鉴定绥芬河三块鱼不同洄游群体的方法与流程

本发明涉及一种洄游鱼类种质的鉴定方法。

背景技术：

三块鱼又名远东红鳍鱼、滩头鱼，是雅罗鱼亚科三块鱼属(tribolodon)几种土著经济种的统称。三块鱼主要分布于北太平洋日本海的近海水域及其淡水河流，北限黑龙江，南限朝鲜半岛(俄罗斯的黑龙江、萨哈林、滨海区，日本的北海道、本州、四国、九洲及朝鲜半岛水域)，在我国仅分布于绥芬河和图们江流域。绥芬河是日本海的注水河流之一，每年4～6月份，三块鱼性腺发育成熟后，从日本海分批溯河而上进入河口，在急滩哨口处中产卵，故此得名“滩头鱼”，产卵后立即返回近海区。

渔民根据其洄游时间和体色差异分为“金滩头”、“银滩头”和“黑滩头”。4月初游来第一批，鱼身两侧各有数条桔红色条纹，在阳光照耀下金光闪闪，称“金滩头”；5月第二批，体侧条纹为银白色，称“银滩头”；6月第三批，鱼身条纹浓黑，称“黑滩头”，数量比前两批多。目前综合国内外对三块鱼属鱼类的分类和分布情况来看，实际洄游到我国的三块鱼只有金滩头和黑滩头两种，但是在实际采样过程中却发现有些个体既不像金滩头也不像黑滩头，其形态特征介于二者之间。

三块鱼是传统的名贵珍稀鱼类，肉质细嫩、肉味鲜美，肉中蛋氨酸和赖氨酸等人体必需氨基酸含量比一般鱼类高，含有丰富的不饱和脂肪酸和维生素a、维生素d等。研究证明，三块鱼体内含有一种多糖黏蛋白质，有促进细胞发育和提高机体免疫力的功能，有降低胆固醇，防止动脉硬化、冠心病的功效，对代谢性疾病、身体虚弱等也有较好疗效。历史上，三块鱼与兴凯湖的大白鱼和乌苏里江的鲑鱼并称为“边塞三珍”，曾是皇室贡品。由于水域环境遭到破坏，加之污染和滥捕滥捞等多种原因，我国三块鱼资源濒临枯竭，价格昂贵高达120元/公斤。为了增加三块鱼的野生种群数量，我国东宁县鲑鱼孵化放流站(绥芬河)从1989年开始每年通过捕捞洄游产卵群体，通过人工繁殖、放流，补充三块鱼野生资源。

由于三块鱼属的鱼类在形态方面非常相近，难以辨别，且极易发生杂交。因此在人工繁殖过程中易发生形态判别错误造成种质混杂。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种鉴定方法，能够准确地鉴定出纯正的“金滩头”和“黑滩头”三块鱼，从而避免人工繁殖过程造成的种质混杂，保护种质资源。

本发明用于鉴定三块鱼的微卫星引物对，其中黑滩头有效检测标记微卫星引物对为ssr-1，ssr-1正向鉴定引物核苷酸序列为5'-cttgtggtgctggttcttca-3'；ssr-1反向鉴定引物核苷酸序列为5'-gatgtggcagaccctgactt-3'；其中金滩头有效检测标记微卫星引物对为ssr-2，ssr-2正向鉴定引物核苷酸序列为5'-tggttggacagcaaacaaag-3'；ssr-2反向鉴定引物核苷酸序列为5'-tgaaggtctggctgatgatg-3'。

利用上述微卫星引物对鉴定绥芬河三块鱼不同洄游群体的方法按以下步骤进行：

一、样本dna的提取；

二、pcr检测：

pcr反应体系为15μl，由10.8μl自制混合buffer、0.5μl正向检测引物、0.5μl反向检测引物、2μl样本dna、0.2μl酶活为1u的taqdna聚合酶和1μl去离子无菌水组成；其中，0.5μl正向鉴定引物中含正向鉴定引物10mmol/l，0.5μl反向鉴定引物中含反向鉴定引物10mmol/l，2μl样本dna中含步骤一获得的样本dna50ng，10.8μl自制混合buffer中含50mmol/l的kcl、10mmol/l的tris-hcl、0.1％体积的tritonx-100、1.5mmol/lm的mgcl2、0.1％体积的np-40、0.01％体积的明胶和200μmol/l的4种dntp混合液；

pcr的扩增条件为：94℃预变性5min，变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃60s，共25个循环，延伸72℃7min；

三、pcr扩增产物的毛细管凝胶电泳；

四、鉴定：按以下步骤逐步筛选鉴定

(1)ssr-2扩增出230bp和228bp两条条带的样品鱼为杂交种三块鱼；

(2)ssr-1扩增出230bp条和224bp两条条带的样品鱼为纯种黑滩头三块鱼；

(3)ssr-1扩增出230bp条带且无其他条带的样品鱼为纯种黑滩头三块鱼；ssr-1扩增出230bp条带并包含他条带的样品鱼为杂交种三块鱼；

(4)ssr-2扩增出含有230bp条带的样品鱼则为纯种金滩头三块鱼。

本发明用于鉴定三块鱼的微卫星引物对为自行设计，具有特异性强、鉴定结果准确、能够准确的区分金滩头三块鱼、黑滩头三块鱼或二者的杂交种。本发明鉴定方法具有步骤简单、可操作性强、鉴定过程快、鉴定结果准确的优点。

附图说明

图1是实施例1中用黑滩头有效检测标记微卫星引物对ssr-1对所有样品鱼进行pcr扩增获得的等位基因分布图。

图2是实施例1中用金滩头有效检测标记微卫星引物对ssr-2对所有样品鱼进行pcr扩增获得的等位基因分布图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式用于鉴定三块鱼的微卫星引物对，其中黑滩头有效检测标记微卫星引物对为ssr-1，ssr-1正向鉴定引物核苷酸序列为5'-cttgtggtgctggttcttca-3'；ssr-1反向鉴定引物核苷酸序列为5'-gatgtggcagaccctgactt-3'；其中金滩头有效检测标记微卫星引物对为ssr-2，ssr-2正向鉴定引物核苷酸序列为5'-tggttggacagcaaacaaag-3'；ssr-2反向鉴定引物核苷酸序列为5'-tgaaggtctggctgatgatg-3'。

具体实施方式二：本实施方式鉴定绥芬河三块鱼不同洄游群体的方法按以下步骤进行：

一、样本dna的提取；

二、pcr检测：

pcr反应体系为15μl，由10.8μl自制混合buffer、0.5μl正向检测引物、0.5μl反向检测引物、2μl样本dna、0.2μl酶活为1u的taqdna聚合酶和1μl去离子无菌水组成；其中，0.5μl正向鉴定引物中含正向鉴定引物10mmol/l，0.5μl反向鉴定引物中含反向鉴定引物10mmol/l，2μl样本dna中含步骤一获得的样本dna50ng，10.8μl自制混合buffer中含50mmol/l的kcl、10mmol/l的tris-hcl、0.1％体积的tritonx-100、1.5mmol/lm的mgcl2、0.1％体积的np-40、0.01％体积的明胶和200μmol/l的4种dntp混合液；

pcr的扩增条件为：94℃预变性5min，变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃60s，共25个循环，延伸72℃7min；

用于鉴定三块鱼的微卫星引物对，其中黑滩头有效检测标记微卫星引物对为ssr-1，ssr-1正向鉴定引物核苷酸序列为5'-cttgtggtgctggttcttca-3'；ssr-1反向鉴定引物核苷酸序列为5'-gatgtggcagaccctgactt-3'；其中金滩头有效检测标记微卫星引物对为ssr-2，ssr-2正向鉴定引物核苷酸序列为5'-tggttggacagcaaacaaag-3'；ssr-2反向鉴定引物核苷酸序列为5'-tgaaggtctggctgatgatg-3'。

三、pcr扩增产物的毛细管凝胶电泳；

四、鉴定：按以下步骤逐步筛选鉴定

(1)ssr-2扩增出230bp和228bp两条条带的样品鱼为杂交种三块鱼；

(2)ssr-1扩增出230bp条和224bp两条条带的样品鱼为纯种黑滩头三块鱼；

(3)ssr-1扩增出230bp条带且无其他条带的样品鱼为纯种黑滩头三块鱼；ssr-1扩增出230bp条带并包含他条带的样品鱼为杂交种三块鱼；

(4)ssr-2扩增出含有230bp条带的样品鱼则为纯种金滩头三块鱼。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤一：取样本鱼鳍置于1.5ml离心管中再依次加入600μl裂解液和10μl蛋白酶k，混匀后置于55℃水浴锅中消化过夜；消化后加入10μlrna酶混匀后置于37℃水浴锅中水浴1h；然后加入600μl苯酚与氯仿混合液，混匀后常温下12000r/min离心10min；取离心上层清液置于另一个空离心管中，再加入1ml无水酒精混匀，常温下12000r/min离心10min；离心后旋转倒出酒精再加入500μl浓度为70％的乙醇，常温下12000r/min离心5min；之后用移液枪将乙醇移出，剩余物再12000r/min离心1min，离心结束将残留的酒精倒出后置于室温下干燥，去除残余的酒精后加入30μl～50μl1×te于-40℃下保存备用，即完成样本dna提取。其它步骤及参数与实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三的不同点是：步骤一中苯酚与氯仿混合液中苯酚与氯仿的体积比为1:1。其它步骤及参数与实施方式二或三相同。

实施例1

2016年4～6月份采集的三块鱼，再根据三块鱼不同繁殖群体在黑龙江东宁县绥芬河的洄游时间及形态学差异将其分为金滩头、黑滩头和杂交体，分别取黑滩头(分别标记为h1-h40)、金滩头(分别标记为j1-j40)各40尾，以及疑似杂交体(分别标记为z1-z10)10尾；所有样本鱼鳍条都置于95％酒精中保存备用。

一、样本dna的提取：

取样本鱼鳍置于1.5ml离心管中再依次加入600μl裂解液和10μl蛋白酶k，混匀后置于55℃水浴锅中消化过夜；消化后加入10μlrna酶混匀后置于37℃水浴锅中水浴1h；然后加入600μl苯酚与氯仿混合液，混匀后常温下12000r/min离心10min；取离心上层清液置于另一个空离心管中，再加入1ml无水酒精混匀，常温下12000r/min离心10min；离心后旋转倒出酒精再加入500μl浓度为70％的乙醇，常温下12000r/min离心5min；之后用移液枪将乙醇移出，剩余物再12000r/min离心1min，离心结束将残留的酒精倒出后置于室温下干燥，去除残余的酒精后加入30μl～50μl1×te于-40℃下保存备用，即完成样本dna提取；其中苯酚与氯仿混合液中苯酚与氯仿的体积比为1:1

二、pcr检测：

pcr反应体系为15μl，由10.8μl自制混合buffer、0.5μl正向检测引物、0.5μl反向检测引物、2μl样本dna、0.2μl酶活为1u的taqdna聚合酶和1μl去离子无菌水组成；其中，0.5μl正向鉴定引物中含正向鉴定引物10mmol/l，0.5μl反向鉴定引物中含反向鉴定引物10mmol/l，2μl样本dna中含步骤一获得的样本dna50ng，10.8μl自制混合buffer中含50mmol/l的kcl、10mmol/l的tris-hcl、0.1％体积的tritonx-100、1.5mmol/lm的mgcl2、0.1％体积的np-40、0.01％体积的明胶和200μmol/l的4种dntp混合液；

pcr的扩增条件为：94℃预变性5min，变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃60s，共25个循环，延伸72℃7min；

用于鉴定三块鱼的微卫星引物对，其中黑滩头有效检测标记微卫星引物对为ssr-1，ssr-1正向鉴定引物核苷酸序列为5'-cttgtggtgctggttcttca-3'；ssr-1反向鉴定引物核苷酸序列为5'-gatgtggcagaccctgactt-3'；其中金滩头有效检测标记微卫星引物对为ssr-2，ssr-2正向鉴定引物核苷酸序列为5'-tggttggacagcaaacaaag-3'；ssr-2反向鉴定引物核苷酸序列为5'-tgaaggtctggctgatgatg-3'。

三、pcr扩增产物的毛细管凝胶电泳：

将标记两种不同荧光集团的扩增产物混和并在abi3730xl自动测序仪上进行毛细管电泳，片段大小由genemapper3.7软件和genescan500lizsizestandard共同决定；数据采集后进行手动校准，条带不清的个体重新进行电泳。

四、鉴定：按以下步骤逐步筛选鉴定

(1)先将ssr-2扩增出230bp和228bp两条条带的样品鱼鉴定为杂交种三块鱼；

(2)然后将其余三块鱼中ssr-1扩增出230bp条和224bp两条条带的样品鱼鉴定为纯种黑滩头三块鱼；

(3)之后将剩余三块鱼中ssr-1扩增出230bp条带且无其他条带的样品鱼鉴定为纯种黑滩头三块鱼；ssr-1扩增出230bp条带并包含他条带的样品鱼鉴定为杂交种三块鱼；

(4)最后剩下的三块鱼经ssr-2扩增均含有230bp条带，被鉴定为纯种金滩头三块鱼。

本实施例中采用黑滩头有效检测标记微卫星引物对ssr-1对所有样品鱼进行pcr扩增，共扩增出6个等位基因，分别为221bp、224bp、227bp、230bp、233bp和236bp(如图1所示)；采用金滩头有效检测标记微卫星引物对ssr-2对所有样品鱼进行pcr扩增，共扩增出7个等位基因，分别为222bp、228bp、230bp、232bp、234bp、236bp和238bp(如图2所示)。

根据本发明方法鉴定结果为：黑滩头共有42个(h1、h3～h18、h20～h40、j18、j29、j35、z10)，金滩头共有40个(j1～j14、j16、j17、j19～j23、j25～j28、j30～j34、j37、j39、j40、z1、z2、z5～z9)，杂交种共有8个(h2、h19、j15、j24、j36、j38、z3、z4)。本发明方法的鉴定结果证明，仅依据三块鱼不同繁殖群体在黑龙江东宁县绥芬河的洄游时间及形态学差异进行分类不够准确，极其容易导致不同类型的三块鱼混杂，造成种质不纯，严重威胁野生种质资源。

本发明方法利用2对微卫星引物对对样本进行扩增、综合分析，提高了鉴定地准确性，而且根据2对微卫星引物对的dna扩增结果客观分析，符合生物遗传学的规律。