一种用于猫传染性腹膜炎病毒检测的RT‑PCR引物组，含有该引物组的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种病毒检测引物组，含有该引物组的试剂盒及其应用，特别涉及一种用于猫传染性腹膜炎病毒检测的引物组，含有该引物组的试剂盒及其应用。本发明属于病毒检测技术领域。

背景技术：

猫传染腹膜炎(felineinfectiousperitonitis，fip)主要由猫传染性腹膜炎病毒(felineinfectiousperitonitisvirus，fipv)引起的猫科动物的渐进性、致死性疾患，主要以腹膜炎、大量腹水聚集(渗出型)或各种脏器出现肉芽肿病变(肉芽肿型)为临床特征，危害严重，是影响养猫业发展的主要病毒性传染病之一。

目前国内临床诊断工的方法包括病理学检查、血清学检测和rt-pcr检测等。仅通过临床症状进行诊断的方法，需要依赖于临床症状的表现以及诊断者的经验，而患传染性腹膜炎的猫初期症状不明显，病程进展有较大差异，导致获得的结果容易不准确，往往因误诊而贻误治疗最终导致病猫死亡。现有的常规方法是抽取腹腔液提取后进行检测，这种方法本身的敏感性极低，而同时由于fipv在腹腔液中含量极少，非常容易导致漏检，从而不能准确检测出fipv。目前已有猫传染性腹膜炎病毒的rt-pcr检测方法发表，但其引物并非检测猫传染性腹膜炎病毒的特异性引物，而是适用于通用猫冠状病毒。传统方法中往往难以区分猫传染性腹膜炎与猫肠道冠状病毒。

因此，急需建立一种能够区分猫传染性腹膜炎与猫肠道冠状病毒的rt-pcr检测方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于猫传染性腹膜炎病毒检测的rt-pcr引物组，含有该引物组的试剂盒，以及建立一种能够特异、灵敏的检测猫传染性腹膜炎病毒以及猫肠道冠状病毒的检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明发明人将猫传染性腹膜炎和猫肠道冠状病毒的特异性n基因序列进行dnaman比对，选择出一段高特异性序列进行引物设计。实验表明，本发明的引物有很好的特异性，可以明显区分猫传染性腹膜炎与猫肠道冠状病毒。能够实现现有检测技术所无法完成的快速、特异、敏感的结果判定，显著提高了对猫传染性腹膜炎病毒的检测效率及其敏感性，利用该方法作为中间结果的效率、准确性和可靠性高，通过添加荧光基团实时监测扩增反应过程，还可以通过制作标准曲线得到定量检测结果。本发明的检测方法和检测试剂盒具有使用方便、检测效率高、节约成本、检测范围大、速度快、通量高、封闭检测无污染、灵敏度高等优势，为尽早发现和有效防控猫传染性腹膜炎病毒提供了新的技术手段。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种用于猫传染性腹膜炎病毒检测的rt-pcr引物组，由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述的下游引物的核苷酸序列如seqidno.3所示。

进一步的，本发明还提出了所述的rt-pcr引物组在制备检测猫传染性腹膜炎病毒试剂中的用途。

其中，优选的，所述的试剂用于区分猫传染性腹膜炎病毒感染以及猫冠状病毒感染。

更进一步的，本发明还提出了一种用于猫传染性腹膜炎病毒检测的荧光定量rt-pcr试剂盒，其中含有本发明所述的引物组以及evagreen荧光染料反应液。

其中，优选的，所述的试剂盒中还包括反转录pcr反应液、荧光定量pcr参比染料、dntp、rnasin、随机引物、逆转录酶、阳性标准品、阴性对照以及无rna酶水。

其中，优选的，所述的逆转录酶为m-mlv，所述的阳性标准品为含有猫传染性腹膜炎病毒n基因或其保守区的质粒，所述的保守区的序列如seqidno.1所示。

所述的试剂盒用于猫传染性腹膜炎病毒检测时，按照以下步骤进行：

(1)提取待测样本的总rna

(2)反转录

对步骤(1)提取得到的总rna进行反转录得到dna模板；

(3)荧光定量pcr检测

利用阳性标准品作为对照，以步骤(2)得到的dna为模板，使用所述的引物组进行荧光定量pcr扩增，荧光定量pcr体系为：

荧光定量pcr程序为：95℃15min，95℃10s，60℃30s，共进行35～40个循环；

(4)标准曲线的制作

利用一系列不同浓度梯度的阳性标准品为模板，并以标准品拷贝数的对数做为x轴，ct值做为y轴绘制标准曲线；

(5)样本中病毒含量的计算

根据建立的标准曲线分别计算样本中病毒的拷贝数。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、本发明提供了一种猫传染性腹膜炎病毒检测用引物组和检测试剂盒，能够有效区分猫传染性腹膜炎病毒与猫肠炎冠状病毒。而已有的检测方法不能将猫传染性腹膜炎与猫肠道冠状病毒区分开来，因此与已公开的方法具有显著的技术优势。

2、采用实时荧光定量pcr方法，具有线性检测范围大、检测速度快、通量高、封闭检测无污染、灵敏度高等诸多优点。

3、本发明将收录于genbank中高度保守的猫传染性腹膜炎n基因序列大量比对筛选，最终确定高度保守区以设计荧光定量pcr引物。从基因水平去构建猫传染性腹膜炎标准质粒，进行标准曲线的建立，能够实现现有检测技术所无法完成的定量、快速、特异、敏感的结果判定。

附图说明

图1为fipv-n引物与猫传染性腹膜炎序列比对结果；

其中，序列左侧所对应的数字为所述序列的genebank登录号；

图2为fipv-n引物与猫肠道冠状病毒序列比对结果；

其中，序列左侧所对应的数字为所述序列的genebank登录号；

图3为fipv与fecv荧光定量pcr扩增结果；

图4为fipv荧光定量pcr检测方法建立结果；

图5a及图5b为fipv荧光定量pcr标准曲线建立结果；

图6为fipv荧光定量pcr灵敏度检测结果；

图7为fipv荧光定量pcr灵敏度检测结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步的说明验证，所有实施例仅用于例证本发明，不限制本发明的保护范围。本领域技术人员知晓对于本发明权利要求内所做的更改或等效变更，均落入本发明的保护范围之内。

实施例1用于猫传染性腹膜炎病毒检测的荧光定量rt-pcr引物的设计与合成

1、引物的设计与合成

通过猫传染性腹膜炎病毒生物信息分析，确定了n基因作为本发明的目的基因。根据genbank中收录的猫传染性腹膜炎病毒n基因序列，使用dnaman比对诸多序列筛选出高度保守区。具体为：编码n基因的第115-505位(seqidno.1)。针对该保守区设计并合成了用于猫传染性腹膜炎病毒检测的rt-pcr引物组，表1所示。然后，将n基因的pcr产物回收纯化克隆入pmd19-t载体，构建的质粒命名为pmd19-t-n。测序结果正确后建立检测方法与标准曲线。

表1引物序列

2.猫传染性腹膜炎荧光定量rt-pcr引物的特异型

由于已有的检测方法不能将猫传染性腹膜炎与猫肠道冠状病毒区分开来，本发明将设计的特异性引物与猫传染性腹膜炎病毒(fipv)以及猫肠道冠状病毒(fecv)的序列通过dnaman进行了比对，结果如图1和图2所示。从图1和图2结果可以看出，本发明设计的引物为fipv特异性引物。为进一步验证引物特异性，对fipv与fecv分别用本发明引物扩增，结果如图3所示，该结果表明：fipv样本扩增曲线正常，fecv扩增结果呈阴性。

实施例2猫传染性腹膜炎病毒荧光定量rt-pcr检测方法的建立

方法：

1、提取待测样本的总rna

取约100mgfipv阳性或阴性组织于冰浴匀浆器中，加入1mltrizol(invitrogen,usa)，迅速研磨成匀浆液，加入200μl氯仿，震荡30s，冰上放置5min。4℃，12000rpm，离心10min，取上层水相转移至另一1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置2h。然后4℃，12000rpm，离心20min，弃上清，加入1ml75％乙醇，轻轻混匀，4℃，12000rpm，离心10min，吸净上清液，于室温下晾干，加入20μldepc处理的去离子水溶解沉淀，-80℃保存备用。

2、反转录

使用试剂盒(promega，usa)对所述总rna进行反转录得到dna模板。反转录反应液组成如下表2所示：

表2反转录体系

42℃反转录50min，95℃5min灭活反转录酶。

3、荧光定量pcr检测

利用fipv阳性质粒pmd19-t-n作为对照，以上述得到的fipv阴性和fipv阳性临床样本的dna为模板，使用实施例1合成的引物进行荧光定量pcr扩增，荧光定量pcr体系如表3所示，荧光定量pcr程序如表4所示：

表3real-timepcr反应体系

表4real-timepcr反应程序

4、标准曲线的制作

利用一系列不同浓度梯度的目的基因标准品质粒绘制标准曲线后，分别计算样本中各自标准品的拷贝数。本方法采用2.41×10⁸copies/ul-2.41×10¹copies/ul不同的8个稀释度样本作为模板，使用abi7500荧光定量pcr仪根据表3，表4完成扩增。检测后，生成动力学曲线图，并以标准品拷贝数的对数做为x轴，ct值做为y轴自动绘制标准曲线。

5、灵敏度检测

利用一系列10倍稀释浓度梯度的目的基因标准品质粒pmd19-t-n做模板，按照表3及表4中程序与体系进行实验。每种样品做三个平行样品，避光条件下进行。确定出已建立的荧光定量pcr方法能够检测出的最低拷贝数。

6、特异性检测

按照表3及表4中程序与体系检测猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、传染性造血器官坏死病病毒、牛细小病毒、猫传染性腹膜炎病毒，猫肠炎冠状病毒，以对本发明发明的特异性进行评价。

结果：

1、临床样本检测

结果如图4，结果可见，fipv阳性质粒pmd19-t-n对照、阳性临床样本出现扩增，阴性样本未出现扩增曲线。从溶解曲线上看，阳性质粒对照与阳性临床样本为单峰且无非特异性峰出现，表明本方法有很好的特异性。

2、标准曲线的制作

结果如图5所示，结果显示，相关系数r²可达0.99，斜率m＝-3.46，证明该标准曲线在2.41×10⁸copies/ul-2.41×10¹copies/ul8个不同浓度范围内具有良好的线性关系，标准品可用。

3、灵敏度检测

利用一系列10倍稀释浓度梯度的目的基因标准品质粒pmd19-t-n做模板，按照表3及表4中程序与体系进行实验。每种样品做三个平行样品，避光条件下进行。确定出已建立的荧光定量pcr方法能够检测出的最低拷贝数。

实验证明最低可检测限度为2.41×10¹copies/ul。结果如图6所示。

4、特异性检测

利用该方法检测猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、传染性造血器官坏死病病毒、牛细小病毒、猫传染性腹膜炎病毒，猫肠炎冠状病毒。结果如图7所示，该结果表明，只有猫传染性腹膜炎病毒得到阳性结果。

实施例3猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量rt-pct试剂盒组成

该实时荧光定量检测试剂盒包括：反转录pcr反应液、dntp()、rnasin()、随机引物()、m-mlv()、evagreen荧光染料反应液、荧光定量pcr参比染料、特异性引物对(10um，表1)、阳性标准品(pmd19-t-n质粒)、阴性对照以及无rna酶水。

序列表

<110>东北农业大学

<120>一种用于猫传染性腹膜炎病毒检测的rt-pcr引物组，含有该引物组的试剂盒及其应用

<130>klpi170866

<160>3

<170>patentin3.5

<210>1

<211>391

<212>dna

<213>fipv

<400>1

atggccacacagggacaacgcgtcaactggggagatgaaccttccaaaagacgtggtcgt60

tctaactctcgtggtcggaagaataatgatatacctttgtcattctacaaccccattacc120

ctcgaacaaggatctaaattttggaatttgtgtccgagagaccttgttcccaaaggaata180

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gctgatgctaaattcaaagacaagattgatggagtcttttgggttgcaagggatggtgcc360

atgaacaagcccacaacgcttggcactcgtg391

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>2

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<210>3

<211>28

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

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