一种老年性黄斑病变的检测与治疗方法与流程

本发明属于眼科疾病的诊断与治疗技术领域，具体涉及一种用于检测引发眼部疾病的微生物的方法及用于治疗该疾病的药物。

背景技术：

长期以来，人们普遍认为，健康的眼球上是没有微生物的，因为泪水和眨眼可以清除微生物等的异物，然而随着近些年的研究发现，健康的眼部也会有微生物存在。这些微生物有一些是共生菌，而有一些则是致病菌。

老年性黄斑病变(age-relatedmaculardegeneration，amd)为黄斑部结构的衰老改变，分为干性amd和湿性amd，是老年人不可逆转的丧失视力的主要原因。

干性amd由于rpe-bruch膜-脉络膜毛细血管复合体的长期慢性进行性萎缩所致。干性amd多发生于50岁以上的老年人，双眼对称、视力极为缓慢的进行性下降、病人常有视物变形等症状。眼底检查双眼黄斑区色素紊乱、中心凹光反射消失、后极部有时常可见到一些大小不一、边界不很清晰的黄白色的玻璃膜疣。病程晚期有些病人由于rpe(retinalpigmentepithelium，rpe)的萎缩及色素脱失，可见后极部视网膜有边界较为清晰的地图样萎缩区。如果脉络膜毛细血管也发生萎缩，就可以见到萎缩区内有一些粗大的脉络膜血管。

湿性amd是由于bruch膜受损，脉络膜毛细血管经由bruch膜损害处向视网膜色素上皮及视网膜神经上皮处生长，形成脉络膜新生血管(choroidalneovascularization，cnv)。cnv一旦形成，由于新生血管的结构不完善，必将引起渗出、出血、机化、瘢痕等一系列病理改变，终致中心视力丧失殆尽。

随着年龄的增长，视网膜色素上皮的吞噬功能降低，感光细胞外节盘不能完全消化，残余的代谢产物不断从rpe细胞内排出，沉积在玻璃膜处，形成玻璃膜疣。

玻璃膜疣分为：硬性、软性、混合性和退化性四类。玻璃膜疣可见于正常视力的老年人，疣数量增加、色素增加、融合增大是玻璃膜疣具有危险因素的特征。玻璃膜疣在玻璃膜上的蓄积，会影响视网膜通过脉络膜血管接受营养和氧气，也会使bruch’s膜的完整性受到破坏，视网膜处于低氧或缺血状态时，会导致血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,vegf)、整合素和蛋白酶上调，当vegf的信号强于色素上皮衍生因子(pigmentepitheliumderivedfactor,pedf)时，会导致促血管生成增强，刺激新生血管生长。vegf表达的增高和bruch’s膜的破裂最终导致cnv的形成，随之引起渗出、出血及瘢痕形成。

在过去十年中，人们利用高通量测序技术和微生物/宏基因组分析，广泛的研究了与人类健康和疾病相关的微生物群落的多样性和功能。在生理和病理状况下，眼睛的局部微生物群基本上没有表征。一直以来，人们认为在生理条件下眼内腔绝对无菌，这使许多研究人员认为任何类型的外来生物都是外源性和致病性的。然而，本发明申请人的研究表明，即使没有眼睛窘迫或感染迹象的正常健康眼睛也具有微生物群，这些微生物的组成和功能与身体其他部位和组织的微生物群的组成和功能不同。有趣的是，大多数人的眼中都有痤疮丙酸杆菌，但是并不显著的诱导眼内炎的发生，这个事实有一个合理的假设，即正常的眼内微生物群在维持局部眼部环境的平衡方面起关键作用。类似地，眼内微生态环境内的微生物失调可能会导致许多感染性，炎性，肿瘤和退行性眼部疾病。此外，如痤疮丙酸杆菌等微生物的阳性培养物是眼内炎症的主要判断依据，事实上这些微生物可能是眼内共生菌群的一部分，真正的病原体是人们没有意料到的，从而出现误诊的情况。外科手术、玻璃体内注射抗vegf剂等许多眼部手术可能触发致病性眼内微生物暴露于宿主免疫系统。因此，在未来的研究中需要明确界定眼内微生物群与眼部健康的关系。

遗传学研究成功地确定了涉及amd发病机理的各种因素。这些因素都表明补体级联的激活和免疫反应的控制是amd发病和发展的关键因素。然而，amd的病因(特别是形成玻璃膜疣)以及补体和amd病理学之间的关键环节尚不清楚。

现有技术并没有明确引起老年性黄斑病变的原因，诊断时只能依据患者的症状作为判断依据，并没有确切的依据帮助医生做出准确的判断，以致误诊或者延误救治的最佳时机。现有技术中常用玻璃体切割术治疗老年性黄斑病变，但是手术后视力的改善是很有限的，有时需要多次手术，才能保住患者仅有的微弱视力及眼球，有些患者甚至在多次手术后仍然没有治疗效果。

为克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种检测老年性黄斑病变的方法与治疗老年性黄斑病变的药物。

技术实现要素：

本发明的第一方面提供一种检测眼内微生物的方法，所述的微生物选自痤疮丙酸杆菌，巨大芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，恶臭假单胞菌，白叶枯菌，嗜麦芽寡养单胞菌，罗氏乳酸杆菌，溶血性葡萄球菌，正哈氏嗜纤维菌，阴道嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，蜡状芽孢杆菌，表皮葡萄球菌，蜜蜂屎肠球菌中的一种或者两种以上，所述方法为利用宏基因组测序方法检测所述菌种，和/或，利用实时荧光定量pcr方法检测所述菌种。

优选的，所述检测眼内微生物的方法步骤如下：

(1)取视网膜组织，提取视网膜组织中的dna；

(2)利用宏基因组测序方法和/或实时荧光定量pcr方法对视网膜组织中的dna进行检测，以检测视网膜中的微生物，所述的微生物选自痤疮丙酸杆菌，巨大芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，恶臭假单胞菌，白叶枯菌，嗜麦芽寡养单胞菌，罗氏乳酸杆菌，溶血性葡萄球菌，正哈氏嗜纤维菌，阴道嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，蜡状芽孢杆菌，表皮葡萄球菌，蜜蜂屎肠球菌中的一种或者两种以上。

进一步的，所述检测眼内微生物的方法的步骤(1)中还包括如下操作步骤：

1)灌洗患者结膜囊；

2)对患者进行散瞳；

3)对患者眼部进行消毒；

4)对患者结膜囊进行灭菌；

5)取视网膜组织，提取视网膜组织中的dna。

更进一步的，所述检测眼内微生物的方法的步骤(1)中还包括如下操作步骤：

1)用0.9％氯化钠溶液灌洗患者结膜囊2～5次；

2)用药物对患者进行散瞳，所述散瞳药物选自复方托吡卡胺溶液、阿托品眼膏、阿托品溶液、后马托品溶液、后马托品眼膏、托品酰胺溶液，卡托品溶液、新福林溶液、东莨菪碱溶液中的一种或两种；

3)用药物对患者眼部进行消毒，所述消毒药物选自聚维酮碘溶液、盐酸左氧氟沙星眼用凝胶、氧氟沙星溶液、盐酸左氧氟沙星溶液、妥布霉素地塞米松眼膏、妥布霉素地塞米松溶液、复方硫酸新霉素溶液中的一种或两种，施用于眼睛15～45秒；

4)用药物对患者结膜囊进行灭菌，所述灭菌药物选自妥布霉素溶液、盐酸洛美沙星溶液、氧氟沙星溶液中的一种或两种，灌注2～5次；

5)取视网膜组织，提取视网膜组织中的dna。

优选的，本发明所述检测眼内微生物的方法可以是诊断目的或非诊断目的。

本发明第二方面提供一种老年性黄斑病变的诊断方法，所述方法为利用宏基因组测序方法检测眼内的微生物，和/或，利用实时荧光定量pcr方法检测眼内的微生物，所述的微生物选自痤疮丙酸杆菌，巨大芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，恶臭假单胞菌，白叶枯菌，嗜麦芽寡养单胞菌，罗氏乳酸杆菌，溶血性葡萄球菌，正哈氏嗜纤维菌，阴道嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，蜡状芽孢杆菌，表皮葡萄球菌，蜜蜂屎肠球菌中的一种或者两种以上。

优选的，本发明所述的老年性黄斑病变的诊断方法步骤如下：

(1)取视网膜组织，提取视网膜组织中的dna；

(2)利用宏基因组测序方法和/或实时荧光定量pcr方法对视网膜组织中的dna进行检测，以检测视网膜中的痤疮丙酸杆菌，巨大芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，恶臭假单胞菌，白叶枯菌，嗜麦芽寡养单胞菌，罗氏乳酸杆菌，溶血性葡萄球菌，正哈氏嗜纤维菌，阴道嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，蜡状芽孢杆菌，表皮葡萄球菌，蜜蜂屎肠球菌中的一种或者两种以上。

进一步的，所述的老年性黄斑病变的诊断方法的步骤(1)中还包括如下操作步骤：

1)灌洗患者结膜囊；

2)对患者进行散瞳；

3)对患者眼部进行消毒；

4)对患者结膜囊进行灭菌；

5)取视网膜组织，提取视网膜组织中的dna。

更进一步的，所述的老年性黄斑病变的诊断方法的步骤(1)中还包括如下操作步骤：

1)用0.9％氯化钠溶液灌洗患者结膜囊2～5次；

2)用药物对患者进行散瞳，所述散瞳药物选自复方托吡卡胺溶液、阿托品眼膏、阿托品溶液、后马托品溶液、后马托品眼膏、托品酰胺溶液，卡托品溶液、新福林溶液、东莨菪碱溶液中的一种或两种；

3)用药物对患者眼部进行消毒，所述消毒药物选自聚维酮碘溶液、盐酸左氧氟沙星眼用凝胶、氧氟沙星溶液、盐酸左氧氟沙星溶液、妥布霉素地塞米松眼膏、妥布霉素地塞米松溶液、复方硫酸新霉素溶液中的一种或两种，施用于眼睛15～45秒；

4)用药物对患者结膜囊进行灭菌，所述灭菌药物选自妥布霉素溶液、盐酸洛美沙星溶液、氧氟沙星溶液中的一种或两种，灌注2～5次；

5)取视网膜组织，提取视网膜组织中的dna。

优选的，本发明所述的老年性黄斑病变的诊断方法为诊断干性老年性黄斑病变或者湿性老年性黄斑病变，更优选的，所述的老年性黄斑病变的诊断方法为诊断有玻璃膜疣症状的干性老年性黄斑病变或者湿性老年性黄斑病变，所述的玻璃膜疣为硬性玻璃膜疣、软性玻璃膜疣、混合性玻璃膜疣和退化性玻璃膜疣，特别优选的，所述的老年性黄斑病变的诊断方法为诊断有软性玻璃膜疣症状的干性老年性黄斑病变或者湿性老年性黄斑病变。

本发明还提供了如下引物对在制备诊断老年性黄斑病变试剂盒中的用途：(1)seqidno:1，seqidno:2，和/或，(2)seqidno:3，seqidno:4，和/或，(3)seqidno:5，seqidno:6，和/或，(4)seqidno:7，seqidno:8，和/或，(5)seqidno:9，seqidno:10，和/或，(6)seqidno:11，seqidno:12，和/或，(7)seqidno:13，seqidno:14，和/或，(8)seqidno:15，seqidno:16，和/或，(9)seqidno:17，seqidno:18，和/或，(10)seqidno:19，seqidno:20，和/或，(11)seqidno:21，seqidno:22，和/或，(12)seqidno:23，seqidno:24，和/或，(13)seqidno:25，seqidno:26，和/或，(14)seqidno:27，seqidno:28，和/或，(15)seqidno:29，seqidno:30。

本发明还提供了一种用于诊断老年性黄斑病变的试剂盒，所述试剂盒通过实时荧光定量pcr方法检测微生物的丰度，对老年性黄斑病变进行诊断。

在本发明的具体实施方式中，用于诊断老年性黄斑病变的试剂盒包括：(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对1)：seqidno:1，seqidno:2，和/或，引物对2)：seqidno:3，seqidno:4，和/或，引物对3)seqidno:5，seqidno:6，和/或，引物对4)seqidno:7，seqidno:8，和/或，引物对5)seqidno:9，seqidno:10，和/或，引物对6)seqidno:11，seqidno:12，和/或，引物对7)seqidno:13，seqidno:14，和/或，引物对8)seqidno:15，seqidno:16，和/或，引物对9)seqidno:17，seqidno:18，和/或，引物对10)seqidno:19，seqidno:20，和/或，引物对11)seqidno:21，seqidno:22，和/或，引物对12)seqidno:23，seqidno:24，和/或，引物对13)seqidno:25，seqidno:26，和/或，引物对14)seqidno:27，seqidno:28，和/或，引物对15)seqidno:29，seqidno:30；(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。

本发明的试剂盒包括：(1)mix；(2)引物对1)：seqidno:1，seqidno:2，和/或，引物对2)：seqidno:3，seqidno:4，和/或，引物对3)seqidno:5，seqidno:6，和/或，引物对4)seqidno:7，seqidno:8，和/或，引物对5)seqidno:9，seqidno:10，和/或，引物对6)seqidno:11，seqidno:12，和/或，引物对7)seqidno:13，seqidno:14，和/或，引物对8)seqidno:15，seqidno:16，和/或，引物对9)seqidno:17，seqidno:18，和/或，引物对10)seqidno:19，seqidno:20，和/或，引物对11)seqidno:21，seqidno:22，和/或，引物对12)seqidno:23，seqidno:24，和/或，引物对13)seqidno:25，seqidno:26，和/或，引物对14)seqidno:27，seqidno:28，和/或，引物对15)seqidno:29，seqidno:30；(3)灭菌水，所述试剂盒中的mix中含有sybrgreenⅰ、taq酶、dntp、buffer。

优选的，所述的试剂盒是检测干性老年性黄斑病变或者湿性老年性黄斑病变，更优选的，所述的试剂盒是检测有玻璃膜疣症状的干性老年性黄斑病变或者湿性老年性黄斑病变，所述的玻璃膜疣为硬性玻璃膜疣、软性玻璃膜疣、混合性玻璃膜疣和退化性玻璃膜疣，特别优选的，所述的试剂盒是检测有软性玻璃膜疣症状的干性老年性黄斑病变或者湿性老年性黄斑病变。

本发明还提供一种治疗老年性黄斑病变的药物，所述的药物为杀灭或抑制微生物的药物，所述的微生物选自痤疮丙酸杆菌，巨大芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，恶臭假单胞菌，白叶枯菌，嗜麦芽寡养单胞菌，罗氏乳酸杆菌，溶血性葡萄球菌，正哈氏嗜纤维菌，阴道嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，蜡状芽孢杆菌，表皮葡萄球菌，蜜蜂屎肠球菌中的一种或者两种以上的组合。

本发明所述的杀灭是指杀灭致病微生物。

本发明所述的抑制是指抑制微生物的生长繁殖。

本发明所述的药物优选为杀灭或抑制微生物的药物，所述的微生物选自痤疮丙酸杆菌，巨大芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，恶臭假单胞菌，白叶枯菌，嗜麦芽寡养单胞菌，罗氏乳酸杆菌，溶血性葡萄球菌，正哈氏嗜纤维菌，阴道嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，蜡状芽孢杆菌，表皮葡萄球菌，蜜蜂屎肠球菌中的一种或者两种以上。

本发明所述的药物选自化学药物、生物药物或天然药物中的一种。

本发明所述的药物可以是单一组分也可以是组合物。

本发明所述的化学药物选自β-内酰胺类抗生素：包括青霉素类、头孢菌素类、硫酶素类、单内酰环类，β-内酰酶抑制剂、甲氧青霉素类等；氨基糖苷类抗生素：包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿斯霉素等；四环素类抗生素：包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等；氯霉素类抗生素：包括氯霉素、甲砜霉素等；大环内脂类抗生素：包括红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素、阿奇霉素等；糖肽类抗生素：万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁等；喹诺酮类抗生素：包括诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、加替沙星；硝基咪唑类抗生素：包括甲硝唑、替硝唑、奥硝唑等；利福霉素类抗生素：包括利福平等；棘白菌素类抗生素；多烯类抗生素；嘧啶类抗生素；烯丙胺类抗生素；氮唑类抗生素；其它抗生素：磷霉素、卷霉素、环丝氨酸、林可霉素、氯林可霉素、丝裂霉素、放线菌素d、博莱霉素、阿霉素、异烟肼、吡嗪酰胺、环孢霉素等中的一种或者两种以上。

本发明所述的生物药物为抗菌肽，所述的抗菌肽选自昆虫抗菌肽，例如，鳞翅目抗菌肽、双翅目抗菌肽，鞘翅目抗菌肽，蜻蜓目抗菌肽，膜翅目抗菌肽，家蚕抗菌肽等；哺乳动物抗菌肽，例如，猪抗菌肽，绵羊抗菌肽，牛抗菌肽，人抗菌肽等；两栖动物抗菌肽：爪蟾素等；鱼类、软体动物、甲壳类动物来源的抗菌肽：豹鳎抗菌肽，鲶抗菌肽，贻贝抗菌肽，虾抗菌肽等；植物抗菌肽：thi-onins等，细菌抗菌肽：杆菌肽、短杆菌肽、多粘菌素和乳链菌肽等中的一种或者两种以上。

本发明所述的天然药物选自煅古墨、丹参、紫草、板蓝根、鱼腥草、金银花、黄连、黄芩、蒲公英、马齿苋、山楂、大青叶、连翘、菌陈、穿心莲、柴胡、大黄、地锦草、百部、大蒜、黄柏、杜仲、秦皮、蛇床子、黄连、五倍子、紫花地丁、乌梅、甘草、石榴皮、五味子、皂刺、诃子、苦参、土槿皮，淫羊藿，青蒿或其提取物中的一种或者两种以上。

本发明所述的药物可以是口服药物、注射药物或者外用药物，所述的外用药物包括粘膜给药药物，优选为眼部给药药物。

本发明所述的药物的剂型可以是溶液、片剂、丸剂、胶囊、注射液、粉末、注射用粉末、贴剂、涂剂、粘膜给药制剂，所述的粘膜给药制剂优选为眼药水、眼药膏、眼喷雾制剂等。

本发明还提供了杀灭或抑制微生物的药物在制备用于治疗老年性黄斑病变的药物中的应用，优选的，所述的老年性黄斑病变为干性老年性黄斑病变或者湿性老年性黄斑病变，更优选的，所述的老年性黄斑病变为有玻璃膜疣症状的干性老年性黄斑病变或者湿性老年性黄斑病变，所述的玻璃膜疣为硬性玻璃膜疣、软性玻璃膜疣、混合性玻璃膜疣和退化性玻璃膜疣，特别优选的，所述的老年性黄斑病变为有软性玻璃膜疣症状的干性老年性黄斑病变或者湿性老年性黄斑病变。

本发明的申请人发现所有人的眼内都有微生物，接着研究了是否有与眼内疾病相关的特殊的眼内微生物可以表征眼部的临床症状，并对41例白内障(cataract，cat)，20例amd，18例青光眼(glaucoma，gla)，9例白塞病(betch’sdisease，bd)，9例伏格特-小柳-原田综合征(vogt-koyanagi-haradasyndrome，vkh)和8例眼内炎(endophthalmitis，eos)患者的房水样本进行了宏基因组测序分析。经研究发现，尽管所有患者的眼内都以细菌作为其眼内微生物群的主要组分，但是这6种类型的患者眼内微生物群落的α多样性和均匀性有显著性差异。对眼内所有微生物进行主成分分析(pca)，在cat，eos和一些gla患者中有显著性差异。而amd，vkh，bd和一些青光眼患者其眼内微生物群落无显著性差异。类似的，所有基因组的功能性微生物基因丰度的层次聚类分析表明，每种眼部症状都具有微生物功能的一般特征，然而每个疾病组都有异常值，通过这些异常值可以区分疾病群。尽管眼内微生物呈现出显著的差异性，依然能够识别出测试的每个眼部疾病组的特征性细菌种类。综合起来，研究结果表明，眼内微生物群的组成和功能可以区分诸如amd，cat，gla，bd，vkh和eos的眼部疾病。

本发明的申请人通过宏基因组分析确定了amd患者的ah中高度富集14种细菌。在这14种细菌中，痤疮丙酸杆菌是amd患者的ah中最丰富的微生物，其次是地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。本发明的申请人用pcr方法检测了是否可以在硬或软的玻璃膜疣组织中检测到14种amd特异性细菌，然后与6名amd患者的非玻璃体视网膜组织相比较。结果显示只有8种细菌可以被检测到，其中痤疮丙酸杆菌是最丰富的物种，而巨大芽孢杆菌是软性玻璃膜疣中唯一的细菌。与非玻璃体非视网膜组织相比，硬性玻璃膜疣、软性玻璃膜疣和干性amd病变组织中痤疮丙酸杆菌相对丰富。与非玻璃体/非病变组织相比，巨大芽孢杆菌的相对丰度在软性玻璃膜疣中升高约18倍，但不高于amd病变中的。这些数据表明巨大芽孢杆菌玻璃膜疣的形成与amd发病机制有关。

以前的研究表明，除了许多其他蛋白质外，玻璃膜疣还含有各种补体成分和多糖。此外，玻璃膜疣组分激活炎症反应并促进il-1β和il-18的表达。因此，本发明的申请人首先检查了作为玻璃膜疣组成的巨大芽孢杆菌是否能够体外诱导急性视网膜色素上皮-19细胞(acuteretinalpegmentepitheliitis-19，arpe19)细胞补体系统的活化，促进il-1β和il-18的分泌。结果显示，随着时间的推移，巨大芽孢杆菌显著增加rpe细胞的凋亡，但是痤疮丙酸杆菌不会随着时间的推移而增加rpe细胞的凋亡。c5a蛋白的代谢产物证实补体系统的活化。而两种细菌均诱导细胞分泌cfh蛋白，而巨大芽孢杆菌诱导的cfh比痤疮丙酸杆菌更强烈。由于巨大芽孢杆菌的体外感染导致的细胞的凋亡，使得rpe细胞分泌活性il-1β和il-18。这些结果表明，巨大芽孢杆菌的感染可导致类似于软玻璃膜疣的炎症。

接着，本发明的申请人研究了巨大芽孢杆菌是否能够在体内诱导炎症的发生。由于猕猴的眼睛与人眼有相似的眼部解剖结构和眼内环境，所以选择非人的灵长类动物作为模型动物。感染活的痤疮丙酸杆菌或将其超声处理灭活的蛋白质接种到眼睛中，或者感染活的地衣芽孢杆菌或将其超声处理灭活的蛋白质接种到眼睛中。然而，活的巨大芽孢杆菌的感染导致严重的眼内炎症，而其灭活的蛋白质则不会导致严重的眼内炎症。由于tnfa和il6升高，而ifng和il17a没有表达证明由活的巨大芽孢杆菌诱导眼内炎症的发生。重要的是，只有活的巨大芽孢杆菌才能激活包括c5a和cfh在内的补体系统，并在体内诱导pyroptotic细胞因子il-1β和il-18。炎症发作后，细菌在眼睛中仍然活着，意味着眼内炎症可能持续很长时间。总之，巨大芽孢杆菌的感染可以激活补体系统，并且能在体外和体内诱导眼细胞的凋亡。

本发明申请人的研究结果表明，玻璃膜疣中的巨大芽孢杆菌等细菌和激活的局部补体介导的免疫应答的巨大芽孢杆菌等细菌可以解释rpe和bruch膜之间形成多样化的玻璃膜疣。在玻璃膜疣中发现的包括c1q、免疫球蛋白等补体成分在内的蛋白质是一线抗感染剂。玻连蛋白和载脂蛋白e最近被证明是抗感染剂。因此，玻璃膜疣的形成很可能是老化视网膜控制过滤细菌病原体的关键反应。由于细菌的多样性，玻璃膜疣的形状和大小可能会有所不同。在硬玻璃膜疣的情况下，感染可能会被清除，玻璃膜疣会消失。然而，某些病原体如巨大芽孢杆菌会诱导软性玻璃膜疣中的免疫应答的长期活化，并导致rpe细胞和光感受器的损伤。激活rpe或巨噬细胞的炎症反应和pyroptosis是对局部感染的保护反应，这与以前的发现的nlrp3介导的炎症反应活化和il-18的产生保护视网膜免于新生血管的形成相一致。

amd的感染性病因也与所有遗传学研究得出的结论一致。例如，有缺陷的cfh，巨大芽孢杆菌感染引起的补体活化的负调节因子将导致不受控制的补体的激活。有缺陷的htra1是产生免疫抑制细胞因子tgf-β的活性形式的蛋白酶，会导致局部tgf-β家族蛋白的减少。这两种遗传变异都可能导致局部抗感染反应的失调，损伤rpe细胞和光感受细胞。

此外，在玻璃膜疣中发现的致病微生物的潜在差异可能解释了不同种族群体(即白种人与亚洲人)与不同遗传风险因素之间的关联。研究得到的数据表明，amd的感染性病因是老年人开始早期amd病理学的合理机制。本发明申请人的发现为amd的诊断，治疗和预防提供了一个新的目标。

本发明根据老年性黄斑病变常见致病微生物基因组dna的保守序列，设计并合成可以致病微生物dna的通用引物，利用实时荧光定量pcr法检测致病微生物，从而实现高效、准确地检测引发老年性黄斑病变的微生物，帮助医生在疾病诊断过程中能快速准确做出判断。并且本发明提供的药物是针对引起老年性黄斑病变的原因制备的，可有效的治疗老年性黄斑病变。

附图说明

图1所示为不同疾病患者眼中细菌、病毒、真菌在总微生物群中的比例；

图1a所示为不同疾病患者眼中细菌在总微生物群中的比例；

图1b所示为不同疾病患者眼中病毒在总微生物群中的比例；

图1c所示为不同疾病患者眼中真菌在总微生物群中的比例；

图2为不同疾病患者眼内高度富集的细菌种类lefse分析图，其中1-门多萨假单胞菌，2-栖息微球菌，3-脂环素反硝化菌，4-氧化木糖无色杆菌，5-鞘脂单胞杆菌，6-脓肿分枝杆菌，7-金黄节杆菌，8-普氏菌，9-草木樨中华根瘤菌，10-酸性酵母，11-表皮葡萄球菌，12-铜绿假单胞菌，13-金黄色葡萄球菌，14-溶血性葡萄球菌，15-恶臭假单胞菌，16-嗜麦芽寡养单胞菌，17-蜡状芽孢杆菌，18-巨大芽孢杆菌，19-罗氏乳酸杆菌，20-阴道嗜血杆菌，21-蜜蜂屎肠球菌，22-正哈氏嗜纤维菌，23-地衣芽孢杆菌，24-白叶枯菌，25-鲍曼不动杆菌，26-醋酸钙不动杆菌，27-睾丸酮丛毛单胞菌，28-堪萨斯分枝杆菌，29-斯润金芽孢杆菌，30-柯氏柠檬酸杆菌，31-发酵成对杆菌，32-粘质沙雷氏菌，33-维氏鞘氨醇单胞菌，34-肺炎克雷伯菌，35-荧光假单胞菌，36-皮氏罗尔斯顿菌，37-卷曲乳杆菌，38-伯克霍尔德菌，39-德氏乳杆菌，40-meiothermussilvanus(d)，41-大肠杆菌，42-藤黄微球菌，43-枯草芽孢杆菌，44-粘金色棒状杆菌，45-大芬戈尔德菌。

图3为6种疾病的患者的眼中痤疮丙酸杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的相对丰度；

图3a所示为6种疾病的患者的眼中痤疮丙酸杆菌的相对丰度；

图3b所示为6种疾病的患者的眼中地衣芽孢杆菌的相对丰度；

图3c所示为6种疾病的患者的眼中巨大芽孢杆菌的相对丰度。

图4所示为amd患者的非玻璃膜疣、硬玻璃膜疣和软的玻璃膜疣组织中痤疮丙酸杆菌丰度；

图4a所示为amd患者的非玻璃膜疣、硬玻璃膜疣和软的玻璃膜疣组织中痤疮丙酸杆菌丰度；

图4b所示为amd患者的非玻璃膜疣、硬玻璃膜疣和软的玻璃膜疣组织中巨大芽孢杆菌丰度；

图4c所示为amd患者的非玻璃膜疣、硬玻璃膜疣和软的玻璃膜疣组织中罗氏乳酸杆菌丰度；

图4d所示为amd患者的非玻璃膜疣、硬玻璃膜疣和软的玻璃膜疣组织中恶臭假单胞菌丰度；

图4e所示为amd患者的非玻璃膜疣、硬玻璃膜疣和软的玻璃膜疣组织中铜绿假单胞菌丰度；

图4f所示为amd患者的非玻璃膜疣、硬玻璃膜疣和软的玻璃膜疣组织中白叶枯菌丰度；

图4g所示为amd患者的非玻璃膜疣、硬玻璃膜疣和软的玻璃膜疣组织中地衣芽孢杆菌丰度；

图4h所示为amd患者的非玻璃膜疣、硬玻璃膜疣和软的玻璃膜疣组织中阴道嗜血杆菌丰度。

图5所示为巨大芽孢杆菌和痤疮丙酸杆菌对arpe19细胞的影响；

图5a为巨大芽孢杆菌与痤疮丙酸杆菌对rpe细胞的影响对照图；

图5b为培养12h、24h、48h后巨大芽孢杆菌与痤疮丙酸杆菌诱导arpe19细胞产生的细胞因子对照图；

图5c为巨大芽孢杆菌与痤疮丙酸杆菌诱导arpe19细胞产生的细胞因子对照图。

图6所示为巨大芽孢杆菌、痤疮丙酸杆菌和地衣芽孢杆菌对猕猴眼睛的影响；

图6a所示为痤疮丙酸杆菌的活菌、地衣芽孢杆菌的活菌、痤疮丙酸杆菌的超声灭活蛋白、地衣芽孢杆菌的超声灭活蛋白对猕猴眼睛的影响；

图6b所示为痤疮丙酸杆菌的活菌、巨大芽孢杆菌的活菌、痤疮丙酸杆菌的超声灭活蛋白、巨大芽孢杆菌的超声灭活蛋白对猕猴眼睛的影响。

具体实施方式

实施例1

一种用于检测痤疮丙酸杆菌的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:1gattggtttactacccgtgagcg，seqidno:2atagcagggattccagcgaca；(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测痤疮丙酸杆菌。

实施例2

一种用于检测巨大芽孢杆菌的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:3ggttcaatgagcctact，seqidno:4gccagcgtctttcc；(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测巨大芽孢杆菌。

实施例3

一种用于检测地衣芽孢杆菌的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:5tcccgtcttcatctactgc，seqidno:6ggacgcctactggacaa；(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测地衣芽孢杆菌。

实施例4

一种用于检测恶臭假单胞菌的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:7ccgcacaggttgtccca，seqidno:8ctgctgcgttgtcgttcc；(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测恶臭假单胞菌。

实施例5

一种用于检测白叶枯菌的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:9tggtgcgatggcgatgtt，seqidno:10ggttgcggcatgtgcttt；(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测白叶枯菌。

实施例6

一种用于检测嗜麦芽寡养单胞菌的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:11gcgttcgtccgctgtca，seqidno:12ggcaacccgctagaatccc；(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测嗜麦芽寡养单胞菌。

实施例7

一种用于检测罗氏乳酸杆菌的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:13tagtggataatgccgttga，seqidno:14cggtttgccagaagc；(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测罗氏乳酸杆菌。

实施例8

一种用于检测溶血性葡萄球菌的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:15gttacactgctccgacaa，seqidno:16ttcgcatcagcaataa；(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测溶血性葡萄球菌。

实施例9

一种用于检测正哈氏嗜纤维菌的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:17gctggctcctttgg，seqidno:18gcattactgcctggtg；(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测正哈氏嗜纤维菌。

实施例10

一种用于检测阴道嗜血杆菌的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:19gactccgacttgttt，seqidno:20cattatctggcgttttagc(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测阴道嗜血杆菌。

实施例11

一种用于检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:21gaagcggagttcaaagg，seqidno:22atggcaaatcaccaatca(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测金黄色葡萄球菌。

实施例12

一种用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:23gaccaggtagccgtcgttctc，seqidno:24tgctgaccctgaccgacattc；(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测铜绿假单胞菌。

实施例13

一种用于检测蜡状芽孢杆菌的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:25gaagtgcgtgcgtatagtgt，seqidno:26aaagaacgaccaagtgctg(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测蜡状芽孢杆菌。

实施例14

一种用于检测表皮葡萄球菌的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:27ttgaagtgaaacgtcctc，seqidno:28tgtctcatctaaccacc(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测表皮葡萄球菌。

实施例15

一种用于检测蜜蜂屎肠球菌的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:29tggagcgattataccg，seqidno:30gtacccgcttgattga；(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测蜜蜂屎肠球菌。

实施例16

一种用于诊断某患者是否患有老年性黄斑病变的试剂盒，该试剂盒内含有(1)sybrgreenⅰ；(2)taq酶；(3)引物对seqidno:3ggttcaatgagcctact，seqidno:4gccagcgtctttcc，(4)dntp；(5)buffer；(6)灭菌水。该试剂盒应用于实时荧光定量pcr方法检测眼内是否含有巨大芽孢杆菌。

实施例17

检验患者：41例白内障，20例amd，18例青光眼，9例bd，9例vkh和8例eos患者

检验方法：

(1)取房水样本，提取房水样本中的dna：

1)用0.9％氯化钠溶液灌洗患者结膜囊3次；

2)用阿托品溶液对患者进行散瞳；

3)将氧氟沙星溶液施用于眼睛30秒,对患者眼部进行消毒；

4)将妥布霉素溶液灌注于患者结膜囊3次进行灭菌；

5)取房水样本，提取房水样本中的dna，

(2)利用宏基因组测序方法对房水样本中的dna进行检测。

结果：所有患者的眼内都有微生物，图1为不同疾病患者眼中细菌、病毒、真菌在总微生物群中的比例，如图1所示，在这6种疾病的患者的眼中，都是以细菌为眼内微生物群的主要组分。图2为不同疾病患者眼内高度富集的细菌种类lefse分析图，如图2所示，不同疾病患者眼中的细菌种类不同。图3为6种疾病的患者的眼中痤疮丙酸杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的相对丰度，图3a所示为6种疾病的患者的眼中痤疮丙酸杆菌的相对丰度，图3b所示为6种疾病的患者的眼中地衣芽孢杆菌的相对丰度，图3c所示为6种疾病的患者的眼中巨大芽孢杆菌的相对丰度。从图3中可以看出，在amd患者的眼中同时含有痤疮丙酸杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，其中痤疮丙酸杆菌的含量最高，地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌的含量比痤疮丙酸杆菌少，但是比其它5种疾病患者眼内的地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌的含量高。

实施例18

试验试剂：实施例1～15制备得到的实时荧光定量pcr试剂盒

检验组织：amd患者的非玻璃膜疣、硬玻璃膜疣和软的玻璃膜疣组织

检验方法：

(1)取患者的非玻璃膜疣、硬玻璃膜疣和软玻璃膜疣组织，提取各组织中的dna：

1)用0.9％氯化钠溶液灌洗患者结膜囊3次；

2)用复方托吡卡胺溶液对患者进行散瞳；

3)将盐酸左氧氟沙星溶液施用于眼睛30秒，对患者眼部进行消毒；

4)将妥布霉素溶液灌注于患者结膜囊3次进行灭菌；

5)取非玻璃膜疣、硬玻璃膜疣和软玻璃膜疣组织，用masterpurecompletednaandrnapurificationkit(epicentre，uk)试剂盒提取非玻璃膜疣、硬玻璃膜疣和软玻璃膜疣组织中的dna，

(2)实时荧光定量pcr方法检测amd患者的非玻璃膜疣、硬玻璃膜疣和软的玻璃膜疣组织中提取得到的dna样本。

试验结果：

结果如图4所示，通过实时荧光定量pcr方法，在amd患者的非玻璃膜疣、硬玻璃膜疣和软的玻璃膜疣组织中共检测到8种细菌，分别为痤疮丙酸杆菌(图4a)，巨大芽孢杆菌(图4b)，罗氏乳酸杆菌(图4c)，恶臭假单胞菌(图4d)，铜绿假单胞菌(图4e)，白叶枯菌(图4f)，地衣芽孢杆菌(图4g)，阴道嗜血杆菌(图4h)，从图4a中可以看出痤疮丙酸杆菌的含量最多，从图4b中可以看出，巨大芽孢杆菌只存在于软性玻璃膜疣中。

实施例19巨大芽孢杆菌体外诱导arpe19细胞补体系统的活化

试验材料：来自美国模式培养物集存库的arpe19细胞

试验菌株：巨大芽孢杆菌、痤疮丙酸杆菌

试验方法：

将人arpe19细胞分两组培养，首先将各组人arpe19细胞均在含有2.5mml-谷氨酰胺和10％fbs的dmem中培养，然后第一组中加入巨大芽孢杆菌，第二组中加入痤疮丙酸杆菌，各组细胞均培养12、24、48小时后，将arpe19细胞与pi和annexcinv-apc(cat#88-8007-72，ebioscience，usa)孵育30分钟。用macsquantanalyzer10流式细胞仪(miltenyibiotec，germany)观察细胞是否死亡。

试验结果：

从图5a中可以看出，随着时间的推移，巨大芽孢杆菌显著增加rpe细胞的凋亡，但是痤疮丙酸杆菌不会随着时间的推移而增加rpe细胞的凋亡；从图5b中可以看出，c5a蛋白的代谢产物证实了补体系统的活化，而且巨大芽孢杆菌和痤疮丙酸杆菌都可以诱导arpe19细胞分泌cfh蛋白，而巨大芽孢杆菌比痤疮丙酸杆菌更强烈的诱导arpe19细胞分泌cfh。从图5c中可以看出，由于巨大芽孢杆菌的体外感染导致的细胞的凋亡，使得rpe细胞分泌活性il-1β和il-18。

结论：

如上所述的结果表明，巨大芽孢杆菌的感染可导致类似于软玻璃膜疣的炎症。

实施例20

试验动物：猕猴

试验菌种：购自benaculturecollection(北京，中国)的巨大芽孢杆菌bncc190686，地衣芽孢杆菌bncc186069，痤疮丙酸杆菌bncc336649

试验方法：

将巨大芽孢杆菌bncc190686，地衣芽孢杆菌bncc186069，痤疮丙酸杆菌bncc336649在37℃琼脂平板上培养过夜，将培养得到的菌落用pbs溶液洗涤并重悬浮为1×10⁶cfu/μl溶液，并进一步在pbs中稀释为注射溶液。

通过肌肉注射盐酸替来他明(2.5mg/kg)和氯沙西坦盐酸盐(2.5mg/kg)的混合液使猕猴镇静，然后用0.5％propacacainehydrochloride进行局部麻醉，立即用光学显微镜观察猕猴的眼睛。然后将瞳孔用0.5％托品酰胺和0.5％去氧肾上腺素扩张，以获得眼底照片。在用5％pvi溶液进行眼表面消毒后，将猕猴分为四组，用1ml注射器和30号针进行玻璃体内注射细菌溶液(体积为50μl的1000cfu)或超声处理灭活的细菌蛋白(来自1000cfu细菌)，第一组猕猴的左眼注射痤疮丙酸杆菌的活菌注射液，右眼注射地衣芽孢杆菌的活菌注射液，第二组猕猴的左眼注射痤疮丙酸杆菌的超声灭活蛋白注射液，右眼注射地衣芽孢杆菌的超声灭活蛋白注射液，第三组猕猴的左眼注射痤疮丙酸杆菌的活菌注射液，右眼注射巨大芽孢杆菌的活菌注射液，第四组猕猴的左眼注射痤疮丙酸杆菌的超声灭活蛋白注射液，右眼注射巨大芽孢杆菌的超声灭活蛋白注射液。

在注射后3天内对所有猕猴进行裂隙灯和眼底检查。眼内炎的严重程度根据先前描述的标准进行判断。将猕猴在接种后3天安乐死，并将两只眼球摘除，用于组织病理学和眼内细胞因子/细菌分析。将眼球在4％多聚甲醛中固定48小时，然后包埋在石蜡中。在切片机上切割成5mm的切片，用苏木精和伊红(h&e)染色。

结果：图6a为第一组和第二组猕猴的眼底照片，图6b为第三组和第四组猕猴的眼底照片，如图6a和6b所示，在注射活菌或者灭活蛋白后3天，第一组、第二组以及第四组猕猴的眼内没有出现炎症，而第三组猕猴的右眼出现严重的炎症。所以，巨大芽孢杆菌活菌会导致猕猴眼内出现严重的炎症，而痤疮丙酸杆菌活菌、痤疮丙酸杆菌超声灭活蛋白、地衣芽孢杆菌活菌，地衣芽孢杆菌超声灭活蛋白以及巨大芽孢杆菌超声灭活蛋白都不会导致猕猴眼睛出现炎症。

序列表

<110>珠海岐微生物科技有限公司

<120>一种老年性黄斑病变的检测与治疗方法

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