小鼠肺癌原位荷瘤放疗模型的建立与应用的制作方法

本发明涉及肿瘤模型及其建立与应用领域，具体地说，是一种可用于评估放射治疗效果的小鼠原位荷瘤模型的建立及其应用。

背景技术：

肺癌是威胁我国人民健康的头号杀手。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率明显增高，在男性癌瘤病人中，肺癌已居首位，在女性发病率也迅速增高，占女性常见恶性肿瘤的第2位或第3位。肺癌的病因至今尚不完全明确，但是严重影响了患者的生命健康和生存质量。目前肺癌的主要治疗手段包括手术治疗、放射治疗、化学治疗及靶向治疗。其中，放射治疗是非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)重要的局部治疗手段。近年来，肺癌的放疗和基础研究取得了较大发展，但目前肺癌放疗研究尚欠缺一种能更方便的评估放疗疗效的可靠研究平台，这严重制约了肺癌的基础和临床前研究。肺癌动物模型是肺癌放疗研究的重要手段。

目前的荷瘤方式主要分为原位荷瘤与异位荷瘤两种方式，这两种方法都有其各自的优点和局限性。异位荷瘤目前应用比较广泛，主要以皮下注射肿瘤细胞为主，如keshamouni等人将a549细胞注射入小鼠胸背部皮下，以模拟肺癌的发生(venkateshwargkeshamouni,rajucreddy,douglasaarenberg,binjujoel,victorjthannickal,gregorypkalemkerianandtheodorejstandiford.peroxisomeproliferator-activatedreceptor-cactivationinhibitstumorprogressioninnon-small-celllungcancer.oncogene(2004)23,100–108.)。其优点是操作方便、技术简单，然而其局限性也非常的明显，即与真正的小鼠肺癌的发生发展过程存在着较大的差距，无法达到较好的肺癌模拟效果。原位荷瘤模型，又分为原位诱发型和原位移植型。原位诱发型如张朝晖等设计的使balb/c小鼠长期吸入油烟以诱发肺癌的发生，或者使用基因敲除技术等手段诱发小鼠原位肺癌的发生(张朝晖陈锋谭佑铭让蔚清张丹罗招阳。烹调油烟致balb/c小鼠肺癌的病理变化。《中国公共卫生》2003年第12期1455-1457页。macias-perezi,borzac,chenx,yanx,ibanezr,mernaughg,matrisianlm,zentr,pozzia.lossofintegrinalpha1beta1ameliorateskras-inducedlungcancer.cancerres.2008aug1；68(15):6127-35)。该方法能够较好地模拟肺癌的发生发展过程，能够发挥较好地模拟效果，但是存在着建模周期过长、成本较高、不易推广等问题。原位移植型荷瘤是目前较常用的、成本低廉、可操作性较强的建模方法，主要代表包括zou等人将人肺癌细胞通过细针送入裸鼠气管内成瘤、魏淑珍等人在小鼠呼吸机的支持下通过开胸手术将人肺癌组织直接种植于裸鼠肺叶等方法(zouy,wuqp,tanseyw,chowd,hungmc,charnsangavejc,wallaces,lic.effectivenessofwatersolublepoly(l-glutamicacid)-camptothecinconjugateagainstresistanthumanlungcancerxenograftedinnudemice.intjoncol.2001feb；18(2):331-6.魏淑珍，gfp标记的肺癌裸鼠原位模型的建立及埃克替尼体内抑瘤作用的研究，南京大学学位论文，2010)。此类方法也存在着成瘤部位以及大小不稳定、操作难度大、设备要求高等缺陷。另外，因裸鼠存在着天然免疫缺陷，其荷瘤模型并不能很好地反映出在机体正常免疫条件下肿瘤的发生发展过程。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠原位荷瘤模型的建立及其应用。

本发明参考了前人小鼠荷瘤模型的优缺点，设计并实施了可视条件下经肋间隙穿刺的荷瘤方法，操作难度较小，对实验设备的需求不高，具有较高的可操作性。同时，本发明选取了正常c57bl/6小鼠制作荷瘤模型，能够较好地反映出天然免疫条件下，肺癌发生发展的过程，模拟效果较好。另外，本发明选取的肺癌细胞为荧光素酶转染的小鼠路易斯肺癌细胞株(llc)，其肿瘤细胞的活力可通过小动物活体成像仪间接检测，便于实验者实时动态监测小鼠肺癌的发展过程。结果显示，该荷瘤方法有成瘤率高、存在较长的实验时间窗、便于实时动态监测肺癌发展过程的优点，具有较高的实用价值。

本发明的第一方面，提供一种可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠的原位荷瘤模型的建立方法，包括以下步骤：利用野生型小鼠为载体，利用基因重组技术将萤火虫荧光素酶基因引入人肺腺癌llc细胞株中，通过亚克隆筛选获得稳定表达荧光素酶的肿瘤克隆细胞株，然后采用重组的llc细胞接种于小鼠肺部构建而成。

优选的，所述的可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠的原位荷瘤模型的建立方法，包括以下步骤：

a)将萤火虫荧光素酶luciferase质粒采用脂质体转染法转入人肺腺癌llc细胞，流式筛选出稳定表达荧光素酶报告基因的重组细胞株并进行扩大培养；

b)将得到的重组人肺腺癌llc细胞经消化后重悬于dmem培养基中，在具有正常免疫功能的c57/bl6小鼠右下肺接种该重组人肺腺癌llc细胞，即得到可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠的原位荷瘤模型。

优选的，所述的重组人肺腺癌llc细胞采用注射的方式接种于小鼠肺部。

优选的，所述的步骤a中的转染试剂为lip3000转染试剂。

优选的，所述的步骤b中的重组人肺腺癌llc细胞浓度为2×10⁶个/ml。

优选的，所述的步骤b中右下肺接种重组人肺腺癌llc细胞的固定位置为小鼠胸骨剑突右侧10mm处，经过小鼠右下第一或第二肋间隙垂直进针，进针深度5mm。

优选的，所述的原位荷瘤模型建立后通过游标卡尺测量和小动物活体成像仪监测肿瘤生长情况。

更优选的，具体包括以下步骤：

a)将llc细胞加入dmem(10％fbs，体积浓度)体外传代培养；

b)胰酶消化离心后，将llc细胞铺入24孔板中，细胞浓度为5×10⁴个/ml；

c)12h后使用lip3000将萤火虫荧光素酶质粒转入llc细胞，萤火虫荧光素酶质粒与lip3000的比例为1:1.5。转染24h后进行换液，并使用荧光显微镜观察转染效果；

d)转染72h后将24孔板内细胞铺入96孔板中进行亚克隆筛选，选出高表达萤火虫荧光素酶基因的llc细胞，并进行扩增；

e)使用dmem培养基重悬吹匀重组的llc，配制成2×10⁶浓度的细胞悬液后备用；

f)在c57bl/6小鼠右下肺注射接种该重组人肺腺癌llc细胞，注射细胞悬液25μl。

进一步的，所述的步骤f注射接种可采用以下步骤：

①用10％水合氯醛麻醉c57bl/6小鼠后，使其左侧卧于手术台上并固定；

②如图1a所示，消毒后，于小鼠胸骨剑突右侧10mm处，切开皮肤并剥离右侧胸壁前肌层，暴露小鼠胸腔壁层及肋间隙，可见其活动的右下肺叶；

③吹匀重组的llc细胞悬液，用微量注射器吸入。如图1b所示，在肉眼直视状态下，通过小鼠右下第一或第二肋间隙垂直进针，进针深度5mm，注射细胞悬液25μl；

④逐层缝合小鼠肌层及皮肤，再次消毒，并使其复温苏醒。

本发明的第二方面，提供一种采用上述方法建立的可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠的原位荷瘤模型。

本发明的第三方面，提供一种上述的可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠的原位荷瘤模型在评价放射治疗效果中的应用。

本发明优点在于：

本发明与传统的肿瘤模型相比，传统的肿瘤模型不能充分代表肺癌生物学特征，而本发明的原位荷瘤模型能模拟肺癌病理生理环境，在肺癌的诊断和治疗中具有重要意义，且该模型具有荧光素酶基因，可在小动物活体成像仪中进行成像，便于实时动态监测肺癌发展过程，观察更加直观方便，可进行活体观察而不损伤动物，结果更加可靠，具有良好的应用前景。

附图说明

图1a为荷瘤方法示意图；

图1b为注射器进针深度示意图；

图2为荷瘤小鼠肺组织大体变化；

图3为荷瘤小鼠肺组织he染色变化；

图4a为荷瘤小鼠活体成像肿瘤变化；

图4b为荷瘤小鼠活体成像荧光强度变化；

图5为荷瘤小鼠局部胸部照射方法示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠原位荷瘤模型的建立方法

经第二军医大学伦理委员会同意开展本项目研究工作。

将萤火虫荧光素酶基因引入小鼠路易斯肺癌llc细胞株中，通过亚克隆筛选获得稳定表达荧光素酶的肿瘤克隆细胞株，并进行扩增。使用dmem培养基重悬吹匀重组的llc，配制成2×10⁶浓度的细胞悬液后备用。用10％水合氯醛麻醉c57bl/6小鼠后，使其左侧卧于手术台上并固定。消毒后，于小鼠胸骨剑突右侧10mm处，切开皮肤并剥离右侧胸壁前肌层，暴露小鼠胸腔壁层及肋间隙，可见其活动的右下肺叶。在肉眼直视状态下，通过小鼠右下第一或第二肋间隙垂直进针，进针深度5mm，注射细胞悬液25μl。逐层缝合小鼠肌层及皮肤，再次消毒，并使其复温苏醒。

具体包括以下步骤：

1)将llc细胞加入dmem(10％fbs)体外传代培养。

2)胰酶消化离心后，将llc细胞铺入24孔板中，细胞浓度为5×10⁴个/ml。

3)12h后使用lip3000将萤火虫荧光素酶质粒转入llc细胞，萤火虫荧光素酶质粒与lip3000的比例为1:1.5。转染24h后进行换液，并使用荧光显微镜观察转染效果。

4)转染72h后将24孔板内细胞铺入96孔板中进行亚克隆筛选，选出高表达萤火虫荧光素酶基因的llc细胞，并进行扩增。

5)使用dmem培养基重悬吹匀重组的llc，配制成2×10⁶浓度的细胞悬液后备用。

6)用10％水合氯醛麻醉c57bl/6小鼠后，使其左侧卧于手术台上并固定。

7)如图1a所示，消毒后，于小鼠胸骨剑突右侧10mm处，切开皮肤并剥离右侧胸壁前肌层，暴露小鼠胸腔壁层及肋间隙，可见其活动的右下肺叶。

8)吹匀重组的llc细胞悬液，用微量注射器吸入。如图1b所示，在肉眼直视状态下，通过小鼠右下第一或第二肋间隙垂直进针，进针深度5mm，注射细胞悬液25μl。

9)逐层缝合小鼠肌层及皮肤，再次消毒，并使其复温苏醒。

实施例2：

(1)正常免疫功能的小鼠原位荷瘤模型同实施例1；

(2)小鼠喂养：将小鼠置于25±1℃日常更换垫料的笼子中，保证水分及食物充足。

(3)分别于小鼠荷瘤前及荷瘤后1、2、3周时，各选取3只小鼠，用10％水合氯醛麻醉后，处死并解剖小鼠，取出小鼠全肺，于生理盐水中洗净后，观察肿瘤的生长情况并测量其最大直径。如图2所示，肺组织观察可见，未荷瘤小鼠肺组织色泽红润、光滑有弹性，未见肿瘤组织。小鼠荷瘤1周后，肺组织可见明显的肿瘤组织，最大直径约1毫米，表面光滑，内部呈透明浆液状。荷瘤2周后，肿瘤组织生长明显，最大直径2毫米左右，表面凹凸不平，呈实质状，肿瘤组织表面可见出血坏死灶及炎症反应。荷瘤3周后，全肺组织呈暗红色，炎症反应明显，肿瘤组织迅速增长，最大直径增长至4毫米左右，表面可见显著的出血坏死灶及破溃，全肺散在多个肿瘤转移灶，心包及支气管表面可见大量乳白色

实施例3：

(1)正常免疫功能的小鼠原位荷瘤模型同实施例1；

(2)小鼠喂养：将小鼠置于25±1℃日常更换垫料的笼子中，保证水分及食物充足。

(3)分别于小鼠荷瘤前及荷瘤后1、2、3周时，各选取3只小鼠，用10％水合氯醛麻醉后，处死并解剖小鼠，取出小鼠全肺，于生理盐水中洗净后，分离生长肿瘤的肺叶,进行h&e染色。如图3所示，肺组织病理切片显示，未荷瘤小鼠肺泡壁结构正常。小鼠荷瘤1周后，肺组织病理切片可见明显的肿瘤组织浸润，肿瘤组织异型细胞生长密集，突出于肺组织表面，完全破坏了肺组织结构。荷瘤2周后，肿瘤组织迅速增大，与正常肺组织存在明显的交界，肿瘤组织内出现了明显的坏死灶。荷瘤3周后，肿瘤组织与正常肺组织交界变得模糊，正常肺组织发生了严重的炎症反应，肿瘤组织内部出现明显的坏死液化灶。

实施例4：

(1)正常免疫功能的小鼠原位荷瘤模型同实施例1；

(2)小鼠喂养：将小鼠置于25±1℃日常更换垫料的笼子中，保证水分及食物充足。

(3)分别于小鼠荷瘤前及荷瘤后1、2、3周时，各选取3只小鼠，在气体麻醉状态下进行活体成像。如图4a和图4b所示，未荷瘤小鼠体内未检测到荧光素酶的表达。荷瘤1至3周后，小鼠胸腔内荧光素酶的表达量进行性增高，范围进行性增大，反映出了肿瘤组织在胸腔内进行性生长增大的过程。

实施例5：

如图5所示，为小鼠胸部照射示意图。用10％水合氯醛麻醉小鼠，使用模具固定，用铅砖遮挡小鼠胸部以外区域后，采用15gy大剂量单次照射，剂量率1gy/min。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。