一种从球毛壳菌中提取球毛壳菌素A前体化合物的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从球毛壳菌中提取球毛壳菌素a前体化合物的方法。

背景技术：

球毛壳菌（chaetomiumglobosum）属于子囊菌门、毛壳属真菌。该属真菌能产生结构多样且生物活性显著的次生代谢产物，如：球毛壳素类、氧杂蒽酮类、蒽醌类、色酮类、缩酚酸环醚类、萜类和甾体类化合物等具有抗肿瘤、抗疟疾、细胞毒性、酶抑制活性和抗菌活性。

研究表明prochaetoglobosinsⅰ、ⅱ和ⅲ属于球毛壳菌素a的前体化合物（oikawah,murakamiy,ichiharaa.usefulapproachtofindtheplausiblebiosyntheticprecursorsofsecondarymetabolitesusingp-450inhibitors:postulatedintermediatesofchaetoglobosina[j].journalofthechemicalsocietyperkintransactions,1992,1(21):2949-2953.），是细胞松弛素类化合物，其中，prochaetoglobosinsⅰ和ⅱ对p388小鼠白血病细胞株有很强的细胞毒活性（ic50=1.58-4.90μg/ml），而且对枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis），树脂枝孢霉（cladosporiumresinae）和毛癣菌（trichophytonmentagrophytes）也有很好的抗菌活性。

公开号为cn102925369b的中国专利公开了一种具杀线虫活力的球毛壳菌及其产生的代谢产物和应用，其代谢产物即为球毛壳菌素a，其具有杀线虫活性，而本发明则首次公开了球毛壳菌素a的前体化合物的制备方法，为球毛壳菌素a生物合成奠定基础。

技术实现要素：

本发明提供一种从球毛壳菌中提取球毛壳菌素a前体化合物的方法，其提取工艺简单，生产成本低，绿色环保，效率高。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种从球毛壳菌中提取球毛壳菌素a前体化合物的方法，球毛壳菌素a前体化合物包括prochaetoglobosinⅰ、prochaetoglobosinⅱ和prochaetoglobosinⅲ，结构式如下：

；

其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）菌种活化：将球毛壳菌接种到平板培养基上，常温条件下培养3~5d，获得活化菌种；

（2）初级培养：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到sd培养基中，在24~28℃条件下培养3~5d，得种子液；

（3）次级培养：将步骤（2）制备的种子液接种到sd培养基中，并加入8~12μm组蛋白酶抑制剂，种子液的体积为sd培养基体积的1~5%，在24~28℃条件下培养20~30d得发酵液；

（4）粗提物制备：将步骤（3）得到的发酵液经抽滤得到菌丝体，菌丝体在38~42℃下恒温干燥后加乙酸乙酯浸提，得粗提物；

（5）硅胶柱层析：将步骤（4）制备的粗提物经硅胶柱层析，用薄层层析检测，合并相同流份，流份备用；

（6）反相高效液相纯化：将步骤（5）制备的流份用反相高效液相色谱纯化，减压浓缩干燥得prochaetoglobosinⅰ、prochaetoglobosinⅱ和prochaetoglobosinⅲ。

具体的，所述平板培养基的配方为：蛋白胨10.0g/l、酵母浸出粉10.0g/l、葡萄糖40.0g/l、琼脂20.0g/l，ph6.0±0.1；所述sd培养基的配方为：蛋白胨10.0g/l、葡萄糖40.0g/l，ph自然。

具体的，所述步骤（3）中组蛋白酶抑制剂为辛二酰双羟肟酸。

具体的，所述步骤（6）中的反相高效液相色谱条件为：

色谱柱：ymcc18，5μm，250×10mm；

流动相组成为乙腈∶水＝70∶30；

流速：2ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：220，254nm；

进样量：25μl；

保留时间：tr1=37.1min、tr2=33.2min、tr3=13.4min。

本发明的有益效果是：

与现有技术相比，本发明以球毛壳菌为原料制进行球毛壳菌素a前体化合物prochaetoglobosinsⅰ、ⅱ和ⅲ的提取，并经硅胶柱层析和反向高效液相纯化，纯化获得的球毛壳菌素a前体化合物纯度高（99.5%），本发明具有方法简单、成本低、安全环保的特点，为促进球毛壳菌素a的生物合成及其前体化合物在生物医药领域的广泛开发提供基础。

附图说明

图1为实施例1中prochaetoglobosinⅰ的¹h-nmr图；

图2为实施例1中prochaetoglobosinⅰ的¹³c-nmr图；

图3为实施例1中prochaetoglobosinⅰ的质谱图；

图4为实施例1中prochaetoglobosinⅱ的¹h-nmr图；

图5为实施例1中prochaetoglobosinⅱ的¹³c-nmr图；

图6为实施例1中prochaetoglobosinⅱ的质谱图；

图7为实施例1中prochaetoglobosinⅲ的¹h-nmr图；

图8为实施例1中prochaetoglobosinⅲ的¹³c-nmr图；

图9为实施例1中prochaetoglobosinⅲ的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。以下实施例中所用的辛二酰双羟肟酸为市售，球毛壳菌购自上海北诺生物科技有限公司（球毛壳菌chaetomiumglobosumatcc6205）。

实施例1

一种从球毛壳菌中提取球毛菌壳素a前体化合物的方法；包括以下步骤：

（1）菌种活化：将球毛壳菌接种到平板培养基上，常温条件下培养3d，获得活化菌种；

平板培养基的配方为：蛋白胨10.0g/l、酵母浸出粉10.0g/l、葡萄糖40.0g/l、琼脂20.0g/l，ph6.0±0.1；

（2）初级培养：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到sd培养基中，在120r/min，25℃条件下，摇床培养3d，得种子液；sd培养基的配方为：蛋白胨10.0g/l、葡萄糖40.0g/l，ph自然；

（3）次级培养：将步骤（2）制备的种子液接种到sd培养基中，并加入10μm组蛋白抑制剂（辛二酰双羟肟酸），种子液的体积为sd培养基体积的1%，在120r/min，25℃条件下，震荡培养21d得发酵液5l；

（4）粗提物制备：将步骤（3）制备的发酵物经抽滤得到菌丝体，菌丝体在40℃下恒温干燥后用乙酸乙酯浸泡10h后，超声处理20min得浸提液，浸提液经旋蒸得粗提物5g，回收乙酸乙酯；

（5）硅胶柱层析：将步骤（4）制备的粗提物经硅胶拌样后装柱，先用固定相为80~100目硅胶柱，以二氯甲烷：甲醇体积比为100:1，90:1，80:1，70:1，60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，10:1进行梯度洗脱，取部分洗脱液（二氯甲烷与甲醇的体积比为20:1）再用固定相为200~300目硅胶柱，以二氯甲烷：甲醇体积比=30:1等度洗脱，经薄层层析（tlc）检测，合并相同流份，流份备用；

（6）反相高效液相纯化：将步骤（5）制备的流份用反相高效液相色谱纯化，反相高效液相色谱条件为：

色谱柱：ymcc18，5μm，250×10mm；

流动相组成为乙腈∶水＝70∶30；

流速：2ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：220，254nm；

进样量：25μl；

保留时间：tr1=37.1min、tr2=33.2min、tr3=13.4min；

洗脱液除去乙腈和水经减压浓缩干燥得纯品prochaetoglobosinⅰ（9mg）、prochaetoglobosinⅱ（9.5mg）和prochaetoglobosinⅲ（7.5mg），纯度为99.5%。

采用本实施例的方法所提取到的prochaetoglobosinⅰ的结构鉴定如下：

【性状】淡黄色结晶

【鉴定】分子式：c32h38n2o2,分子量：482

仪器材料：¹h，¹³cnmr图谱由brukeram-400mhz核磁共振仪测定。tms为内标；lc-ms由aglient1260infinity-6120型液相质谱联用仪测定。

实验结果：利用esi-ms，¹hnmr和¹³cnmr试验，标准数据如下：esi-msm/z483[m+h]⁺;¹h-nmr(cdcl3,400mhz)δ:5.63(1h,brs,nh-2),3.30(1h,m,h-3),3.09(1h,m,h-4),2.48(1h,m,h-5),5.37(1h,brs,h-7),2.64(1h,d,j=8.9,h-8),3.00(1h,d,j=14.5hz,ha-10),2.64(1h,d,j=9.8,hz,hb-10),1.32(3h,d,j=5.5hz,h-11),1.74(3h,s,h-12),6.11(1h,m,h-13),5.12(1h,m,h-14),2.21(1h,m,ha-15),1.92(1h,m,hb-15),2.44(1h,m,h-16),4.94(1h,m,h-17),2.38-2.44(1h,m,h-19a),2.13-2.20(1h,m,h-19b),2.38-2.44(2h,m,h-20),6.79(1h,m,h-21),7.06(1h,d,j=16.7hz,h-22),0.92(3h,m,me-16),1.51(3h,s,me-18),8.15(1h,s,nh-1´),6.98(1h,s,h-2´),7.52(1h,m,h-4´),7.13(1h,m,h-5´),7.19(1h,d,j=5.0hz,h-6´),7.35(1h,m,h-7´);¹³c-nmr(cdcl3,100mhz)δ:174.2(c-1),53.8(c-3),50.2(c-4),36.1(c-5),139.7(c-6),126.8(c-7),47.2(c-8),66.1(c-9),35.0(c-10),14.2(c-11),20.0(c-12),129.5(c-13),132.7(c-14),41.2(c-15),32.4(c-16),132.9(c-17),130.6(c-18),39.0(c-19),28.9(c-20),146.5(c-21),128.2(c-22),197.5(c-23),21.5(16-me),16.5(18-me),122.3(c-2´),111.3(c-3´),127.0(c-3´a),118.5(c-4´),122.6(c-5´),119.7(c-6´),112.2(c-7´),136.5(c-1´a)。

采用本实施例的方法所提取到的prochaetoglobosinⅱ的结构鉴定如下：

【性状】淡黄色结晶

【鉴定】分子式：c32h36n2o3,分子量：496

仪器材料：¹h，¹³cnmr图谱由brukeram-400mhz核磁共振仪测定。tms为内标；lc-ms由aglient1260infinity-6120型液相质谱联用仪测定。

实验结果：利用esi-ms，¹hnmr和¹³cnmr试验，标准数据如下：esi-msm/z497[m+h]⁺;¹h-nmr(cdcl3,400mhz)δ:5.52(1h,brs,nh-2),3.29(1h,m,h-3),3.07(1h,m,h-4),2.46-2.55(1h,m,h-5),5.29(1h,brs,h-7),2.56(1h,m,h-8),3.13(1h,m,ha-10),2.58(1h,m,hb-10),1.41(3h,m,h-11),1.79(3h,s,h-12),5.90(1h,m,h-13),5.18(1h,m,h-14),2.25(1h,m,ha-15),1.98(1h,m,hb-15),2.46-2.55(1h,m,h-16),5.37(1h,m,h-17),3.70(1h,m,h-19a),3.05(1h,m,h-19b),6.43(1h,m,h-21),8.18(1h,d,j=16.5hz,h-22),0.94(3h,m,me-16),1.47(3h,s,me-18),8.09(1h,s,nh-1´),6.97(1h,m,h-2´),7.49(1h,m,h-4´),7.13(1h,m,h-5´),7.19(1h,d,j=6.0hz,h-6´),7.36(1h,m,h-7´);¹³c-nmr(cdcl3,100mhz)δ:172.7(c-1),53.9(c-3),49.8(c-4),34.8(c-5),140.8(c-6),126.0(c-7),46.7(c-8),66.0(c-9),34.6(c-10),14.9(c-11),20.3(c-12),130.8(c-13),132.0(c-14),41.9(c-15),32.3(c-16),138.0(c-17),128.4(c-18),53.1(c-19),201.5(c-20),136.8(c-21),134.4(c-22),198.6(c-23),21.1(16-me),15.4(18-me),122.5(c-2´),111.5(c-3´),126.9(c-3´a),118.5(c-4´),122.5(c-5´),119.9(c-6´),111.9(c-7´),136.5(c-1´a)。

采用本实施例的方法所提取到的prochaetoglobosinⅲ的结构鉴定如下：

【性状】淡黄色结晶

【鉴定】分子式：c32h36n2o4,分子量：512

仪器材料：¹h，¹³cnmr图谱由brukeram-400mhz核磁共振仪测定。tms为内标；lc-ms由aglient1260infinity-6120型液相质谱联用仪测定。

实验结果：利用esi-ms，¹hnmr和¹³cnmr试验，标准数据如下：esi-msm/z513[m+h]⁺;¹h-nmr(cd3od,400mhz)δ:6.12(1h,brs,nh-2),3.86(1h,m,h-3),2.89(1h,m,h-4),1.70(1h,m,h-5),2.76(1h,d,j=5.4hz,h-7),1.95(1h,m,h-8),2.87(1h,m,ha-10),2.80(1h,m,hb-10),1.41(3h,d,j=7.28hz,h-11),1.26(3h,s,h-12),5.90(1h,m,h-13),5.15(1h,m,h-14),2.25(1h,m,ha-15),2.06(1h,m,hb-15),2.41-2.48(1h,m,h-16),5.20(1h,m,h-17),3.51(1h,m,h-19a),2.88(1h,m,h-19b),6.03(1h,m,h-21),7.35(1h,d,j=16.4hz,h-22),0.94(3h,m,me-16),1.47(3h,s,me-18),6.94(1h,m,h-2´),7.47(1h,m,h-4´),7.00(1h,m,h-5´),7.00(1h,m,h-6´),7.25(1h,m,h-7´);¹³c-nmr(cd3od,100mhz)δ:175.6(c-1),53.8(c-3),47.9(c-4),37.7(c-5),59.4(c-6),63.8(c-7),50.2(c-8),63.8(c-9),33.8(c-10),13.2(c-11),19.8(c-12),129.6(c-13),134.6(c-14),43.0(c-15),33.5(c-16),139.3(c-17),129.7(c-18),54.3(c-19),202.7(c-20),138.1(c-21),135.6(c-22),199.3(c-23),21.5(16-me),16.1(18-me),120.1(c-2´),109.9(c-3´),129.0(c-3´a),120.1(c-4´),125.6(c-5´),119.5(c-6´),112.6(c-7´),136.5(c-1´a)。

由图1－9可知，经¹hnmr、¹³cnmr分析，比对文献（oikawah,murakamiy,ichiharaa.usefulapproachtofindtheplausiblebiosyntheticprecursorsofsecondarymetabolitesusingp-450inhibitors:postulatedintermediatesofchaetoglobosina[j].journalofthechemicalsocietyperkintransactions,1992,1(21):2949-2953.）确认提取到的化合物分别为prochaetoglobosinⅰ、prochaetoglobosinⅱ和prochaetoglobosinⅲ。

实施例2

该实施例的方法与实施例1不同之处在于：步骤（2）中培养温度为24℃；步骤（3）中次级培养辛二酰双羟肟酸的用量为8μm，培养温度为24℃，培养时间20d；步骤（4）中粗提物制备时菌丝体干燥温度为38℃。

实施例3

该实施例的方法与实施例1不同之处在于：步骤（1）中菌种活化培养时间为4d；步骤（2）摇床培养的转速为135r/min，培养时间为4d；步骤（3）中种子液加入的比例为3%，摇床培养转速135r/min，培养时间25d；步骤（4）中粗提物浸泡时间12h，超声处理30min。

实施例4

该实施例的方法与实施例1不同之处在于：步骤（1）中菌种活化培养时间为5d；步骤（2）摇床培养的转速为150r/min，温度为27℃，培养时间为5d；步骤（3）中次级培养辛二酰双羟肟酸的用量为12μm，种子液加入的比例为5%，摇床培养转速150r/min，培养温度为27℃，培养时间30d；步骤（4）中粗提物制备时菌丝体干燥温度为42℃，浸泡时间14h，超声处理40min。

上述实施例2-4的方法与实施例1的方法具有相同的提取效果。

上述实施例为本发明优选的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明所作的改变均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。