双哌啶取代的异黄酮化合物及其用途的制作方法

本发明涉及具有组胺h3受体拮抗效应、双重胆碱酯酶抑制作用、神经细胞保护作用、抗炎作用的双哌啶取代的异黄酮化合物，以及该化合物在治疗学习记忆障碍和老年痴呆、血管性痴呆中的应用。属医药技术领域。

背景技术：

阿尔茨海默病(ad)是以进行性记忆丧失和认知障碍为特征的最常见的痴呆形式。虽然ad的确切病因尚不完全清楚，但是有多种因素在疾病的病理生理学中起重要作用，主要包括神经突触的丢失，β-淀粉样蛋白(aβ)沉积，tau蛋白过度磷酸化，金属离子动态平衡，氧化损伤和神经递质系统功能障碍等。近三十年来，科学家基于多种ad病因假说开展的ad治疗药物研究取得了一些进展，但曾被寄予厚望的几个ad治疗药物在临床试验均遭遇不同程度的挫折。抗ad药物研发的失败案例使人们认识到需要建立能调节ad相关多种因素的新靶点药物研发体系。

临床常用的胆碱能抑制剂(chei)多为选择性乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,ache)抑制剂，如多奈哌齐，卡巴拉汀等，可改善患者的认知功能、提高患者及看护人的生活质量，但这些药物仅能改善临床症状，不能解决疾病的根本原因，对重症ad的治疗也不理想。

丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase,buche)在中枢和外周均有分布，由于buche的生理功能一直不明确，对乙酰胆碱(acetylcholine,ach)的亲和力低于ache。长期以来未被作为ad治疗的靶点。但近年的研究发现buche不但可替代ache水解ach，在ad进程中亦有作用，但是化合物抑制buche过强会带来更多的副作用。因此，适当比例地同时抑制ache和buche是更加理想的ad治疗方案。

组胺h3受体(h3r)在脑中广泛表达，主要表达于大脑皮质，海马，杏仁核，纹状体等这些与记忆认知能力密切相关的区域。用选择性拮抗剂/反向激动剂阻断这些受体，可以增加神经递质如乙酰胆碱，多巴胺或5-羟色胺的释放，从而调节学习记忆、觉醒与睡眠等多种神经性行为。临床研究结果表明，h3r拮抗剂/反向激动剂：abt-288，gsk-239512或mk-3134对ad患者具有治疗效果。最近公布了这些研究的早期结果，gsk-239512可以改善轻中度ad患者的情景记忆障碍。至此，以h3r为靶点，研发治疗阿尔茨海默症、神经分裂症、抑郁、癫痫、睡眠觉醒障碍的新药成为了研究热点。

组胺h3受体拮抗剂和chei均可改善和增加皮质中的胆碱能神经传递。chei广泛分布于全身，组胺h3r拮抗剂主要在脑中提高乙酰胆碱水平，其作用模式主要在中枢神经系统上，因此，兼具组胺h3受体拮抗作用和che作用的单个分子。可以提供更好的治疗效果，并且减少外周的副作用。mk-3134的临床试验(单次剂量法)在单一疗法及多奈哌齐的辅助疗法中均表现出良好的认知改善。

氧化应激损伤在ad疾病进程中也不容忽视，考察化合物的抗氧化性能也是解释化合物抗ad的重要指标，许多的h3r拮抗剂在治疗ad过程中表现出的抗氧化性能有助于病情改善；体外实验较常使用的工具细胞是sy5y，appsw-sy5y，bv2等神经或胶质细胞，作为乙、丁酰胆碱酯酶抑制剂选用这些细胞在细胞水平上验证化合物对受体或酶活性的抑制效应，考察是否能提高脑内乙酰胆碱的含量促进突触间信号传递。

另外，神经炎症在ad的发生发展进程中扮演着重要的角色，考察化合物抗神经炎症的常用指标包括il-6,tnf-α，神经炎症的产生主要是小胶质细胞的激活，故使用bv2作为工具细胞考察活性化合物对lps刺激活化后的bv2小胶质细胞分泌炎症因子il-6,tnf-α的影响。

抗ad药物体内的药效学评价，选用东莨菪碱诱导的痴呆模型。东莨菪碱致小鼠认知功能获得性障碍模型是一种较为成熟的研究抗痴呆药物的动物模型。

本发明的作者前期研究中发现了一个新型异黄酮化合物，具组胺h3受体拮抗作用和che抑制活性。

技术实现要素：

我们发现一类结构独特的化合物，他们具有组胺h3受体拮抗活性、乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶双重抑制剂活性。此外，本发明化合物具有低毒性，通式制备方法简便，3-4步反应即可合成。

本发明涉及式i的化合物，及其可药用盐，它们对于认知疾病和/或老年痴呆、血管性痴呆有潜在的用途。

其中，化合物i可与如下有机酸或无机酸成盐，有机酸包括马来酸、咖啡酸、阿魏酸、没食子酸，甲磺酸，无机酸选自盐酸、硫酸。

本发明所提出的化合物i可通过以下方法制备得到：

合成路线：

其具体制备方法描述如下：

以刺芒柄花素为其起始原料，与1,4-二溴丁烷在无水碳酸钾及丙酮中反应得到中间体2，2与哌啶在无水碳酸钾及丙酮中反应得到中间体3，在氢溴酸作用下脱甲基，得到中间体4，4与1,2-二溴乙烷在无水碳酸钾及丙酮中反应得到中间体5，再与哌啶作用得到化合物(i)。

利用上述方法所得的化合物(i)分子中含有氨基，该氨基呈碱性，可与任何合适的酸通过药学上常规的成盐方法制得其药物学上可接受的盐。

发明人发现本发明的化合物具有较高的h3受体拮抗活性和乙、丁酰胆碱酯酶抑制活性，因此，本发明的化合物另一方面涉及治疗、改善与h3受体拮抗活性和乙、丁酰胆碱酯酶抑制活性相关的疾病的方法。所述方法包括对需要治疗的患者给予治疗有效量的通式(i)的化合物或其药物组合物。

进一步的实验结果表明：本发明的化合物具有抗氧化性能，有助于防治痴呆进程中的氧化应激损伤。由于ad或其他退行性疾病进程中有较严重神经元丢失或损伤情况，本发明在细胞水平验证了化合物i对神经细胞的影响，发现化合物i在效应浓度下不会造成神经损伤，而且在该细胞上表现出较好的乙酰胆碱酯酶活性抑制效应。通过cu²⁺诱导appsw-sy5y细胞产生aβ代谢紊乱，模拟神经细胞在遗传因素与环境因素共同作用下的的病理状态，发现化合物i对cu²⁺损伤appsw-sy5y细胞具有明显的保护作用，更加确定该化合物的抗ad活性。另外，利用细胞水平模拟的神经炎症模型，通过lps刺激bv2小胶质细胞活化发现化合物i能抑制活化后的bv2小胶质细胞分泌il-6、tnf-α炎症因子，减轻神经退行性疾病进程中的炎症。

体内抗痴呆作用评价，选用东莨菪碱诱导的痴呆模型。m胆碱受体阻断剂东莨菪碱(scopolamine，scop)，使脑内ach水平显著下降，可以抑制中枢胆碱能通路功能，模拟ad的动物模型，稳定诱导动物的学习记忆障碍，根据训练期和测试期的潜伏时间和错误次数来考察化合物i对该病理模型的改善作用，结果发现，化合物i相对模型组能显著提高测试期的潜伏时间及减少训练期和测试期的错误次数，这表明化合物i作为多靶点效应分子发挥了相应的抗氧化、抗炎症、提高脑内乙酰胆碱含量促进突触信号传递，改善学习记忆的效应。

附图说明

图1.1、化合物i抑制h3r的量效曲线

图1.2、化合物i抑制ache的量效曲线

图1.3、化合物i抑制buche的量效曲线

图2、化合物i体外抗氧化活性的曲线下面积

图3、化合物i对sy5y细胞活力的影响

图4、化合物i对sy5y细胞ache活性的影响

图5、化合物i对appsw-sy5y细胞活力的影响

图6、化合物i对appsw-sy5y细胞ache活性的影响

图7、化合物i对cu²⁺诱导的appsw-sy5y细胞损伤模型细胞活力的影响

图8、化合物i对活化bv2小胶质细胞il-6分泌的影响

图9、化合物i对活化bv2小胶质细胞tnf-α分泌的影响

图10、化合物i在跳台实验中对学习记忆的影响(###与正常组比较,p<0.005；##与正常组比较，p<0.01；**与模型组比较，p<0.01；*与模型组比较，p<0.05；^&&与正常组比较，p<0.01；^@@与模型组比较，p<0.01。)

图11、化合物i的hrms图谱

图12、化合物i的¹hnmr图谱

图13、化合物i的¹³cnmr图谱

具体实施方式

1、化合物i的制备

3-(4-甲氧基苯基)-7-(4-溴基丁氧基)-4h-色原-4-酮(2)的合成

在1000ml单口瓶中，加入刺芒柄花素(5g，18.6mmol)、研细的无水碳酸钾粉末(30g，217mmol)、500ml丙酮，再加入1,4-二溴丁烷(24ml，198mmol)，加热回流反应10h，将反应混合物减压浓缩，残余物加水，搅拌，抽滤，滤饼用水洗涤，干燥，得白色固体6.62g，收率为88.6％。mp：152.8-154.0℃。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:8.21(d,j＝8.8hz,1h),7.91(s,1h),7.50(d,j＝8.8hz,2h),6.99-6.96(m,3h),6.84(d,j＝2.4hz,1h),4.10(t,j＝6.0hz,2h),3.84(s,3h),3.51(t,j＝6.0hz,2h),2.14-1.98(m,4h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ:175.8,163.2,159.6,157.9,152.0,130.1,127.8,124.9,124.2,118.5,114.7,114.0,100.6,67.6,55.3,33.2,29.3,27.6.esi-ms(m/z):403.31[m+h]+。

3-(4-甲氧基苯基)-7-(4-哌啶基丁氧基)-4h-色原-4-酮(3)的合成

在250ml单口瓶中，加入3-(4-甲氧基苯基)-7-(4-溴基丁氧基)-4h-色原-4-酮(2)(20.1g，5mmol)、碳酸钾粉末(13.8g，100mmol)、150ml乙腈、哌啶(1.5ml，16.4mmol)，100℃搅拌反应3h，将反应液倒入600ml水中，搅拌，抽滤，滤饼用水洗涤，干燥，得白色固体1.91g，收率为93.6％。mp：152.8-154.0℃。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:8.19(d,j＝8.8hz,1h),7.91(s,1h),7.51(d,j＝8.8hz,2h),6.98-6.96(m,3h),6.83(d,j＝2.0hz,1h),4.08(t,j＝6.4hz,2h),3.84(s,3h),2.44(brs,6h),1.90-1.83(m,2h),1.78-1.73(m,2h),1.65-1.63(m,4h),1.46(brs,2h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ:175.9,163.4,159.6,158.0,152.0,130.1,127.8,124.9,124.3,118.3,114.8,114.0,100.6,68.4,58.8,55.4,54.5,27.1,25.7,24.2,23.1.hrms：c25h30no4[m+h]+:m/zcalcd:408.2175；found:408.21738.

3-(4-羟基苯基)-7-(4-哌啶基丁氧基)-4h-色原-4-酮氢溴酸盐(4)的合成

在100ml单口瓶中，加入化合物3-(4-甲氧基苯基)-7-(4-哌啶基丁氧基)-4h-色原-4-酮(1.42g，3.49mmol)和30ml40％氢溴酸，120℃加热回流反应30h，冷却至0℃，过滤，用甲醇洗，干燥，得到灰色固体1.34g。收率为81.3％。mp：225.3-228.5℃。1hnmr(400mhz,d2o/cd3od)δ:8.15(s,1h),8.02(d,j＝8.8hz,1h),7.38(d,j＝8.0hz,2h),7.06-6.94(m,4h),4.10(brs,2h),3.54(brs,2h),3.16(brs,2h),2.94(t,j＝10.8hz,2h),2.00-1.72(m,10h)；13cnmr(100mhz,d2o/cd3od)δ:178.6,164.7,159.3,157.4,155.3,131.4,127.9,125.4,124.3,118.4,116.6,116.3,101.9,69.0,57.6,54.2,26.7,23.9,22.3,21.6.hrms：c24h28no4[m-br]+:m/zcalcd:394.2018；found:394.2019.

3-(4-(2-溴乙氧基)苯基)-7-(4-哌啶基丁氧基)-4h-色原-4-酮(5)合成

在100ml单口瓶中，加入3-(4-羟基苯基)-7-(4-哌啶基丁氧基)-4h-色原-4-酮氢溴酸盐(535g，1.13mmol)、研细的无水碳酸钾粉末(6.18g，44.8mmol)、50ml丙酮，再加入1,2-二溴乙烷(975μl，11.3mmol)，加热回流反应5d，将反应混合物减压浓缩，残余物加水，搅拌，抽滤，滤饼用水洗涤，干燥，得淡黄色固体500mg，收率：88.7％。mp：98.0-100.9℃。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:8.19(d,j＝9.2hz,1h),7.91(s,1h),7.50(d,j＝8.4hz,2h),6.99-6.96(m,3h),6.84(s,1h),4.33(t,j＝6.0hz,2h),4.08(t,j＝6.4hz,2h),3.65(t,j＝6.0hz,2h),2.42-2.39(m,6h),1.89-1.83(m,2h),1.76-1.69(m,2h),1.65-1.59(m,4h),1.48-1.43(m,2h)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:174.6,163.1,157.6,157.4,153.5,130.1,126.9,125.6,123.2,117.5,115.0,114.4,101.0,68.4,67.8,57.8,53.9,31.4,26.3,25.4,24.0,22.5.esi-ms(m/z):500.37[m+h]+。

3-(4-(2-哌啶基乙氧基)苯基)-7-(4-哌啶基丁氧基)-4h-色原-4-酮(化合物i)的合成在50ml单口瓶中，加入3-(4-(2-溴乙氧基)苯基)-7-(4-哌啶基丁氧基)-4h-色原-4-酮(250mg，0.50mmol)、碳酸钾粉末(3.45g，25.0mmol)、25ml乙腈、哌啶(500μl，5.5mmol)，100℃搅拌反应2h，将反应液倒入200ml水中，搅拌，抽滤，滤饼用水洗涤，干燥，得淡黄色固体235mg，收率为95.3％。mp：127.6-130.6℃。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:8.19(d,j＝8.4hz,1h),7.91(s,1h),7.48(d,j＝8.4hz,2h),6.97(d,j＝8.4hz,3h),6.83(d,j＝13.2hz,1h),4.14(t,j＝8.4hz,2h),4.08(t,j＝8.4hz,2h),2.79(t,j＝8.4hz,2h),2.52(brs,4h),2.39-2.35(m,6h),1.89-1.82(m,2h),1.73-1.66(m,2h),1.64-1.56(m,8h),1.48-1.41(m,4h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ:176.0,163.6,159.0,158.1,152.1,130.2,127.9,125.0,124.4,118.4,115.0,114.8,100.7,68.7,66.2,59.1,58.1,55.2,54.8,27.3,26.2,26.1,24.7,24.4,23.6.hrms：c31h41n2o4[m+h]+:m/zcalcd:505.3066；found:505.3065.hrms、1hnmr和13cnmr图谱见附图-11、附图-12和附图-13。

2、化合物i在体外对组胺h3r的抑制活性

方法：本实验选用经转染h3r-转录因子(gal4-vp16)融合蛋白、beta-arrestin2、beta-内酰胺水解酶的h3-bla-u2os细胞。筛选原理：激动剂型配体与h3组胺受体结合后，募集beta-arrestin2，随之tevprotease水解h3组胺受体和gal4-vp16转录因子融合蛋白，使gal4-vp16转录因子脱落入核，使beta-lactamase(bla)reportergene表达。随后加入底物liveblazertm-fretb/gsubstrate(ccf2-amorccf4-am)孵育。此底物包含头孢菌素核与7-羟基香豆素，这两部分发生fret现象，此时它的有一个520nm的绿光信号，beta-lactamase水解β内酰胺环后，绿光信号消失，变为一个450nm下的蓝光信号。根据蓝光和绿光的信号，判断筛选样品与h3的结合，噻唑酰胺为阳性对照，计算ic50。重复三次，计算均值及sd值。

结果：化合物i对h3r有抑制作用，对h3r的ic50在0.2667μmol/l，见表1；化合物i抑制h3r的量效曲线见图1.1。

表1、化合物i抑制h3r的ic50(mean±sd)

3、化合物i在体外水平对ache、buche活性的抑制作用研究

方法：利用dtnb法建立ache抑制剂筛选模型和buche抑制剂筛选模型，分别用多奈哌齐和卡巴拉汀作为二者的阳性对照药。对化合物i在0.032-20μmol/l时对ache、buche的抑制活性进行评价，并计算ic50。重复三次，计算均值及sd值。

结果：化合物i对ache、buche均有抑制作用，对ache的ic50为0.2917μmol/l，对buche的抑制活性弱于ache，见表2；化合物i抑制ache、buche的量效曲线分别见图1.2和图1.3。

表2、化合物i抑制ache和buche活性的ic50(mean±sd)

4、化合物i体外抗氧化性能评价

方法：以偶氮类化合物aaph作为过氧自由基来源,sodiumfluorescein(fl)为荧光指示剂，抗氧化剂维生素e水溶性类似物trolox为定量标准,使用荧光微孔板分析仪进行分析。采用抗氧化剂作用下的荧光衰退曲线下面积(areaunderthecurve,auc)与荧光自然衰退曲线下面积的差,作为衡量抗氧化剂的抗氧化能力指标,将结果以抗氧化剂trolox作为标准1进行量化，即trolox当量，比较化合物的抗氧化能力。

结果：化合物i的抗氧化当量为0.11，具有一定的抗氧化活性，见表3；化合物i的抗氧化活性曲线下面积见图2。

表3、化合物i的抗氧化活性

5、化合物i对神经细胞ache活性的抑制作用及ad细胞损伤模型和抗炎作用研究

(1)对sy5y神经细胞ache活性的抑制作用研究

方法1：sy5y细胞以含10％胎牛血清的dmem/f12培养基培养，待细胞处于对数生长期时，按5*10⁴个/ml，100ul/孔的密度接种于96孔培养板中。24h后换以无血清dmem/f12培养基培养，12h后换以不同浓度化合物i(0.1-10μmol/l)的无血清dmem/f12培养基，多奈哌齐及卡巴拉汀(终浓度为10μmol/l)处理相同，24h后mts法测定细胞活力，dtnb法检测细胞上清中ache活性。

结果：与正常组相比，化合物i在给药浓度范围内对细胞活力无显著影响，而阳性对照多奈哌齐给药组细胞活力显著降低(p＜0.05)，见表4、图3。化合物i可剂量依赖性的抑制sy5y细胞的ache活性，见表5、图4。

表4、化合物i对sy5y细胞活力的影响(mean±sd)

^#与正常组比较p<0.05

表5、化合物i对sy5y细胞ache活性的影响(mean±sd)

^##与正常组比较p<0.01,^###与正常组比较p<0.005

(2)对野生型appsw转基因sy5y(appsw-sy5y)神经细胞ache活性的抑制作用研究

方法2：野生型appsw转基因sy5y(appsw-sy5y)细胞以含10％胎牛血清，400ug/mlg418的dmem/f12培养基培养，待细胞处于对数生长期时，按5*10⁴个/ml，100ul/孔的密度接种于96孔培养板中。24h后换以无血清dmem/f12培养基培养，12h后换以不同浓度化合物i(0.1-10μmol/l)的无血清dmem/f12培养基，多奈哌齐及卡巴拉汀(终浓度为10μmol/l)处理相同，24h后mts法测定细胞活力，dtnb法检测细胞上清中ache活性。

结果：与正常组相比，化合物i在给药浓度范围内对野生型appsw转基因sy5y(appsw-sy5y)细胞的活力无显著影响，见表6、图5。化合物i可剂量依赖性的抑制appswsy5y细胞的ache活性,见表7、图6。

表6、化合物i对app-swsy5y细胞活力的影响(mean±sd)

^#与正常组比较p<0.05

表7、化合物i对app-swsy5y细胞ache活性的影响(mean±sd)

^##与正常组比较p<0.01,^###与正常组比较p<0.005

(3)化合物i在ad细胞模型上的作用研究

方法：appsw-sy5y细胞以含10％胎牛血清、400μg/mlg418的dmem/f12培养基培养，待细胞处于对数生长期时，按5*10⁴个/ml，100μl/孔的密度接种于96孔培养板中。24h后换以无血清dmem/f12培养基继续培养12h，加入终浓度为10μmol/l的化合物i和10μmol/l的多奈哌齐预孵育2h后，加入终浓度为250μmol/l的cu²⁺处理细胞，24h后以mts法测定细胞活力，查看cu²⁺刺激appsw-sy5y模拟的aβ片段聚集模型中化合物i对该刺激的改善效应。

结果：与正常组相比，cu²⁺处理24h后，模型组细胞存活率显著降低(p<0.005)。与模型组相比，化合物i组细胞存活率有显著提高，10μmol/l化合物i给药组的细胞存活率高于阳性对照多奈哌齐组，见表8、图7。

表8、化合物i对cu²⁺诱导的appsw-sy5y细胞损伤模型细胞活力的影响(mean±sd)

^###与正常组比较p<0.005；^**与模型组比较p<0.01

(4)化合物i对神经炎症的作用研究

方法：终浓度为10μmol/l的化合物i，与小胶质细胞bv2共同孵育2h后，除空白对照组外，模型组和给药组均加入终浓度为1μg/mllps，继续孵育24h后收集细胞上清，elisa法测定细胞上清液内il-6、tnf-α含量。

结果：与正常组相比，lps刺激bv2小胶质细胞24h后，模型组细胞上清液中il-6、tnf-α含量显著升高(p<0.005)。化合物i可降低细胞上清中il-6、tnf-α的含量，给药量为10μmol/l时，细胞上清中il-6、tnf-α含量与模型组相比显著降低(p<0.01),见表9。化合物i对活化bv2小胶质细胞il-6分泌的影响见图8；化合物i对活化bv2小胶质细胞tnf-α分泌的影响见图9。

表9、化合物i对活化bv2小胶质细胞胞il-6、tnf-α分泌的影响(mean±sd)

^###与正常组比较p<0.005,^***与模型组比较p<0.005

6、化合物i在ad动物模型上的研究

方法：以东莨菪碱建造小鼠学习、记忆障碍模型，以多奈哌齐为阳性对照药物，观察化合物i的作用。小鼠学习记忆功能以跳台行为学指标评价，比较正常对照组、模型组和药物组之间的差异。化合物药效学评价的用药剂量是根据药物的常规用量计算方法结合急性毒性试验结果确定的。化合物i药效学评价时选用了30mg/kg剂量(高剂量)和10mg/kg剂量(低剂量)，阳性药多奈哌齐组为5mg/kg。实验用icr小鼠，用于痴呆动物模型药效学评价，将小鼠随机分为5组，正常组、模型组、多奈哌齐组(5mg/kg)、化合物i高剂量组、化合物i低剂量组。第一天适应，第二天除对照组外其他组给予东莨菪碱刺激并接受通电训练感知，第三天断电后再次测试潜伏期和小鼠在3分钟内的下台次数即错误次数。

结果：第二天的所有组别进行训练，感知触电，记录潜伏期各组之间无显著差异，跳下平台的错误次数中，模型组与正常组有显著差异(p<0.01)，化合物i高剂量组相对模型组错误次数减少，有显著性差异(p<0.01)。在第三天的测试期发现东莨菪碱模型组小鼠在跳台上的时间(潜伏期)很短，潜伏期与空白组比较，差异显著(p<0.005)。化合物i高剂量组可明显延长潜伏期，与模型组比较，差异显著(p<0.05)；小鼠下台的错误次数，模型组与空白组比较有明显差异(p<0.005)，化合物i高剂量组与模型组比较可减少错误次数(p<0.01)，见表10，化合物i在跳台实验训练期和测试期对潜伏时间和错误次数的影响见图10。

表10、化合物i在跳台实验中对学习记忆的影响(mean±sd)

^###与正常对照组比较,p<0.005；^##与正常对照组比较,p<0.01；***与模型组比较,p<0.005；**与模型组比较,p<0.01；*与模型组比较,p<0.05。