一种与抗虫相关蛋白及其编码基因的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，尤其涉及一种与抗虫相关蛋白及其编码基因的应用。

背景技术：

当前在世界范围内，由于昆虫侵害对农作物造成的产量损失是非常巨大的。传统上控制昆虫侵害最普遍采用的途径是大量施用化学杀虫剂。化学杀虫剂的使用在取得了一定经济效益的同时，也带来了农药残毒、环境污染、生态破坏、害虫抗药性和再猖獗等严重问题。为适应农业可持续发展、环境保护和人类安全的需要，大力加强农业生物性灾害的可持续控制研究，是人类共同面临的问题，也是该领域科学研究面临的严峻挑战。因此，研究和利用植物的自身抗性基因从而有效控制农业虫害成为人类孜孜以求的目标。

作为植物激素家族的新成员，茉莉酸在调控植物对病虫害抗性方面起着重要作用。从上世纪90年代至今，人们利用拟南芥和番茄作为模式植物基本上阐明了茉莉酸的生物合成及信号转导途径，并发现通过遗传操作茉莉酸途径中的重要元件可以显著改变植物对昆虫的抗性。因此，对茉莉酸途径相关元件进行遗传操作在提高作物抗虫性方面具有巨大的应用潜力，并且能够为利用植物自身抗性建立环境友好的农业害虫可持续控制策略提供理论依据和技术手段。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。

本发明提供了如下1)-3)中任一种物质在调控植物抗虫性中的应用：

1)蛋白slja7；

2)编码蛋白slja7的dna分子；

3)含有编码蛋白slja7的dna分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述蛋白slja7为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

本发明第二个目的是提供抑制或沉默蛋白slja7基因表达的物质的用途。

本发明提供的抑制或沉默蛋白slja7基因表达的物质在提高植物抗虫性中的应用。

上述应用中，所述抑制或沉默蛋白slja7基因表达的物质为如下a)或b)或c)：

a)抑制或沉默蛋白slja7基因表达的rna片段；

b)编码所述rna的dna片段；

c)含有所述dna片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

上述应用中，所述rna片段为序列3或序列1第1-447位核苷酸编码的rna；

或所述dna片段包括正向片段、内含子和反向片段；

所述正向片段的核苷酸序列为序列1第1-447位核苷酸；

所述反向片段为所述正向片段的反向互补序列；

或所述dna片段的核苷酸序列为序列3。

上述应用中，

所述提高植物抗虫性体现在如下1)和/或2)：

1)所述植物上的虫的体积和/或重量增加；

2)所述植物中的pi-ii表达量增加。

上述中的抑制或沉默蛋白slja7基因表达的物质在培育抗虫性提高的植物中的应用也是本发明保护的范围。

本发明第3个目的是提供一种培育抗虫性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为降低或消除目的植物中蛋白slja7的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物组织的抗虫性高于所述目的植物。

上述方法中，

所述降低或消除目的植物中蛋白slja7的含量和/或活性为将权利要求2-5中任一所述的应用中的抑制或沉默蛋白slja7基因表达的物质导入目的植物中；

所述转基因植物组织的抗虫性高于所述目的植物体现在如下1)和/或2)：

1)所述转基因植物上的虫的体积和/或重量均小于所述目的植物；

2)所述转基因植物中的pi-ii表达量高于所述目的植物。

上述中，

所述虫为昆虫；

或所述虫为昆虫，所述昆虫为棉铃虫；

或所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述双子叶植物具体为番茄。

上述抑制或沉默蛋白slja7基因表达的物质也是本发明保护的范围。

上述含有所述dna片段的重组载体将干扰slja7表达的片段构建成camv35s启动子驱动下的slja7发卡沉默单元并将其导入植物双元表达载体(gatewaybinaryvector)pbin19相应酶切位点间得到的载体，命名为pbin19::slja7i(又命名为slja7i::rnai)，为将序列3所示的dna分子替换pbin19质粒的saci和xbai之间的dna片段得到的载体。

本发明的实验证明，slja7基因沉默的转基因番茄在受到棉铃虫侵害时，会比野生型番茄积累更多的抗性相关蛋白pis，使其对棉铃虫的抗性显著提高。因此，slja7基因与番茄对棉铃虫抗性相关；slja7蛋白及其部分编码基因可用于农牧业和生态环境治理所需的抗虫植物品种的培育与鉴定，在植物抗虫育种领域中具有重要作用。

附图说明

图1为slja7基因沉默的转基因番茄在饲喂棉铃虫4天后的地上部分抗虫表型结果。

图2为slja7基因沉默的转基因番茄在饲喂棉铃虫4天后棉铃虫的体积与重量统计结果。

图3为slja7基因沉默的转基因番茄在饲喂棉铃虫2天后地上部分的pi-iimrna相对表达量检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中定量实验，均重复三次，结果取平均值。

下述实施例中番茄采用番茄常规品种m82(以下也称为野生型番茄)，购自美国番茄遗传资源中心(tgrc，http://tgrc.ucdavis.edu/)

slja7蛋白的氨基酸序列为序列2，其编码基因的核苷酸序列为序列1第148至834位。

实施例1、slja7基因沉默的植物双元表达载体获得

1、用于slja7基因沉默的片段的获得

提取番茄(solanumlycopersicum)品种m82的总rna，反转录得到的cdna为模板，用引物1和引物2进行pcr扩增。

slja7i-f：5'ccgctcgagtctagaattgcatgaagcttctcaat3'(上游引物)

slja7i-r：5'cggggtaccaagcttattgtcataatttttccttg3'(下游引物)

得到477bppcr产物，利用omegadna纯化试剂盒纯化后待用。

经过测序，该pcr产物的核苷酸序列为序列3第1366-1812位(序列1第1-447位)，为用于slja7基因沉默的片段，命名为slja7i。

2、沉默载体的获得

1)含有发夹结构的中间载体的获得

hindiii&xbai分别双酶切原始phannibal质粒(记载于wesleysv,helliwellca,smithna,wangmb,rousedt,liuq,goodingps,singhsp,abbottd,stoutjesdijkpa,robinsonsp,gleaveap,greenag,waterhousepm.constructdesignforefficient,effectiveandhigh-throughputgenesilencinginplants.plantj.2001.27:581-590.，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)和上述477bp的pcr产物，得到5816bp的phannibal载体骨架和457bppcr产物酶切产物；

将5816bp的phannibal载体骨架和457bppcr产物酶切产物连接，得到phannibal::slja7。

kpni和xhoi分别双酶切phannibal::slja7质粒和上述477bp的pcr产物，收集6257bp的phannibal::slja7质粒酶切产物和469bp的pcr产物酶切产物，连接，得到phannibal::slja7i。

3、重组载体的获得

saci&spei双酶切phannibal::slja7i质粒，得到3821bp的酶切产物；

saci&xbai(spei的同尾酶)双酶切pbin19质粒(记载于bevanm.binaryagrobacteriumvectorsforplanttransformation.nucleicacidsres.1984.12(22):8711-8721.，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)，得到11760bp的pbin19载体骨架；

将3821bp的酶切产物和11760bp的pbin19载体骨架连接，得到重组载体pbin19::slja7i(又命名为slja7i::rnai)。

经过测序，重组载体pbin19::slja7i为将序列3所示的dna分子替换pbin19质粒的saci和xbai之间的dna片段得到的载体。

序列3所示的dna分子包括用于slja7基因沉默的片段(序列3第1366-1812位)、内含子(序列3第1826-2592位)和用于slja7基因沉默的片段的反向互补片段(序列3第2624-3070位)，该dna分子编码用于slja7基因沉默的片段编码的rna。

实施例2、slja7基因沉默转基因番茄的获得以及对昆虫抗性的遗传调控

一、slja7基因沉默的转基因番茄获得

1、slja7基因沉默的重组菌获得

将由实施例1得到的slja7基因沉默的重组表达载体slja7::rnai转化农杆菌agl0(记载于lic,liug,xuc,leegi,bauerp,linghq,ganalmw,howega.thetomatosuppressorofprosystemin-mediatedresponses2geneencodesafattyaciddesaturaserequiredforthebiosynthesisofjasmonicacidandtheproductionofasystemicwoundsignalfordefensegeneexpression.plantcell.2003.15(7):1646-1661.，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)，挑取单克隆，于含有卡那酶素与利福平抗生素的lb液体培养基中28℃过夜振荡培养，得到转化子。

将转化子进行菌液pcr鉴定(slja7i-f和slja7i-r，得到477bp的为阳性重组菌)，将阳性重组菌命名为agl0/slja7::rnai，并保存于-70℃备用。

2、slja7基因沉默的转基因番茄获得

1)番茄转化相关培养基的配制

液体ms培养基：将4.4gms盐、30g蔗糖和水混合，用水定容至1l，用1mol/lkoh调ph至5.8～6.0之间，高压灭菌。

种子生长培养基(1/2ms培养基)：将2.2gms盐、30g蔗糖和水混合，用水定容至1l，用1mol/lkoh调ph至5.8～6.0之间，加入0.8％的琼脂，高压灭菌。

预(共)培养培养基(d1)：将4.4gms、1.0mg玉米素(zeatin)和30g蔗糖溶于水中，用水定容至1l，用1mol/lkoh调ph至5.8～6.0之间，加0.8％的琼脂，高压灭菌。

筛选分化培养基(2z)：将4.4gms盐、2.0mg玉米素、50mg卡那霉素、100mg肌醇、0.5mg叶酸和20g蔗糖溶于水中，用水定容至1l，用1mol/lkoh调ph至5.8～6.0之间，加0.8％的琼脂，高压灭菌。

生根培养基：将4.4gms盐、50mg卡那霉素、0.5mg叶酸、0.5mg吲哚丁酸和30g蔗糖溶于水中，用水定容至1l，用1mol/lkoh调ph至5.8～6.0之间，加0.8％的琼脂，高压灭菌。

2)slja7基因沉默的转基因番茄的制备

(1)转化外植体的准备

取野生型番茄(品种m82)，挑选饱满、粒大种子，用75％乙醇浸泡2min，接着用10％naclo浸泡10min，用无菌水冲洗7遍，播种于种子生长培养基上，于25℃、16h光照/8h黑暗条件下光照培养。萌发8天后，在无菌条件下用锋利的剪刀将子叶切成小方块(动作要快)，将子叶小方块接种于预培养培养基中，于25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养，2d后，可用于番茄转化。

(2)侵染液的准备

将保存备用的agl0/slja7::rnai接种于含相应抗生素的lb液体培养基中，28℃、200rpm过夜培养。次日以1:100的比例转接至新的lb液体培养基中，28℃、200rpm培养至od600＝0.7。菌液以5000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体。用液体ms培养基重新悬浮菌体，稀释至od600＝0.4后加入50ul0.074mol/l的乙酰丁香酮，备用。

(3)外植体的转化、筛选与生根

将步骤(1)得到的子叶块分别浸入(2)制备好的侵染液10min,然后接种于d1培养基上(培养基上放滤纸)共培养2天，转入到筛选分化培养基(2z)中筛选培养，每2周继代一次，培养8周后产生抗性芽。当不定芽伸长至3cm时，用解剖刀将抗性芽切下，并转接至生根培养基上，进行生根培养，将生根的t0代转基因植株移入土中常规管理，收获t1代slja7::rnai的转基因番茄种子。

上述共培养、筛选培养、生根培养的条件均为：温度为25℃、16h光照/8h黑暗。

3)slja7基因沉默的转基因番茄的鉴定

将生长18天的两叶一心期的t1代slja7::rnai转基因番茄剪取植株地上部分，迅速用液氮速冻，-80℃保存。提取总rna，反转录得到cdna，以野生型番茄m82为对照，进行rt-pcr。

用于rt-pcr检测slja7表达水平的引物(扩增得到位于slja7编码区3’末端的162bp片段)为：

slja7-qf：5′-ttgctatggctcgtagagcaactc-3′

slja7-qr：5′-tttcccaatgaacgcttgacgacg-3′

以actin2为内参，用于扩增内参基因的rt-pcr引物为：

slact2-qf：5′-ttgctgaccgtatgagcaag-3′

slact2-qr：5′-ggacaatggatggaccagac-3′

结果t1代slja7::rnai的转基因番茄1#中slja7基因的相对表达量为0.0585，2#中slja7基因的相对表达量为0.0639；

野生型番茄m82中slja7基因的相对表达量为0.9342；

可以看出，与野生型番茄m82相比，t1代slja7::rnai转基因番茄1#/2#中的slja7基因表达水平均仅有野生型的6％左右，均为阳性可用的slja7基因沉默转基因植物。

4)纯合转基因番茄的获得

将上述鉴定为阳性的t1代slja7::rnai转基因番茄植株单株收种得到t2代种子，分别将30-40粒种子消毒后播在含75mg/l卡那霉素的1/2ms培养基上筛选(野生型m82在这种培养基上生长会受到严重抑制，表现为主根较短，侧根基本不发生，而转基因材料由于具有卡那霉素抗性生长基本不受抑制，主根和侧根的发生都很正常)，若某一个t1代slja7::rnai转基因植株收获的种子都表现为对卡那霉素抗性，则该t1代转基因植株为纯合体，其收获的种子也都是纯合体，可以用于后续的昆虫饲喂实验。

经鉴定，t2代slja7::rnai转基因番茄1#/2#t1代收获的种子都表现为对卡那霉素抗性，即t2代slja7::rnai转基因番茄1#/2#这两个株系都是纯合体。

采用同样的方法将空载体pbin19转入野生型番茄m82中，得到t0代转空载体番茄，收种、播种，直到得到t2代转空载体番茄。采用同样的方法检测其slja7基因相对表达量，结果表明，t2代转空载体番茄叶片中slja7表达量与野生型番茄m82相比，无显著差异。

二、slja7基因沉默的转基因番茄对昆虫抗性的遗传调控

棉铃虫(helicoverpaarmigera)在文献“wuk.,y.lu,h.feng,y.jiang,andj.zhao.2008.suppressionofcottonbollworminmultiplecropsinchinainareaswithbttoxin-containingcotton.science.321(5896):1676-1678.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

昆虫饲喂前，t2代slja7::rnai转基因番茄1#/2#、t2代转空载体番茄以及野生型番茄m82均在常规条件下培养：光照16小时，黑暗8小时，光照强度70microeinsteinsm^-2s^-2，温度25℃。

待植物长至4-6片真叶完全展开(大约需30天)时，取长势一致的2龄期棉铃虫小心放到植物上，任其自由取食。各取20株野生型番茄m82植株、t2代转空载体番茄和t2代slja7::rnai转基因番茄1#/2#进行实验，每棵植物放3头棉铃虫。待到饲喂第2天，采集地上部分叶片提取rna用于后续分析。

另一批野生型和转基因植株饲喂到第4天，对植物进行拍照记录，对饲喂相应植株的棉铃虫拍照记录并做重量统计。

实验结果表明，与野生型番茄m82相比，纯合的t2代slja7::rnai转基因番茄1#/2#在受到棉铃虫咀食后会积累更多的抗性相关蛋白pis，slja7基因沉默的转基因番茄slja7::rnai对棉铃虫的抗性显著提高，说明slja7基因与番茄对棉铃虫抗性相关。具体表现为：

1)棉铃虫饲喂到第4天，对植物进行拍照记录。

结果如图1所示，饲喂4天后t2代slja7::rnai转基因番茄1#/2#(图1中转基因植株1/2#)的生长点和叶片基本没受到破坏，基本保持完整；而作为对照的野生型番茄m82(图1中野生型)的生长点出现很多咀食的痕迹，叶片出现不少较大的空洞；野生型番茄m82与t2代转空载体番茄表现相同。

2)棉铃虫饲喂到第4天，对饲喂相应植株的棉铃虫拍照记录并做重量统计。

结果如图2所示，饲喂4天后，咀食纯合的t2代slja7::rnai转基因番茄1#/2#(图2中转基因植株1/2#)的棉铃虫体积(图2a)和重量(图2b)都显著低于咀食野生型番茄m82(图2中野生型)的棉铃虫；而咀食野生型番茄m82与t2代转空载体番茄的棉铃虫体积和重量都没有显著差异。

3)pi-ii作为番茄茉莉酸信号转导途径中的一个重要的标记基因，长期以来一直被用来衡量对昆虫的抗性。

检测饲喂第2天后的纯合的t2代slja7::rnai转基因番茄1#/2#和野生型番茄m82，以及t2代转空载体番茄中pi-ii的mrna相对表达量，方法如下：

a、番茄叶片rna提取

总rna的提取用trizol法提取：

1)将各株系上述不同时间取的番茄叶片在液氮中磨成粉末后，取100mg叶片粉末转入加有1mltrizol提取液的rnase-free离心管中，震荡混匀。

2)研磨液室温(25℃)放置5分钟，加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，剧烈摇荡离心管20秒，室温放置3分钟。4℃12000g离心15分钟。

3)取上层水相约600μl于一新离心管，加0.5ml异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000g离心10分钟。

4)弃去上清液，加入1ml的75％乙醇，涡旋混匀，4℃下12000g离心1分钟。

5)重复步骤4)，小心弃去上清液，然后室温或真空干燥10分钟，溶解于depc处理过的双蒸水中，得到rna。

b、单链cdna的合成

1)在200μl的rnase-free离心管中加入下列试剂：

模板rna(总rna)2μg

引物oligo(dt)18(0.5μg/μl)1μl

rnase-freeddh2o补至13μl

2)轻轻混匀后离心3～5s，70℃反应5分钟，迅速置于冰上冷却5分钟，然后加入：

3)终体积为25μl。轻轻混匀后稍离心，42℃反应60分钟，94℃反应5分钟后，置冰上进行后续实验或-20℃冷冻保存，得到cdna。

c、荧光定量rt-pcr分析

1)反应体系

sybrpremixextaq(2×)10μl

2)反应程序

95℃，30s；45cyclesof(95℃，10s；60℃，20s；72℃，20s)

3)数据分析

ct值为pcr管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。

δct＝ct(gene)-ct(actin)，以2-δct的值衡量基因的转录水平。

涉及到的定量pcr分析表达的基因及所用引物如下所示：

内参基因为actin2，用于扩增内参基因的rt-pcr引物为：

slact2-qf：5′-ttgctgaccgtatgagcaag-3′

slact2-qr：5′-ggacaatggatggaccagac-3′

检测pi-ii的rt-pcr引物为：

slpin2-qf：5′-aattatccatcatggctgttcac-3′

slpin2-qr：5′-cctttttggatcagattctcctt-3′

结果如图3所示(图3中，将作为对照的野生型番茄m82未接虫时pi-ii的mrna相对表达量设定为1)，饲喂棉铃虫前，t2代slja7::rnai转基因番茄1#/2#(图3中转基因植株1/2#)与对照植物野生型番茄m82(图3中野生型)相比，pi-ii的mrna相对表达量没有显著差异；而当饲喂棉铃虫2天后，与对照植物野生型番茄m82相比，slja7基因沉默的转基因番茄1/2#在受到昆虫嚼食后积累了更多的pi-ii，表明slja7基因沉默的转基因番茄对昆虫的抗性显著提高，与图1中植物地上部分叶片被咀食程度和图2中棉铃虫的大小与重量的结果一致；而野生型番茄m82与t2代转空载体番茄相比，在未接虫和接虫2天后pi-ii的mrna相对表达量都没有显著差异。上述实验均重复3次，结果一致。

上述结果证明slja7基因与番茄对棉铃虫抗性相关，说明slja7蛋白及其编码基因可用于农牧业和生态环境治理所需的抗虫植物品种的培育与鉴定，在植物抗虫育种领域中具有重要作用。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>一种与抗虫相关蛋白及其部分编码基因的应用

<160>3

<210>1

<211>834

<212>dna

<213>番茄(solanumlycopersicum)

<223>dna

<400>1

attgcatgaagcttctcaattttatctattattctacttgttactattttcttctacttt60

tttaacaattaataagaatatttattcttatttaattgattttctagttttaaatttgtt120

ttataaatctttggaagtgaaaaaaaaatggattcaagaatggagatagattttatggac180

ctcaacagcaaaccaaaattatcagaaatggagaagcaacacaaaaaagtatctggaatg240

aagtggccattttcattggctgatttagctactcaccatgaacacacattttttcagaat300

tacaaatccaccccaatagtttccattaattcaaaaaattcatccctaaacaattacaaa360

tccaccattgacccccaatactttagagggacttttcctctattagcaaaaacaagcact420

tatgactcaaggaaaaattatgacaatttgagtccaaatgagtcaacattgaccatattc480

tacatgggtgaggtccatatttttccgggtatatcaccagaaaaggctgagcttataatt540

gacctggtttctaaatcaacaactctccacatggatgagattttagaaaaagtgatgaat600

aaagaaaaatatgaagaaaataaatcagacccttcaaatgcatccacaaattatgctaaa660

ggagcacttgctatggctcgtagagcaactcttgcacgatttttggagaagagaaaacat720

agattgatcaaagctaggccgtatctatatggggaaaatttatcaaagtttccctttgat780

attcaacaacaagaagaagaaacggcgtcgtcaagcgttcattgggaaaactaa834

<210>2

<211>228

<212>蛋白质

<213>番茄(solanumlycopersicum)

<223>prt

<400>2

mdsrmeidfmdlnskpklsemekqhkkvsgmkwpfsladlathhehtffqnykstpivsi60

nsknsslnnykstidpqyfrgtfpllaktstydsrknydnlspnestltifymgevhifp120

gispekaeliidlvsksttlhmdeilekvmnkekyeenksdpsnastnyakgalamarra180

tlarflekrkhrlikarpylygenlskfpfdiqqqeeetasssvhwen228

<210>3

<211>3811

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gtcgagcggccgctcgacgaattaattccaatcccacaaaaatctgagcttaacagcaca60

gttgctcctctcagagcagaatcgggtattcaacaccctcatatcaactactacgttgtg120

tataacggtccacatgccggtatatacgatgactggggttgtacaaaggcggcaacaaac180

ggcgttcccggagttgcacacaagaaatttgccactattacagaggcaagagcagcagct240

gacgcgtacacaacaagtcagcaaacagacaggttgaacttcatccccaaaggagaagct300

caactcaagcccaagagctttgctaaggccctaacaagcccaccaaagcaaaaagcccac360

tggctcacgctaggaaccaaaaggcccagcagtgatccagccccaaaagagatctccttt420

gccccggagattacaatggacgatttcctctatctttacgatctaggaaggaagttcgaa480

ggtgaaggtgacgacactatgttcaccactgataatgagaaggttagcctcttcaatttc540

agaaagaatgctgacccacagatggttagagaggcctacgcagcaggtctcatcaagacg600

atctacccgagtaacaatctccaggagatcaaataccttcccaagaaggttaaagatgca660

gtcaaaagattcaggactaattgcatcaagaacacagagaaagacatatttctcaagatc720

agaagtactattccagtatggacgattcaaggcttgcttcataaaccaaggcaagtaata780

gagattggagtctctaaaaaggtagttcctactgaatctaaggccatgcatggagtctaa840

gattcaaatcgaggatctaacagaactcgccgtgaagactggcgaacagttcatacagag900

tcttttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacactct960

ggtctactccaaaaatgtcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttt1020

tcaacaaaggataatttcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactt1080

catcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaagg1140

aaaggctatcattcaagatctctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccac1200

gaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatg1260

tgacatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttc1320

ctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctcgagattgcatgaagcttc1380

tcaattttatctattattctacttgttactattttcttctacttttttaacaattaataa1440

gaatatttattcttatttaattgattttctagttttaaatttgttttataaatctttgga1500

agtgaaaaaaaaatggattcaagaatggagatagattttatggacctcaacagcaaacca1560

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