一种菜籽抗炎肽的分离纯化方法与流程

本发明涉及一种从菜籽饼粕中分离纯化的抗炎肽及其用途，属于食品生物技术领域。

背景技术：

炎症是机体对其组织和细胞受到有毒刺激和病症时，如感染，组织损伤，组织应激和功能障碍等，作出的直接反应。炎症与整体健康状况密不可分，研究表明癌症的发病机制与炎症有关。关于菜籽生物活性肽的研究已经很多，包括降血压肽，抗氧化肽，抗肿瘤肽等。因此，菜籽蛋白水解具有很大的潜力和广阔的市场前景。

由于目标活性肽在反应体系中含量甚微，菜籽功能肽多数是一些相对分子质量小于5000da的短肽，传统分离技术难以达到分离的目的，必须采用膜分离、色谱分离等现代分离技术。目前有关抗炎肽分离纯化的技术较少，而且所得到的活性成分纯度较低，抗炎活力较弱，不能很好的找到抗炎目标组分。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种菜籽抗炎肽的分离纯化方法，以酶解菜籽蛋白水解物为原料，分离菜籽蛋白水解物以得到具有较高抗炎活性的菜籽肽组分，提高菜籽蛋白的利用。

本发明采用以下技术方案：一种菜籽抗炎肽的分离纯化方法，包括以下步骤：

a.将菜籽脱脂处理，得到的菜籽饼粕，并粉碎过筛，得到菜籽粉；将得到的菜籽粉用碱提酸沉的方法制得菜籽蛋白，并冷冻干燥；将得到菜籽蛋白用碱性蛋白酶水解和风味蛋白酶进行分步酶解，得到菜籽蛋白水解物；

b.将步骤a得到的菜籽蛋白水解物通过的超滤膜，收集分子量小于3k的组分；

c.将步骤b收集的分子量小于3k的组分通过葡聚糖凝胶柱分离，得到若干组分，并收集具有紫外吸收峰的组分；

d.将步骤c得到的活性较强的组分通过半制备液相分离，得到若干组分，收集主要的洗脱峰，冷冻干燥后检测各分离组分的抗炎活性，活性最强的即所述菜籽抗炎肽。

具体的，包括以下步骤：

（1）菜籽蛋白酶解产物的制备：将菜籽脱脂处理，得到的菜籽饼粕，并粉碎过筛，得到菜籽粉；取菜籽粉溶于蒸馏水中，调为ph=11，搅拌1h，离心收集上清液，调上清液的ph为4.5，搅拌1h，再次离心，弃上清液，得菜籽蛋白。取菜籽蛋白溶于蒸馏水中，调ph=9，加入碱性蛋白酶，反应3h后，灭酶，将溶液ph调至7，加入风味蛋白酶，反应2h，灭酶冷却后，过0.22μm微滤膜，得到菜籽蛋白水解物。

（2）菜籽蛋白的酶解产物的超滤：利用超滤膜分离技术将其进行纯化，将菜籽蛋白水解物配制成质量浓度为0.5-1%的溶液后，反复几次通过的超滤膜，使其超滤的压力控制在0~1mpa范围内，收集小于3k的组分，并冷冻干燥。

（3）利用葡聚糖凝胶柱分离纯化步骤（2）中的分子量3k的菜籽肽。葡聚糖凝胶过滤层析的洗脱条件为：以双蒸水为流动相进行洗脱样品，上样浓度1-10mg/ml，上样体积5-10ml，上样流速9-18ml/h，洗脱流速9-48ml/h，洗脱温度20-32℃，紫外检测波长为280nm，洗脱液自动部分收集,将同一分离峰合并，冷冻干燥后检测各分离组分的抗炎活性；

（4）用半制备液相进一步分离步骤（3）中活性较强的菜籽多肽组分，液相条件为：洗脱梯度为0-60min，乙腈5-100%；流速为1-2.46ml/min，紫外检测波长215nm，柱温25-35℃，收集主要的洗脱峰，冷冻干燥后检测各分离组分的抗炎活性，活性最强的即所得菜籽抗炎肽。

本发明还公开了利用上述经过超滤，葡聚糖凝胶柱，半制备液相分离纯化得到的抗炎菜籽肽。所述抗炎菜籽肽的纯度为90~98%菜籽抗炎肽，在最大纯度的条件下，菜籽抗炎肽的ic50=377.085μg/ml。

本发明的有益效果：

（1）提高了菜籽饼粕的利用价值，可以从酶解产物中分离出一些具有生理活性的生物活性肽；

（2）通过控制葡聚糖凝胶色谱柱的上样浓度，上样体积，上样流速，洗脱流速，洗脱温度来判断合适的分离条件；以及控制半制备液相中液相条件（上样浓度，洗脱梯度，流速，柱温）来找到合适的制备条件。

（3）菜籽抗炎肽的活力较强，可以作为一种功能性食品和膳食补充剂。

附图说明

图1为本发明实施例2步骤（3）处理后的分离组分的no释放量；

图2为本发明实施例2步骤（4）处理后的分离组分的no释放量；

图3为本发明实施例2制备菜籽抗炎肽的液相色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：

（1）菜籽蛋白酶解产物的制备：将菜籽脱脂处理，得到的菜籽饼粕，并粉碎过筛，得到菜籽粉；取菜籽粉溶于蒸馏水中，调为ph=11，搅拌1h，离心收集上清液，调上清液的ph为4.5，搅拌1h，再次离心，弃上清液，得菜籽蛋白。取菜籽蛋白溶于蒸馏水中，调ph=9，加入碱性蛋白酶，反应3h后，灭酶，将溶液ph调至7，加入风味蛋白酶，反应2h，灭酶冷却后，过0.22μm微滤膜，得到菜籽蛋白水解物。

(2)菜籽蛋白的酶解产物的超滤：利用超滤膜分离技术将其进行纯化，将菜籽蛋白水解物配制成质量浓度为0.5%的溶液后，反复几次通过的超滤膜，使其超滤的压力控制在0-0.2mpa范围内，收集小于3k的组分，并冷冻干燥。

(3)利用葡聚糖凝胶柱分离纯化步骤（2）中的分子量3k的菜籽肽，葡聚糖凝胶过滤层析的洗脱条件为：以双蒸水为流动相进行洗脱样品，上样浓度1mg/ml，上样体积5ml，上样流速9ml/h，洗脱流速9ml/h，洗脱温度25℃，紫外检测波长为280nm，洗脱液自动部分收集,将同一分离峰合并，冷冻干燥后检测各分离组分的抗炎活性。

(4)用半制备液相进一步分离步骤（3）中活性较强的菜籽多肽组分，液相条件为：上样浓度为0.5mg/ml；洗脱梯度为0-60min，乙腈5-40%；流速为1.0ml/min，紫外检测波长215nm，柱温25℃，收集主要的洗脱峰，冷冻干燥后检测各分离组分的抗炎活性，活性最强的即所得菜籽抗炎肽；菜籽抗炎肽的纯度为91%，菜籽抗炎肽的ic50=527.661μg/ml。

实施例2：

（1）菜籽蛋白酶解产物的制备：将菜籽脱脂处理，得到的菜籽饼粕，并粉碎过筛，得到菜籽粉；取菜籽粉溶于蒸馏水中，调为ph=11，搅拌1h，离心收集上清液，调上清液的ph为4.5，搅拌1h，再次离心，弃上清液，得菜籽蛋白。取菜籽蛋白溶于蒸馏水中，调ph=9，加入碱性蛋白酶，反应3h后，灭酶，将溶液ph调至7，加入风味蛋白酶，反应2h，灭酶冷却后，过0.22μm微滤膜，得到菜籽蛋白水解物。

(2)菜籽蛋白的酶解产物的超滤：利用超滤膜分离技术将其进行纯化，将菜籽蛋白水解物配制成质量浓度为0.75%的溶液后，反复几次通过的超滤膜，使其超滤的压力控制在0-0.5mpa范围内，收集小于3k的组分，并冷冻干燥。

(3)利用葡聚糖凝胶柱分离纯化步骤（2）中的分子量3k的菜籽肽，葡聚糖凝胶过滤层析的洗脱条件为：以双蒸水为流动相进行洗脱样品，上样浓度7.5mg/ml，上样体积7.5ml，上样流速16ml/h，洗脱流速18ml/h，洗脱温度20℃，紫外检测波长为280nm，洗脱液自动部分收集,将同一分离峰合并，冷冻干燥后检测各分离组分的抗炎活性。

(4)用半制备液相进一步分离步骤（3）中活性较强的菜籽多肽组分，液相条件为：上样浓度为0-1mg/ml；洗脱梯度为0-20min，乙腈5-80%；流速为2.0ml/min，紫外检测波长215nm，柱温30℃，收集主要的洗脱峰，冷冻干燥后检测各分离组分的抗炎活性，活性最强的即所得菜籽抗炎肽；菜籽抗炎肽的纯度为98%，菜籽抗炎肽的ic50=377.085μg/ml。

实施例3：

（1）菜籽蛋白酶解产物的制备：将菜籽脱脂处理，得到的菜籽饼粕，并粉碎过筛，得到菜籽粉；取菜籽粉溶于蒸馏水中，调为ph=11，搅拌1h，离心收集上清液，调上清液的ph为4.5，搅拌1h，再次离心，弃上清液，得菜籽蛋白。取菜籽蛋白溶于蒸馏水中，调ph=9，加入碱性蛋白酶，反应3h后，灭酶，将溶液ph调至7，加入风味蛋白酶，反应2h，灭酶冷却后，过0.22μm微滤膜，得到菜籽蛋白水解物。

(2)菜籽蛋白的酶解产物的超滤：利用超滤膜分离技术将其进行纯化，将菜籽蛋白水解物配制成质量浓度为1%的溶液后，反复几次通过的超滤膜，使其超滤的压力控制在0~1mpa范围内，收集小于3k的组分，并冷冻干燥。

(3)利用葡聚糖凝胶柱分离纯化步骤（2）中的分子量3k的菜籽肽，葡聚糖凝胶过滤层析的洗脱条件为：以双蒸水为流动相进行洗脱样品，上样浓度10mg/ml，上样体积10ml，上样流速18ml/h，洗脱流速48ml/h，洗脱温度32℃，紫外检测波长为280nm，洗脱液自动部分收集,将同一分离峰合并，冷冻干燥后检测各分离组分的抗炎活性。

(4)用半制备液相（rp-hplc）进一步分离步骤（3）中活性较强的菜籽多肽组分，液相条件为：上样浓度为1mg/ml；洗脱梯度为0-40min，乙腈10-100%；流速为2.46ml/min，紫外检测波长215nm，柱温35℃，收集主要的洗脱峰，冷冻干燥后检测各分离组分的抗炎活性，活性最强的即所得菜籽抗炎肽；菜籽抗炎肽的纯度为95%，菜籽抗炎肽的ic50=453.375μg/ml。

本发明实施例抗炎菜籽肽的活性分析：

建立lps诱导小鼠巨噬细胞raw264.7炎症模型，以抑制no的释放量来评价组分的抗炎活力：将小鼠巨噬细胞raw264.7接种于96孔板中（1×105个/孔），在培养箱（37℃，5%co2）中孵育24h后，加入待测样品，1h后加入浓度为1μg/ml的lps（脂多糖），在培养箱（37℃，5%co2）中孵育24h，24h后收集上清液。使用一氧化氮试剂盒（碧云天公司）测定上清中一氧化氮的浓度。

如图1所示，为本发明实施例1，经过步骤（3），超滤膜分离菜籽蛋白水解物经过葡聚糖凝胶柱分离后，得到两个组分f1和f2，当两个组分的浓度均为400μg/ml时，组分f2处理过的细胞中no的释放量为14.064μm，抑制率为46.15%，优于组分f1的抑制率19.23%。

如图2所示，组分f2用半制备液相进一步分离，得到四个组分，当四个组分的浓度均为400μg/ml时，组分3处理过的细胞中no的释放量为11.71μm，抑制率为53.01%，优于其他组分，组分1，2，4的抑制率分别为29.71%，19.67%，14.37%。如图3所示，组分3基本是一个单一组分，纯度为98%，即为本发明菜籽抗炎肽。