小梅山猪及生肉制品的SNP标记组合和鉴定方法与流程

本发明涉及的是一种食品安全监测领域的技术，具体是一种小梅山猪及生肉制品的snp标记组合和鉴定方法。

背景技术：

梅山猪是我国太湖流域优良地方品种(品系)之一，以繁殖力高和肉质鲜美而闻名于世。随着测序技术的发展，分子标记也由一代的限制性片段长度多态性(rflp)，第二代的数目可变串联重复多态性(ssr)，发展到了单核苷酸多态性(snp)。第三代分子标记snp相对于前两代分子标记具有变异丰富、对dna样本要求低、稳定性高、测定准确、检测方法简便且通量高等优点。目前，第三代分子标记snp已广泛应用于亲子鉴定、动植物品种(品系)鉴定、遗传育种等领域。

技术实现要素：

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种鉴定小梅山猪及生肉制品的snp标记组合和鉴定方法，利用第三代分子标记鉴别及sanger测序技术鉴别小梅山猪及生肉制品，解决现有技术中尚未有小梅山猪及其肉制品相关的鉴定方法的问题，提供了一种结果准确、操作简单、价格低廉的鉴定小梅山猪及其肉制品的方法和相关专用引物。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种小梅山猪及生肉制品的snp标记组合，包括：snp6、snp12、snp16、snp71、snp79位点，具体为：12号染色体12412657位位点，即snps12、7号染色体91761900位位点，即snps79、7号染色体16740526位位点，即snps71、6号染色体25668001位位点，即snps6、16号染色体70624962位位点，即snps16。

本发明涉及一种基于上述snp标记组合的小梅山猪及生肉制品鉴定方法，通过提取生猪肉或肉制品的基因组dna，经pcr扩增后进行琼脂糖凝胶电泳和sanger测序，根据测序结果特点位点的snp基因型鉴定小梅山猪及其肉制品。

所述的sanger测序，其鉴定位点为：snp6、snp12、snp16、snp71、snp79位点处出现特异突变。

所述的snp12所在基因上下游500bp序列信息，如seqidno.11所示。

所述的snp6所在基因上下游500bp序列信息，如seqidno.12所示。

所述的snp16所在基因上下游500bp序列信息，如seqidno.13所示。

所述的snp71所在基因上下游500bp序列信息，如seqidno.14所示。

所述的snp79所在基因上下游500bp序列信息，如seqidno.15所示。

所述的pcr扩增，其中涉及的引物包括：c12、c16、c6、c71、c79引物对，具体为：

如seqidno.1所示的上游引物c12-f：5’gtgtgcctcccactccatca3’，

如seqidno.2所示的上游引物c12-r：5’ctaccaaatgttaattcccttca3’；

如seqidno.3所示的上游引物c16-f：5’cctctgcctggtagccgtta3’，

如seqidno.4所示的上游引物c16-r：5’gcgaggtaggcaaggaagaa3’；

如seqidno.5所示的上游引物c6-f：5’gtgcccaggaaaactacaaa3’，

如seqidno.6所示的上游引物c6-r：5’gagagcctccaacacagacaa3’；

如seqidno.7所示的上游引物c71-f：5’aaatgtcactgttttactgcg3’，

如seqidno.8所示的上游引物c71-r：5’tggtcctattccccttcaga3’；

如seqidno.9所示的上游引物c79-f：5’ccacaccctctcgttcccag3’，

如seqidno.10所示的上游引物c79-r：5’ctgtcggcagtgtggtgtcg3’。

所述的pcr扩增，反应体系为模板dna1ng/ul、引物1ul、h2o3.8ul、2×taqpcrmasrermix50ul；和/或，所述pcr反应的反应程序为95℃预变性2min，95℃预变性30s，60℃退火温度30s，72℃延伸1min，循环次数30次，72℃再延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为2％。

所述的凝胶电泳，其条带要求为：c12长度约280，c6长度约250，c71长度约241，c79长度约271，c16长度约为180。

所述的sanger测序，其鉴定位点为：snp6、snp12、snp16、snp71、snp79位点处出现特异突变；

参考基因组snp6位于6号染色体第25668001位，比对序列为cggaggaca，最后一个位点为鉴定位点，基因型为a，小梅山猪的特异突变为g；

参考基因组snp12位于12号染色体第12412657位，比对序列为gcaaaggca，最后一个位点为鉴定位点，基因型为a，小梅山猪的特异突变为g；

参考基因组snp16位于16号染色体第70624962位，比对序列为aatagcagc，最后一个位点为鉴定位点，基因型为c，小梅山猪的特异突变为t；

参考基因组snp71位于7号染色体第16740526位，比对序列为gtaatagcg，最后一个位点为鉴定位点，基因型为g，小梅山猪的特异突变为a；

参考基因组snp79位于7号染色体第91761900位，比对序列为agctatgtt，最后一个位点为鉴定位点，基因型为t，小梅山猪的特异突变为c。

所述的小梅山猪指原产于江苏句容和江苏太仓的梅山猪，属于太湖猪种。

所述的小梅山猪肉制品是指以小梅山猪为原料加工制备的腌制品和熟食制品。

技术效果

与现有技术相比，本发明以小梅山猪品种特有snps位点为鉴定依据，从分子层面研究鉴别小梅山猪的方法，并以sanger测序为主要分子鉴定方法，能够将小梅山猪与其他猪品种(品系)，例如：长白猪、大白猪、杜洛克、皮特兰、巴克夏、中梅山猪、枫泾猪、米猪、二花脸猪、嘉兴黑猪、沙乌头猪等相区分检测，操作简单快捷。

附图说明

图1a为用c12引物对扩增合格的长度约280bpdna片段凝胶电泳图；b为用c6引物对扩增合格的长度约250bpdna片段凝胶电泳图；c为用c16引物对扩增合格的长度约241bpdna片段凝胶电泳图；d为用c71引物对扩增合格的长度约271bpdna片段凝胶电泳图；e为用c79引物对扩增合格的长度约180bpdna片段凝胶电泳图；

图2为小梅山猪第12号染色体第12412657位点snp多态性的测序图，其中标识部位为snp，正常测序数据下方的标记为小梅山特有的snp位点信息；

图3为图2局部放大示意图；

图4为小梅山猪第6号染色体第25668001位点snp多态性的测序图，其中标识部位为snp，正常测序数据下方的标记为小梅山特有的snp位点信息；

图5为图4局部放大示意图；

图6为小梅山猪第16号染色体第70624962位点snp多态性的测序图，其中标识部位为snp，正常测序数据下方的标记为小梅山特有的snp位点信息；

图7为图6局部放大示意图；

图8为小梅山猪第7号染色体第16740526位点snp多态性的测序图，其中标识部位为snp，正常测序数据下方的标记为小梅山特有的snp位点信息；

图9为图8局部放大示意图；

图10为小梅山猪第7号染色体第91761900位点snp多态性的测序图，其中标识部位为snp，正常测序数据下方的标记为小梅山特有的snp位点信息；

图11为图10局部放大示意图；

图中：鉴定位点为：snp6、snp12、snp16、snp71、snp79位点处出现特异突变；

参考基因组snp6位于6号染色体第25668001位，比对序列为cggaggaca，最后一个位点为鉴定位点，基因型为a，小梅山猪的特异突变为g；

参考基因组snp12位于12号染色体第12412657位，比对序列为gcaaaggca，最后一个位点为鉴定位点，基因型为a，小梅山猪的特异突变为g；

参考基因组snp16位于16号染色体第70624962位，比对序列为aatagcagc，最后一个位点为鉴定位点，基因型为c，小梅山猪的特异突变为t；

参考基因组snp71位于7号染色体第16740526位，比对序列为gtaatagcg，最后一个位点为鉴定位点，基因型为g，小梅山猪的特异突变为a；

参考基因组snp79位于7号染色体第91761900位，比对序列为agctatgtt，最后一个位点为鉴定位点，基因型为t，小梅山猪的特异突变为c。

具体实施方式

选取鉴定小梅山猪耳组织样本二十份，其他十二个品种(品系)耳组织样本每个品种(品系)各十份，采用改良的sds法提取组织dna。

利用引物对c12、c6、c16、c71、c79，进行pcr反应扩增。

pcr反应的反应体系为10ul体系：模板dna1ng/ul、引物1ul、h2o3.8ul、2×taqpcrmasrermix50ul；和/或，pcr反应的反应程序为95℃预变性2min，95℃预变性30s，60℃退火温度30s，72℃延伸1min，循环次数30次，72℃再延伸10min。

用2％的琼脂糖凝胶，1×tae缓冲液为介质电泳检测扩增结果，凝胶电泳条件为电流10a，电压100伏，时间40分钟中。c12引物的扩增产物凝胶电泳图谱出现图1中约280bp长度的条带时，认为扩增结果合格；c6引物的扩增产物凝胶电泳图谱出现图1中约250bp长度的条带时，认为扩增结果合格；c16引物的扩增产物凝胶电泳图谱出现图1中约241bp长度的条带时，认为扩增结果合格；c79引物的扩增产物凝胶电泳图谱出现图1中约271bp长度的条带时，认为扩增结果合格；c16引物的扩增产物凝胶电泳图谱出现图1中约180bp长度的条带时，认为扩增结果合格。

将合格的样本pcr扩增产物进行sanger测序，对测序结果进行分析:snp12的比对序列为gcaaaggca，比对序列最后一位为snp12的多台位点，与c12引物扩增产物的测序结果进行比对,如图6，snp12在参考基因组中的基因型是a，小梅山的品种(品系)特有snp基因型为g；snp6的比对序列为cggaggaca，比对序列最后一位为snp6的多台位点，与c6引物扩增产物的测序结果进行比对,如图七，snp6在参考基因组中的基因型是a，小梅山的品种(品系)特有snp基因型为g；snp16的比对序列为aatagcagc，比对序列最后一位为snp16的多台位点，与c16引物扩增产物的测序结果进行比对,如图八，snp16在参考基因组中的基因型是c，小梅山的品种(品系)特有snp基因型为t；snp71的比对序列为gtaatagcg，比对序列最后一位为snp71的多台位点，与c71引物扩增产物的测序结果进行比对,如图八，snp71在参考基因组中的基因型是g，小梅山的品种(品系)特有snp基因型为a；snp79的比对序列为agctatgtt，比对序列最后一位为snp79的多台位点，与c79引物扩增产物的测序结果进行比对,如图八，snp79在参考基因组中的基因型是t，小梅山的品种(品系)特有snp基因型为c；

表1、12个猪种样本测序结果snp多态性分析表

表中mms为中梅山猪；sms为小梅山猪；sw为沙乌头猪；fj为枫泾猪；er为二花脸；mi为米猪；jx为嘉兴黑猪；dd为杜洛克猪；ll为长白猪；bb为巴克夏猪；pp为皮特兰猪；yy为大白猪。

由测序数据可得，所选小梅山猪品种特异snps在12个群体中具有特异性，除了在中梅山猪snps16位点、snps79位点存在突变；在大白猪snps71位点存在突变；在米猪snps6位点存在突变，其他群体中均未发生突变，且在snps12位点只有小梅山猪具有特异突变。

综合利用通过ggrs所选取的小梅山特有的个snps位点可以准确对小梅山猪进行品种鉴定。综合利用个鉴定位点，如果在snps16和snps79位点位点具有突变，推断待测猪种可能是中梅山猪；如果在snps6位点位点具有突变而在其余四个位点未有突变，则可推断待测猪种可能是米猪；在snps71位点具有突变而在其余四个位点未有突变，则可推断待测猪种可能是大白猪。

snp12所在基因上下游500bp序列信息，如seqidno.11所示。

snp6所在基因上下游500bp序列信息，如seqidno.12所示。

snp16所在基因上下游500bp序列信息，如seqidno.13所示。

snp71所在基因上下游500bp序列信息，如seqidno.14所示。

snp79所在基因上下游500bp序列信息，如seqidno.15所示。

目前国内外没有关于小梅山猪及其肉制品品种(品系)鉴定的相关专利，将第三代分子标记运用小梅山猪及其肉制品品种(品系)鉴定，填补了市场的空缺，有效解决了小梅山猪品种(品系)的鉴伪问题。该鉴定方法相对于现有利用第一代分子标记(rflp)和第二代分子标记(ssr)做猪种鉴定的专利，具有操作更加简单、结果更加准确、快速高效的优点。同时本发明利用第三代分子标记snp克服了前两代分子标记可使用位点少的缺点，相对前两代分子标记的鉴别技术来说，也简化了鉴别方法。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

序列表

<110>上海交通大学

<120>小梅山猪及生肉制品的snp标记组合和鉴定方法

<130>f-a985e

<141>2017-10-25

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>上游引物c12-f()

<400>1

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<210>2

<211>23

<212>dna

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<211>20

<212>dna

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<211>1001

<212>dna

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<210>12

<211>1001

<212>dna

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<213>snp16(snp16)

<400>13

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<210>14

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<400>14

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<213>snp79(snp79)

<400>15

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