本发明属于诊断领域，涉及一种儿童i型糖尿病的诊断工具，还涉及血液中cyb5r1基因在制备儿童i型糖尿病诊断工具中的应用。
背景技术：
：i型糖尿病(t1dm)为在遗传基础上由环境因素激发的、自身免疫介导的以胰腺β细胞受损为特征的自身免疫性疾病，是一种由于胰岛素缺乏或作用不足引起的能量代谢疾病。通常在儿童、少年、青年时期被诊断，发病风险最高的年龄段是10-14岁，青少年以后，发病率下降。儿童i型糖尿病以往多指小于15岁发生的糖尿病，由于who(世界卫生组织)已经儿童定义为0-18岁，因此儿童糖尿病应指小于18岁发生的糖尿病。儿童1型糖尿病的临床表现为多尿、多饮、多食及消瘦。儿童1型糖尿病比成人糖尿病重，起病较急，不易早期发现，胰岛β细胞的功能可出现明显下降甚至发展为衰竭，早期并发症即可出现，如糖尿病酮症甚至酸中毒，如处理不及时或不当，可能危及生命。i型糖尿病确切发病机制尚未完全阐明，目前认为是遗传、免疫和环境因素共同作用所致。高通量测序技术(high-throughputsequencing)是指能够一次并行对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。高通量测序技术是对传统测序一次革命性变革，随着2005年罗氏的454测序仪及2006年solexa测序仪出现后飞速发展，2009年左右高通量测序技术在国内兴起。高通量测序类型分为多种，基因芯片、基因深度测序(genomere-sequencing)、转录组深度测序(transcriptomere-sequencing又称rna-seq)等。细胞的功能是从基因的表达开始的，转录组是指某一时间细胞内所有基因转录而来的rna总称。通过高通量测序技术可获得基因表达的rna水平有关信息，可以揭示基因表达与一些生命现象之间的内在联系。高通量测序技术的快速发展和应用，为儿童i型糖尿病发病机理的研究提供了更加全面和快速的分析手段，也为儿童i型糖尿病的进一步治疗方案提供崭新思路。深入研究儿童i型糖尿病相关基因的调控机制，有助于了解儿童i型糖尿病的遗传分子机制，为寻找新的药物提供理论依据。技术实现要素：本发明利用芯片筛选并使用实时荧光定量pcr验证获知cyb5r1基因在儿童i型糖尿病血液中差异表达。本发明首次发现cyb5r1基因在儿童i型糖尿病中的作用，可用于开发通过检测cyb5r1基因来诊断儿童i型糖尿病的产品。根据本发明的一个方面，本发明提供了一种诊断儿童i型糖尿病的工具，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测cyb5r1基因转录水平的针对cyb5r1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的cyb5r1蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括cyb5r1基因在内的多个基因(例如，与儿童i型糖尿病相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括cyb5r1蛋白在内的多个蛋白质(例如与儿童i型糖尿病相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与儿童i型糖尿病的标志物同时检测，可大大提高儿童i型糖尿病诊断的准确率。其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测cyb5r1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括cyb5r1蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用rt-pcr、实时荧光定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测cyb5r1基因表达水平过程中所需的试剂。优选的，所述试剂包括针对cyb5r1基因的引物和/或探针。根据cyb5r1基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测cyb5r1基因表达水平的引物和探针。所述高通量测序平台包括检测cyb5r1基因表达水平的试剂。所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测cyb5r1基因的转录水平。与cyb5r1基因的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。进一步，所述cyb5r1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述cyb5r1蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与cyb5r1蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。在本发明的具体实施方案中，所述针对cyb5r1基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物如seqidno.2所示。根据本发明的另一个方面，本发明还提供了检测cyb5r1基因表达的产品在制备诊断儿童i型糖尿病的工具中的应用。进一步，上面所提到的检测产品包括：通过rt-pcr、实时荧光定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测cyb5r1基因的表达水平以诊断儿童i型糖尿病的产品。进一步，所述用rt-pcr诊断儿童i型糖尿病的产品至少包括一对特异扩增cyb5r1基因的引物；所述用实时荧光定量pcr诊断儿童i型糖尿病的产品至少包括一对特异扩增cyb5r1基因的引物；所述用免疫检测诊断儿童i型糖尿病的产品包括：与cyb5r1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断儿童i型糖尿病的产品包括：与cyb5r1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断儿童i型糖尿病的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与cyb5r1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与cyb5r1基因的核酸序列杂交的探针。在本发明的具体实施方案中，所述用实时荧光定量pcr诊断儿童i型糖尿病的产品至少包括一对特异扩增cyb5r1基因的引物的序列如seqidno.1和seqidno.2所示。优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测cyb5r1基因表达的产品可以应用于该平台实现对cyb5r1基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知cyb5r1基因的异常与儿童i型糖尿病相关也属于cyb5r1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。本发明中cyb5r1基因和cyb5r1蛋白来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组dna及其或者蛋白的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断儿童i型糖尿病的cyb5r1基因及蛋白的来源是血液。在发明的具体实施方案中，血液是取自儿童i型糖尿病患者和正常儿童的血液。本发明的有益效果：本发明首次发现了可用于诊断儿童i型糖尿病的血液分子标志物，由于分子标志物的变化早于临床症状，通过检测分子标志物的变化可在疾病隐匿期或者疾病早期即可诊断出疾病是否发生或者判断疾病发生的风险概率，以便受试者能够得到及时的治疗和预防。附图说明图1显示利用免疫印迹检测cyb5r1蛋白在儿童i型糖尿病患者和正常儿童中的表达差异。具体的实施方式cyb5r1基因本发明的“cyb5r1基因”(nc_000009.12(36336398..36487384)的具体序列可在国际公共核酸序列数据库genebank中查询到。本发明的“cyb5r1基因”包括上述cyb5r1基因及其功能等同物，所述功能等同物是指与cyb5r1基因序列存在差异但是能够编码具有相同功能的蛋白质的序列。cyb5r1蛋白本发明的“cyb5r1蛋白”的具体序列可在ncbi中查询到。本发明的“cyb5r1蛋白”包括上述cyb5r1蛋白以及cyb5r1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括cyb5r1蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与cyb5r1的dna杂交的dna所编码的蛋白质。本发明的“cyb5r1蛋白”还包括上述cyb5r1蛋白以及cyb5r1蛋白的任何功能等同物的修饰蛋白。通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是cyb5r1蛋白的融合蛋白。对于与cyb5r1蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留cyb5r1蛋白的生物学活性即可。本发明的cyb5r1蛋白也包括蛋白氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留cyb5r1蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。诊断本发明的“诊断”包括疾病状态的判断，疾病风险的判断、疾病预后判断。下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1筛选儿童i型糖尿病患者和正常儿童中差异表达的基因1、临床对象：内分泌科初次就诊的儿童i型糖尿病(按who1999年糖尿病诊断标准)住院患者10例，其中男5例，女5例，年龄5-16岁；正常对照组8例，其中男3例，女5例皆为健康体检者，无糖尿病家族史，并排除内分泌疾患及其他慢性疾病，年龄5-16岁，与糖尿病患儿性别、年龄无统计学差异。本研究经医学伦理委员会备案并批准，入选患儿及健康对照儿童合法监护人均签署临床研究同意书。2、样本采集与样本rna提取儿童i型糖尿病和正常儿童在清晨空腹抽取静脉血，使用博凌科为tripurelsreagent血液(血液样本)rna抽提试剂进行血液总rna的提取。基本步骤：(1)按照3:1的体积比例加入tripurelsreagent和血液振荡混匀；(2)加入氯仿帮助有机相和水相分层；(3)异丙醇沉淀rna；(4)漂洗rna沉淀；(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。3、rna浓度的检测用双蒸水将核酸蛋白定量检测仪的rna检测孔洗涤3遍，晾干，取1‰depc液作阴性对照，检测本底。取rna溶液2μl，用98μl1‰depc液稀释50倍，记录相关的od260、od280值。rna浓度＝od260×40μg/ml×稀释倍数。4、rna纯度＝od260/od280，rna纯度应在1.8～2.0之间。当rna纯度符合要求时才可继续下一步实验。5、rna的完整性检测取rna样品3μl，depc水补充至15μl，65℃变性10min，然后置于冰上，加入2μl10×rnaloadingbuffer，将甲醛变性琼脂糖凝胶放入装有mops缓冲液的电泳槽中，100v电泳约5min，将rna样品点入点样孔中，100v电泳，指示剂扩散至凝胶的1/3处时拍照。凝胶扫描成像系统观察见28s、18s条带完整清晰，无扩散现象。可用于进行下一步实验。6、组织rna的高密度人类基因表达谱芯片分析依托博奥生物公司提供的基因芯片分析平台的技术服务，选择affx人类基因组表达谱芯片(affxhumangenomeu133plus2.0array，affimetrix公司)，完成了血液样本rna的基因芯片筛查分析，其工作原理及全部操作流程参照该公司常规的基因芯片分析方法，主要细节如下：(1)取以上人类基因组表达谱芯片共18张，分别与18例血液rna进行杂交实验，并重复三次；(2)利用luxscan10ka双通道激光扫描仪，对杂交后的基因芯片进行扫描分析；(3)利用sam软件，并以正常儿童为对照，对儿童i型糖尿病患者的芯片扫描数据进行处理与统计分析，其称为聚类分析(geneclusteranalysis)；(4)以两倍异常绝对值差异作为量化比较的界限，获得儿童i型糖尿病患者或正常儿童之间差异表达候选基因。通过以上杂交、扫描和数据分析，发现儿童i型糖尿病患者与正常儿童比较，有(2倍及以上)差异表达基因480种，其上调表达基因有321种，下调表达基因为159种。实施例2实时荧光定量pcr实验验证儿童i型糖尿病患者和正常儿童中差异表达的基因1、临床对象：内分泌科初次就诊的儿童i型糖尿病(按who1999年糖尿病诊断标准)住院患者120例，其中男64例，女59例，年龄5-16岁(9.99士3.28)岁；正常对照组78例，其中男38例，女40例皆为健康体检者，无糖尿病家族史，并排除内分泌疾患及其他慢性疾病，年龄5-16(10.51士3.25)岁，与糖尿病患儿性别、年龄无统计学差异。本研究经医学伦理委员会备案并批准，入选患儿及健康对照儿童合法监护人均签署临床研究同意书。2、血液总rna提取使用博凌科为tripurelsreagent血液(血液样本)rna抽提试剂进行血液总rna的提取。基本步骤：(1)按照3:1的体积比例加入tripurelsreagent和血液振荡混匀；(2)加入氯仿帮助有机相和水相分层；(3)异丙醇沉淀rna；(4)漂洗rna沉淀；(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。3、逆转录用逆转录缓冲液对lμg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。4、实时荧光定量pcr荧光定量pcr是在常规pcr基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现目标基因的定量，随着pcr反应的进行，pcr反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，都会收集到一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化来监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。结果显示，扩增曲线ct值均小于32，说明实验数据均可用，本发明的实时荧光定量pcr试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。(1)荧光定量pcr反应体系以上一步合成的互补dna(cdna)为模板进行荧光定量pcr反应，反应体系为20μ1(表1)。表1反应体系组分体积(μl)sybrpremixextaqll(2x)10pcr上游引物(10μm)2pcr下游引物(10μm)2dna模板2rnasefreedh2o20引物序列：cyb5r1基因的正向引物序列为5’-ctgaaagtccctgaagat-3’(seqidno.1)，反向引物序列为5’-ctgaaagtccctgaagat-3’(seqidno.2)；扩增gapdh基因的正向引物序列为5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.3)，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.4)。(2)反应条件启动lightcyder1.5实时荧光定量pcr仪，预热后将pcr反应毛细管放入pcr仪中，反应条件如表2所示。65℃至95℃绘制融解曲线。表2实时荧光定量pcr反应条件5、统计学分析实时荧光定量的结果采用美国abi公司sds2.4软件进行分析，具体采用comparativedelta-deltact法，该方法的优点是只需对待测样品分别进行pcr即可，无需分别做标准曲线。采用spss19.0软件对数据进行统计学分析，数值变量以均数士标准差表示。对实时荧光定量中儿童i型糖尿病患者样本与正常儿童样本的结果进行独立样本t检验。6、结果采用2-△△ct相对定量法，以正常儿童组的mrna相对表达水平为1，儿童i型糖尿病组cyb5r1基因mrna水平为0.13±0.03，显著下降，差异具有统计学意义(p<0.05)。实施例3免疫印迹实验验证儿童i型糖尿病患者和正常儿童中差异表达基因的表达产物1、临床对象：同实施例2。2、单核细胞蛋白分离儿童i型糖尿病患者和正常儿童取静脉血10ml，注入盛肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀。肝素化的血液用pbs按1∶1比例稀释。将两倍体积的稀释后血液置于一倍体积的密度为1.080的ficoll-hypaque之上(boyum,seand.j.clin.lab.invest.97:1-109,1968)，于20℃以1000g离心30分钟。取出外周血单核细胞层，用5倍体积的pbs洗一次。将分离后的外周血单核细胞重悬于5ml的红细胞裂解缓冲液中(155mmnh4cl，10mmnahco3，ph7.4，0.1mmedta)，冰浴中放置5分钟，用pbs洗两遍。分离后的外周血单核细胞重悬于0.1或0.2ml(大约10倍于细胞体积)的缓冲液(20mmhepes，ph7.5，5mmmgcl2，120mmkci，10％甘油，1mm二硫苏糖醇)中，该缓冲液还包含0.5％nonidetp-40，继续冰浴10分钟裂解细胞。在25℃以8000g离心6分钟，获得上清物质-胞浆提取物。取上清用brandford法定量蛋白，分装成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存备用。3、westernblot检测(1)根据测定的蛋白浓度，按试验所需确定最小上样蛋白量，加入上样蛋白质量体积比5倍的蛋白上样缓冲液，用双蒸水补充上样总体积至15μl，然后将上样漩涡振荡，5000g离心5min，95℃恒温金属浴变性5-10min，得离心变性样品，备用；(2)将(1)制备好的样品进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，待溴酚蓝跑至玻璃板底部前，停止电泳；(3)将(2)完成电泳后的另一块凝胶用于做转膜，按滤纸-胶-nc膜-滤纸从下至上的顺序叠放，置于装有转膜缓冲液的槽中，冰上，100伏恒压转移1h-2h；(4)将(3)转膜结束的nc膜用tbst洗3次，每次5min，然后用5％脱脂奶粉封闭液封闭90min，将封闭好的nc膜放入用tbst稀释好的一抗中，室温摇床上孵育1h-2h，然后4℃保存，备用；(5)取(4)制备的膜，室温孵育1h后用tbst洗膜3次，每次10min，然后将膜放入用tbst稀释好的二抗中，室温孵育90min，用tbst洗膜3次，每次10min，采用ecl化学曝光法，将洗脱后的nc膜用图像扫描仪扫描，即得wb图谱。蛋白上样缓冲液由下列原料配置而成：32％0.5mol/ltris.hclph6.8，7.8％二硫苏糖醇，10％sds，0.2％溴酚蓝，50％甘油，混匀后分装，-20℃保存，使用前解冻。sds-聚丙烯酰胺凝胶由8％分离胶和4％浓缩胶组成；8％分离胶配置成分如下：2.7ml30％acr/bic(acr/bic比例为29.2:0.8)，2.5ml1.5mol/ltris.hclph8.8，0.1ml10％sds，0.1ml10％过硫酸铵，0.006mltemed，4.6mlddh2o，总体积10ml；4％浓缩胶配置成分如下：0.067ml30％acr/bic(acr/bic比例为29.2:0.8)，1.25ml0.5mol/ltris.hclph6.8，0.05ml10％sds，0.05ml10％过硫酸铵，0.005mltemed，3.581mlddh2o，总体积5ml。转膜缓冲液由下列原料的百分比配置而成：0.29％甘氨酸，0.58％tris碱，0.037％sds，甲醇20％，蒸馏水79％，溶解后室温保存。tbst由下列原料的百分比配置而成：0.1％tween-20，99.9％tbs，混匀后使用，现配现用，tbs配置方法：由3gtris-baseph7.5，8gnacl，0.2gkcl，ddh2o800ml，浓盐酸调节ph值到7.4，定容至1000ml，4℃贮存备用。5、统计学处理将蛋白条带的灰度值使用imagej软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。6、结果结果如图1所示，与正常儿童相比，儿童i型糖尿病患者血液中cyb5r1蛋白含量降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。sequencelisting<110>北京泱深生物信息技术有限公司<120>cyb5r1作为儿童i型糖尿病的诊断标志物<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1ctgaaagtccctgaagat18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2ctgaaagtccctgaagat18<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3tttaactctggtaaagtggatat23<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ggtggaatcatattggaaca20当前第1页12