移几率高于一般乳腺癌患者，所述治疗方案包括tgfβ抑制剂疗法或tgfβ抑制剂疗法与jnk抑制剂疗法的联用。
在另一优选例中，所述治疗方案还包括其他乳腺癌骨转移、和/或乳腺癌肺转移疗法。
在另一优选例中，所述其他乳腺癌骨转移、和/或乳腺癌肺转移疗法选自下组：
(1)dkk1中和抗体疗法；和/或
(2)双磷酸盐类药物疗法；和/或
(3)rankl靶向抗体或其他抑制剂疗法；和/或
(4)tgfβ靶向抗体药物或其他抑制剂疗法；和/或
(5)pthrp靶向抗体或其他抑制剂疗法；和/或
(6)整合素抑制剂疗法；和/或
(7)靶向mtor、src蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶等分子和信号通路的抑制剂疗法；和/或
(8)乳腺癌激素疗法疗法；和/或
(9)人类表皮生長因子受体2抑制剂疗法；和/或
(10)烷化剂、甲氨蝶呤、蒽环类药物、紫杉烷抗癌剂等化疗药物的单用和联用疗法。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了dkk1与乳腺癌骨、肺转移的关联及其功能。(a)不同转移组乳腺癌病人血清dkk1水平；(b)高dkk1组与低dkk1组病人的无肺/骨转移生存率；(c)不同转移组乳腺癌病人血清中dkk3、dkk4水平，以及肿瘤组织中dkk2的表达水平；(d)尾静脉注射dkk1过表达与对照组乳腺癌细胞后小鼠的肺部光信号及示意图；(e)左心室注射dkk1过表达与对照组乳腺癌细胞后小鼠的后肢光信号及x光成像示意图。*p<0.05。
图2显示了sp600125和sb431542联合使用对骨、肺转移的抑制作用。(a)dkk1敲低组与对照组乳腺癌细胞条件培养液诱导的单核细胞(左)和髓系抑制性细胞(mdsc，右)(右)迁移；(b)dkk1过表达组与对照组乳腺癌细胞条件培养液中tgfβ的含量；(c-e)脂肪垫原位注射小鼠乳腺癌细胞系后形成的肿瘤大小(c)、转移至肺部结节数(d)和转移至后肢骨形成的破骨转移灶面积(e)及药物处理的影响。sp：sp600125；sb：sb431542。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；ns，无显著差异。
图3显示了其他jnk抑制剂和tgfβ抑制剂联合使用对骨、肺转移的抑制作用。(a)jnk和tgfβ抑制剂处理后乳腺癌细胞内下游jun和smad2蛋白的磷酸化水平；(b-d)jnk和tgfβ抑制剂处理后乳腺癌细胞的条件培养液诱导的单核细胞迁移(b)、破骨细胞成熟(c)和trap阳性的多核的成熟破骨细胞(d)(黑色箭头所指细胞)。sp：sp600125；sb：sb431542；gal：galunisertib。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；ns，无显著差异。
图4显示了dkk1作用模型。(1)血清dkk1水平在骨转移乳腺癌患者中较高而在肺转移中较低；(2)dkk1通过抑制下游的jnk和nf-κb信号通路抑制巨噬细胞/mdsc招募和tgfβ的分泌；(3)jnk和tgfβ的抑制剂的联用能够有效地同时缓解肺转移和骨转移。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，骨转移组的乳腺癌患者的血清dkk1蛋白水平显著高于无转移的对照组，而肺转移组患者的dkk1则显著低于对照组，因此dkk1可作为一类新的同时预测乳腺癌骨转移和肺转移的生物学标记，从而起到全面评估患者的多靶器官的转移风险并指导治疗的作用。在此基础上，本发明人完成了本发明。
实验结果显示，当乳腺癌患者的血清dkk1的浓度≤2.3ng/ml，则表明该乳腺癌患者发生肺转移的几率高于一般乳腺癌患者人群的平均几率，发生骨转移的几率低于普通人群；当乳腺癌患的血清dkk1的浓度＞2.3ng/ml，较佳地，2.3-3.0ng/ml，更佳地，＞3ng/ml，则表明该乳腺癌患者发生骨转移的几率高于一般乳腺癌患者人群的平均几率，并且发生肺转移的几率低于一般乳腺癌患者人群的平均几率。
此外，本发明的实验结果还进一步显示，根据乳腺癌患者血清中dkk1的浓度水平选择不同的治疗方案，比如，当乳腺癌患者的血清dkk1的浓度≤2.3ng/ml，则选择jnk抑制剂的治疗方案或jnk抑制剂与tgfβ抑制剂联用的治疗方案，当乳腺癌患的血清dkk1的浓度＞2.3ng/ml，较佳地，2.3-3.0ng/ml，更佳地，＞3ng/ml，则选择tgfβ抑制剂或tgfβ抑制剂与jnk抑制剂联用的治疗方案。
术语
如本文所用，术语“转移性乳腺癌”指有转移风险的乳腺癌，包括未发生或已发生转移的乳腺癌类型，具体地，包括骨转移性乳腺癌、肺转移性乳腺癌、脑转移性乳腺癌、肝转移性乳腺癌等转移类的乳腺癌。
样品
本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样品可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。样品也可以是以某种方式与受试者接触过的材料，这种接触方式使得对样品进行的测试可以提供与受试者有关的信息。样品也可以是已经与其它材料接触过的材料，这种其它材料不是受试者的，但是能够使第一材料随后被测试以确定与受试者有关的信息，例如样品可以是探针或解剖刀的清洗液。样品可以为接触受试者之外的生物材料源，只要本技术领域的专业人员仍然能够从样品确定与受试者有关的信息就行。
表达
如本文所用，术语“表达”包括mrna从基因或基因部分的产生，并且包括由rna或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cdna，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。
参比值
如本文所用，术语“参比值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中，参比值是根据对比较dkk1蛋白的表达与已知的临床结果的研究进行的统计学分析来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文公开的方法的用户经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的医疗史、遗传学、年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。
在本发明中，所述参比值指截断值(cut-off值)，优选2.3ng/ml和3ng/ml(乳腺癌患者血清中dkk1的浓度)。
非乳腺癌样品
如本文所用，术语“非乳腺癌样品”包括但不限于未患有乳腺癌的人群，乳腺癌患者的非乳腺癌组织。
dkk1蛋白和多核苷酸
在本发明中，术语“本发明蛋白”、“dkk1蛋白”、“dkk1多肽”可互换使用，都指具有dkk1氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的dkk1蛋白。此外，该术语还包括全长的dkk1及其片段。本发明所指的dkk1蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。
dkk1是wnt信号通路抑制分子dickkopf家族成员之一，其家族中还有dkk2、3、4其他三个成员，dkk1蛋白是一种分泌型的糖蛋白，主要由分泌信号肽、两个保守的富半胱氨酸结构域和连接序列组成。dkk1首先在非洲爪蟾的头部发育研究中被发现能够抑制经典wnt信号通路。。
人的dkk1蛋白全长为226个氨基酸(登录号为aaq89364.1)。鼠的dkk1蛋白全长为272个氨基酸(登录号为np_034181.2)。
在本发明中，术语“dkk1基因”、“dkk1多核苷酸”可互换使用，都指具有dkk1核苷酸序列的核酸序列。
人dkk1基因的基因组全长3377bp(ncbigenbank登录号为22943)，其转录产物mrna序列全长1815bp(ncbigenbank登录号为nm_012242)。
鼠dkk1基因的基因组全长3621bp(ncbigenbank登录号为13380)，其转录产物mrna序列全长2245bp(ncbigenbank登录号为nm_010051)。
人和鼠dkk1，在dna水平的相似性为75.8％，蛋白序列相似性为80.1％。
需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。
在得到了dkk1的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的dkk1核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(如载体)和细胞中。
通过常规的重组dna技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的dkk1多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码人dkk1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，dkk1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含dkk1编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。
用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
jnk信号通路和tgfβ信号通路
jnk信号通路是有丝分裂元激活蛋白激酶(mapk)信号通路的成员，受环境压力、炎症反应和生长因子等激活，参与细胞增殖、分化和凋亡等重要过程。受刺激激活后，磷酸化的jnk蛋白转移至细胞核中，进一步激活下游一系列(jun、atf-2等)转录调节因子，从而调节基因表达。
转化生长因子β(tgfβ)属于转化生长因子超家族，tgfβ在细胞增殖、分化和凋亡等过程中起重要作用，在个体发育、肿瘤发生和肿瘤转移中起重要作用。在骨转移过程中，tgfβ通路能通过促进癌细胞分泌调控破骨细胞的因子，从而促进破骨细胞的成熟，进而加速乳腺癌的破骨性转移。本发明的研究发现，dkk1通过非经典的wnt信号通路—jnk和nf-κb通路调节肺转移灶内的微环境细胞(巨噬细胞和髓系来源免疫抑制细胞，mdsc)的招募和重要细胞因子tgfβ的分泌影响肺转移灶的生长。dkk1可以抑制jnk通路下游转录调节因子jun的磷酸化水平从而降低它的转录活性，导致下游基因表达下降，抑制肿瘤细胞产生吸引巨噬细胞/mdsc因子的能力(图2a)；同时dkk1还可以抑制nf-κb通路重要转录调节因子rela的磷酸化水平从而降低下游tgfβ的分泌(图2b)，共同抑制乳腺癌肺转移灶的生长。
特异性抗体
在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗dkk1的特异性抗体”可互换使用。
本发明还包括对人dkk1多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人dkk1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人dkk1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人dkk1蛋白的分子，也包括那些并不影响人dkk1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人dkk1基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如fab’或(fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链fv分子(ladner等人，美国专利no.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人dkk1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人dkk1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见kohler等人,nature256；495,1975；kohler等人,eur.j.immunol.6：511,1976；kohler等人,eur.j.immunol.6：292,1976；hammerling等人,inmonoclonalantibodiesandtcellhybridomas,elsevier,n.y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人dkk1蛋白功能的抗体以及不影响人dkk1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人dkk1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人dkk1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如e.coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人dkk1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是组织样本或血清样本)中的人dkk1蛋白。由于dkk1蛋白存在胞外区，因此在胞外区脱落并进入血液的情况下，这些可溶性的dkk1胞外区就可成为血清检测的靶对象。
检测方法
利用dkk1存在于乳腺癌的体液(优选血清或血液)中，且与乳腺癌转移密切相关这一特点，本发明还提供了检测转移性乳腺癌的方法。
在本发明的一个优选例中，本发明提供一种检测dkk1的elisa法以及时间分辨免疫荧光法(trfia)。
检测试剂盒
基于dkk1与乳腺癌转移的相关性，即dkk1存在于乳腺癌体液(优选血液或血清)中，并且dkk1的浓度不同，乳腺癌患者的转移类型不同，因此dkk1可以作为转移性乳腺癌的一种诊断标志物。
本发明还提供了一种检测转移性乳腺癌的试剂盒，它含有检测dkk1基因、mrna、cdna、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测转移性乳腺癌；
其中，所述的标签或说明书注明以下内容：
(i)当检测对象(subject)的血清dkk1的浓度≤2.3ng/ml(较佳地，0.05-2.3ng/ml，或0.5-2.0ng/ml)，则提示该检测对象发生乳腺癌肺转移的风险高，而发生乳腺癌骨转移的风险低；
(ii)当检测对象的血清dkk1的浓度＞2.3ng/ml且≤3.0ng/ml时(较佳地，2.3-3.0ng/ml)则提示该检测对象发生乳腺癌肺转移的风险较低(3年内风险≤20％)，而发生乳腺癌骨转移的风险较高(3年内风险≥20％)；
(iii)当检测对象的血清dkk1的浓度＞3ng/ml(如3.0-5.5ng/ml)，则提示该检测对象发生骨转移的风险高(3年内风险≥30％)，发生肺转移的几率低(3年内风险<10％)。
在一优选实施方式中，本发明还提供了dkk1的诊断试剂盒，包括：dkk1mrna诊断试剂盒或dkk1酶联免疫(elisa)检测试剂盒。
检测方法和试剂盒
本发明涉及定量和定位检测人dkk1蛋白水平或mrna水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人dkk1蛋白水平，可以用于诊断(包括辅助诊断)乳腺癌是否转移或转移的部位。
一种检测样品中是否存在dkk1蛋白的方法是利用dkk1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与dkk1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在dkk1蛋白。
dkk1蛋白或其多核苷酸可用于dkk1蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或dna芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗dkk1的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的dkk1蛋白。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，对dkk1下游的两个信号通路jnk和tgfβ进行联合靶向抑制，能同时抑制乳腺癌向肺和骨的转移，因此提供了一种针对乳腺癌多器官转移的联合治疗方案。
(2)本发明首次发现，骨转移组的乳腺癌患者的血清dkk1蛋白水平显著高于无转移的对照组，而肺转移组患者的dkk1则显著低于对照组。并且，高血清dkk1组病人的无肺转移生存率显著高于低dkk1组，而在无骨转移生存率中相反，这表明dkk1为一类新的同时预测乳腺癌骨转移和肺转移的生物学标记，从而起到全面评估患者的多靶器官的转移风险并指导治疗的作用。
(3)本发明首次发现，可根据血清的dkk1蛋白水平，评估乳腺癌患者的骨转移和肺转移风险，可作为更加精确的预后诊断以及制定更有针对性的治疗策略提供参考依据。
(4)本发明首次发现，dkk1与骨、肺转移的相关性在其蛋白家族中具有特异性。
(5)本发明首次发现，联合使用jnk和tgfβ抑制剂能够同时降低乳腺癌向骨和向肺的转移能力，为临床上治疗乳腺癌发生骨或肺部远端转移甚至是多发靶器官转移的患者提供了新的治疗方案。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
通用方法
(1)病人血清样本的检测：获得病人血清样本后，立即在-80℃冻存。检测前，将血清样本在冰上融化，在4℃以3000转/分钟离心5分钟，吸取上清并按照dkk1elisa试剂盒(购自r&dsystems)、dkk3试剂盒(购自abcam)和dkk4试剂盒(购自abcam)稀释并检测病人血清样本的dkk1、dkk3和dkk4浓度。
(2)thp-1双小室迁移实验(24孔板)：首先将经抑制剂刺激或对照组的肿瘤细胞条件培养液与rpmi1640培养基(购自thermo)按1：1的比例混和，取500μl混合液加入下方小室。将2×105thp-1细胞(购自中科院细胞库)重悬于300μlrpmi1640培养基中，小心加入上方小室。在37℃，5％co2培养16个小时后收取下方小室内的液体，并对液体内的细胞计数，即获得迁移细胞的数目。
(3)mdsc双小室迁移实验(24孔板)：1.体外分化mdsc：牺牲balb/c小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，取出其下肢的长骨，将骨髓细胞冲出，在分化培养基(rpmi1640，10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素双抗，40ng/mlgm-csf(购自peprotech)，10ng/mlil-6(购自sinobiological))中培养7天，离心得到的细胞即mdsc。2.双小室迁移：基本步骤与thp-1双小室迁移一致，但需在上层小室中种1×106细胞，并在3小时后收取下层小室中的液体并计数。
(4)破骨细胞体外分化：牺牲小鼠，取出其下肢的长骨，将骨髓细胞冲出并在α-mem培养基(购自thermo)中培养过夜。第二天吸取上层培养基，1500转/分钟离心收集细胞。将收集的细胞以2×106/ml的浓度重悬于破骨细胞分化培养基(α-mem，20％灭活胎牛血清)：肿瘤细胞条件培养3：1混合液中，并加入终浓度为25ng/ml重组rankl(购自peprotech)和50ng/ml重组m-csf(购自peprotech)，培养6天。6天后用trap染色试剂盒(购自sigma)染色并统计核数≥3的trap阳性的成熟破骨细胞。
小鼠实验：1.dkk1功能验证：将过表达dkk1或对照组的乳腺癌细胞消化计数，分别将2×105和1×105的细胞通过左心室和尾静脉注射入裸鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)体内，并定期注射荧光素酶底物注射入小鼠体内检测转移灶生长情况。
(5)jnk与tgfβ抑制剂联合治疗：将4t1.2小鼠肿瘤细胞(获自miller实验室)以1×105注射入小鼠的乳房脂肪垫中。注射一周后每周两次开始测量小鼠肿瘤体积，在注射两周后将小鼠随机分为四组，使每组原位肿瘤体积的平均数接近并且无显著差异。注射原位肿瘤两周后开始每天腹腔注射抑制剂(sp600125(20mg/kg),sb431542(10mg/kg))或对照溶剂对照。注射开始两周后照射x光照片观察骨转移，并取出小鼠的肺检查肺转移灶数量。
本专利中使用的抑制剂：sp600125、jnk-in-8、sb431542、sd-208、ly2109761、sb525334和galunisertib均购自selleckchem，bi78d3和tcsjnk6o购自tocris。本专利中使用的抗体：jun(9165)，p-jun(9164)，smad2(5339)和psmad2(3108)均购自与cellsignalingtechnologies。gapdh(g9545)购自sigma。tgfβ1(18978-1-ap)购自proteintech。
实施例1
dkk1在乳腺癌样本的表达模式
通过对病人血清的酶联免疫吸附测定(elisa)发现，骨转移组的乳腺癌患者的血清dkk1蛋白水平显著高于无转移的对照组，而肺转移组患者的dkk1则显著低于对照组(图1a)。并且，高血清dkk1组病人的无肺转移生存率显著高于低dkk1组，而在无骨转移生存率中相反(图1b)。此前的研究几乎从未报道过与dkk1类似的在不同组织特异性转移中具有相反表达模式的生物学标记，表明dkk1具有成为一类新的同时预测乳腺癌骨转移和肺转移的生物学标记的可能，从而起到全面评估患者的多靶器官的转移风险并指导治疗的作用。如果利用病人血清中dkk1含量高低对病人进行分组的话，可以看到不同组病人的骨转移和肺转移风险有很大差别(表1)，可作为更加精确的预后诊断以及制定更有针对性的治疗策略提供参考依据。
表1：血清中不同dkk1含量的病人的骨、肺转移风险
实施例2
dkk1在乳腺癌组特异性转移中的功能研究
为了检测dkk1在乳腺癌组织特异性转移中是否具有功能，在具有荧光素酶标记的mda-mb-231乳腺癌细胞系(获自joanmassague实验室)中过表达了dkk1，然后将细胞通过尾静脉和左心房注射入免疫缺陷小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，通过荧光素酶底物的注射，能够观察到与转移负荷相应的光信号。和临床相关性一致的是，肿瘤细胞的光信号显示过表达的dkk1可以显著抑制乳腺癌的肺转移而显著增强骨转移(图1c、d、e)。
实施例3
dkk1的作用机理
dkk1是经典wnt信号通路的抑制蛋白。本发明的研究发现，dkk1通过非经典的wnt信号通路—jnk和nf-κb通路调节肺转移灶内的微环境细胞(巨噬细胞和髓系来源免疫抑制细胞，mdsc)的招募和重要细胞因子tgfβ的分泌影响肺转移灶的生长。dkk1可以抑制jnk通路下游转录调节因子jun的磷酸化水平从而降低它的转录活性，导致下游基因表达下降，抑制肿瘤细胞产生吸引巨噬细胞/mdsc因子的能力(图2a)；同时dkk1还可以抑制nf-κb通路重要转录调节因子rela的磷酸化水平从而降低下游tgfβ的分泌(图2b)，共同抑制乳腺癌肺转移灶的生长。
实施例4
联合使用jnk和tgfβ的抑制剂sp600125和sb431542可显著抑制乳腺癌肺转移和骨转移
在小鼠体内联合使用jnk和tgfβ的抑制剂sp600125(sellckchem)和sb431542(selleckchem)来检测它们是否能够显著降低乳腺癌细胞从原位向其他组织(包括肺组织和骨组织)转移的能力。经过一段时间的治疗，虽然对原位瘤的生长影响不大(图2c)，但联合用药组小鼠肺表面的肿瘤结节数显著减少(图2d)。
此外，还进一步观察到乳腺癌向骨转移的能力在联合用药的情况下也有显著降低(图2e)。在乳腺癌骨转移中，到达骨组织的癌细胞会过度激活骨组织内的破骨细胞，成熟的破骨细胞能够降解富含生长因子的骨基质，进一步滋养肿瘤细胞并提供生长空间。破骨细胞的过度激活表现为骨组织的破坏和溶解，而在联合使用sp600125和sb431542后观察到受肿瘤细胞诱导侵蚀的破骨面积的显著缩小。
综上，本发明的研究结果发现，联合使用jnk和tgfβ抑制剂能够同时降低乳腺癌向骨和向肺的转移能力，为临床上治疗乳腺癌发生骨或肺部远端转移甚至是多发靶器官转移的患者提供了新的治疗方案。
实施例5
验证jnk与tgfβ抑制剂在治疗肺转移和骨转移中的可靠性
本发明采用了多种针对jnk和tgfβ的抑制剂及其组合，验证其对巨噬细胞招募和破骨细胞成熟是否有作用。首先，验证采用的jnk和tgfβ抑制剂能否有效抑制jnk和tgfβ信号通路。通过检测下游jun和smad2蛋白的磷酸化水平，确认了使用的抑制剂都能有效抑制相应的信号通路(图3a)。使用肿瘤细胞条件培养液作为吸引剂，采用双小室迁移实验来模拟肿瘤细胞在肺部招募循环巨噬细胞的前体单核细胞(图3b)。
实验结果发现，所采用的其他jnk抑制剂(bi78d3、tcsjnk6o和jnk-in-8)和sp600125均能同等有效地显著降低肿瘤细胞条件培养液诱导的单核细胞迁移，这显示多种jnk抑制剂都可能在体内抑制单核细胞向肺转移灶内的迁移。相反的，除galunisertib有较弱的效应以外，tgfβ抑制剂(sb525334、sd-208、sb431542和ly2109761)对乳腺癌细胞条件培养液诱导的单核细胞迁移几乎无作用。上述结果与本发明的机制研究一致，即jnk-jun下游基因对肿瘤细胞吸引单核细胞起主要作用。另外，jnk和tgfβ抑制剂的联用也显示了与jnk信号通路抑制剂相似的结果，显示两种抑制剂的联合使用并不会相互影响拮抗，依然有效。
同时，为检测这些抑制剂对骨转移的作用，利用小鼠原代骨髓细胞体外破骨细胞分化技术。小鼠原代骨髓细胞包含包括破骨细胞前体细胞在内的多种细胞成分，能够较为真实地模拟肿瘤细胞与骨髓细胞组分的相互作用。相同的，本发明也检测了jnk和tgfβ抑制剂是否影响乳腺癌细胞诱导的破骨细胞成熟(图3c)。
实验结果显示，有部分jnk抑制剂对乳腺癌细胞诱导的破骨细胞成熟分化有一定的抑制作用，而tgfβ抑制剂则都显示了较强的对破骨细胞成熟的抑制作用。和本发明的小鼠结果一致的是，两种抑制剂的联合使用对破骨细胞成熟的抑制作用。针对成熟破骨细胞的抗酒石酸碱性磷酸酶(trap)染色结果显示，本发明所测试的部分jnk抑制剂、所有tgfβ抑制剂和它们的组合能够有效减少视野下trap+的多核成熟破骨细胞的数量(图3d)。
讨论
综上所述，本发明的研究发现，在临床上，dkk1是一个新的可以同时预测乳腺癌患者骨转移和肺转移风险的生物学标记基因，为患者的转移风险预测和预后判断提供新的方法和依据。此外，针对其调控的下游信号通路jnk和tgfβ的抑制剂的联用能够有效降低肺部转移灶内巨噬细胞和mdsc的浸润，缓解肺转移；同时，联用能够抑制骨转移灶中破骨细胞的成熟分化，减缓骨转移，为治疗骨转移、肺转移或骨肺多发转移的患者提供了新的治疗手段(图4)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
参考文献
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2.minn,a.j.,etal.lungmetastasisgenescouplebreasttumorsizeandmetastaticspread.pnatlacadsciusa104,6740-6745(2007).
3.minn,a.j.,etal.genesthatmediatebreastcancermetastasistolung.nature436,518-524(2005).