本发明属于动物分子育种技术领域，涉及与母猪发情征状相关的snp标记引物对及其应用。
背景技术：
在猪的育种程序中，很少有将母猪的发情征状作为一个育种指标。这导致了母猪产仔数提高的同时其发情征状却越来越不明显，出现更多隐性发情，使得发情鉴定变得非常困难，必须要采用试情公猪反复试情或其他技术手段才能准确地进行发情鉴定，猪场繁殖效率大大下降。
母猪的发情征状具有一定的遗传性。研究发现，国外商业猪种母猪发情征状不如我国地方猪种母猪明显。发情征状在品种间的明显差异说明其存在一定的遗传性，因为不同品种具有不同的遗传背景。rydhmer等(1994)对740头约克夏母猪研究发现：初情期日龄、发情前期时间、发情期持续时间、“静立反射”和外阴发情征状的遗传力分别为0.32、0.23、0.16、0.29和0.24。研究还发现发情征状与窝产仔数之间的遗传相关非常弱，发情征状可以单独作为一个遗传性状来进行选择。母猪初情期的发情征状与第一次断奶后的发情征状存在正相关。
在母猪的发情周期中，发情中期时母猪阴户红肿，并伴有“静立反射”现象，此时，大约处于卵巢排卵前两天，雌激素(estrogen)的水平达到高峰值。研究表明母猪发情期血清中雌激素的浓度与阴户肿胀、阴户颜色、阴道粘膜颜色、黏液稀稠度和静立反射5个发情征状存在显著的相关性。
sult1c3基因是freimuth等人于2004年通过人类基因组的计算分析预测到的，该基因有2个外显子明显重复，命名为外显子7和8，在基因上顺序为7a，8a，7b，8b。目前，对该基因的研究较少，仅仅知道其与原癌基因的活化，雌二醇的降解等相关。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种与母猪发情征状及发情期血清雌激素浓度相关的分子遗传snp标记的应用。
本发明的另一目的是提供该snp标记的引物对。
本发明的又一目的是提供该引物对的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
与母猪发情征状及发情期血清雌激素浓度相关的分子遗传snp标记在筛选发情期高血清雌激素浓度以及发情症状强的白猪、米猪母猪品系中的应用；所述snp标记位于猪3号染色体sult1c3基因的c.-946g>a位点，猪sult1c3基因的ncbi登录号为enssscg00000028691，+1为转录起始位点，c.-946g>a位点位于序列enssscg00000028691中position:47865441处(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝enssscg00000028691)；该c.-946g>a位点的等位基因为g和a，有gg和aa两种基因型，且gg型启动子活性显著高于aa型；所述的snp标记与母猪发情期血清雌激素浓度和发情征状的表现强度显著相关。
一种用于筛选发情期高血清雌激素浓度以及发情症状强的白猪或米猪母猪品系的snp引物对，上游引物为：seqidno：17，下游引物为：seqidno：18。
本发明所述的引物对在筛选发情期高血清雌激素浓度以及发情症状强的白猪、米猪母猪品系中的应用；所述的引物对的上游引物为：seqidno：17，下游引物为：seqidno：18。
一种筛选发情期高血清雌激素浓度以及发情症状强的白猪、米猪母猪品系的方法，包括检测白猪或米猪母猪sult1c3基因的c.-946g>a，位点的基因型，选育该核苷酸位点的aa型个体作为种猪。
有益效果：
通过构建不同缺失片段的表达载体，经双荧光活性检测发现猪sult1c3基因核心启动子区处于-1084至-642之间。为了进一步研究导致sult1c3基因在大白猪与米猪的发情期和间情期差异表达机制，通过测序发现-1084至-642之间存在2个snp位点(c.-994g>a和c.-946g>a)。进一步构建4种不同基因型的表达载体，发现gggg基因型双荧光活性显著高于其他几种基因型，且影响启动子活性的snp位点是基因序列号enssscg00000028691中position:47865441处。ncbi网站基因信息：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝enssscg00000028691
通过rna-seq得出sult1c3基因在间情期大白猪卵泡中高表达，而在发情期米猪卵泡中低表达。sult1c3基因在雌激素代谢通路中主要参与雌二醇的降解，而雌二醇的浓度与发情征状呈正相关。因此，sult1c3基因启动子区c.-946g>asnp位点通过影响rna聚合酶和一些转录因子与启动子的结合，降低sult1c3基因的表达活性，减弱其降解雌二醇的能力，从而使白猪或米猪的发情征状更明显、持续时间更久。该机制可能是导致我国地方品种猪与国外品种猪发情征状差异的部分原因。
附图说明
图1猪sult1c3基因启动子区扩增结果；m:dl5000(5000,3000,2000,1500,1000,750,500,250,100bp)
图2猪sult1c3基因的组织表达谱
图3缺失片段扩增结果；m:dl5000(5000,3000,2000,1500,1000,750,500,250,100bp)
图4不同缺失片段在293t细胞中相对活性
图5不同基因型启动子片段在293t细胞中相对活性
具体实施方式
实施例1
从ncbi网站上下载sult1c3基因及上游3000bp的序列，采用在线引物设计工具primer-blast设计引物，扩增出sult1c3基因启动子区(-2500～+300，+1为转录起始位点)。在上下游引物5'端分别添加sacⅰ和hindⅲ两个限制性内切酶的酶切位点，引物的序列为sult1c3-p1-f/r，详见表1。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。
表1引物信息
表250μl反应体系
pcr扩增的反应程序为：98℃预变性30s；循环扩增阶段：98℃10s变性→64℃30s退火→72℃45s延伸，循环35次；最后在72℃保温7min终末延伸。扩增反应结束后，pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳对5μlpcr扩增产物进行检测，电泳条件为电压130v，时间为20min，在凝胶成像系统中观察条带，条带明亮，位置正确后，将部分pcr产物送至南京擎科生物科技有限公司测序。
利用pcr技术扩增出大白猪sult1c3基因启动子-2405/+261片段，长度为2666bp，+1为转录起始位点，命名为sult1c3-p1。将扩增的2666bp序列与ncbi网站猪sult1c3基因序列比对后相似性达到99％以上，说明扩增的序列正确。
实施例2猪sult1c3基因组织表达谱
利用trizol法提取3头大白猪的卵巢、背最长肌、大脑、肝脏、胃、心肌、回肠和脾脏组织总rna。根据ncbi网站上的sult1c3基因mrna中cds序列采用primer-blast设计引物，引物信息见表1。反转录后荧光定量pcr分析sult1c3基因在各组织的表达情况。结果表明sult1c3基因在卵巢中表达量最高，其次是回肠，在背最长肌、大脑、胃中几乎不表达(图2)。
实施例3质粒构建
根据生物信息学分析结果，以大白猪dna为模板，扩增sult1c3基因启动子区(-2405/+261)，并命名为sult1c3-p1(-2405/+261)，随后对其5’端进行不同长度的缺失，得到sult1c3-p2(-1238/+261)、sult1c3-p3(-1084/+261)、sult1c3-p4(-642/+261)、sult1c3-p5(-424/+261)、sult1c3-p6(-141/+261)片段。引物序列添加sacⅰ和hindⅲ两个限制性内切酶的酶切位点及保护性碱基。具体引物信息见表1。
pcr扩增各个启动子缺失片段，其中p1～p3使用lataqmastermix，p4～p6使用2×taqpcrmix。
表350μl反应体系
扩增反应程序为(p1～p3/p4～p6)：
扩增反应结束后，pcr产物用电泳检测后送至南京擎科生物科技有限公司测序。
将测序结果正确的pcr产物严格按照axygenaxypreptmpcrcleanupkit试剂盒说明书进行纯化。得到sult1c3-p2(-1238/+261)、sult1c3-p3(-1084/+261)、sult1c3-p4(-642/+261)、sult1c3-p5(-424/+261)、sult1c3-p6(-141/+261)片段(图3)。
对扩增的6个启动子缺失片段(p1～p6)进行pcr产物纯化回收，然后与pgl3-basic载体分别进行双酶切，产物纯化后利用t4-dna连接酶连接，转化感受态大肠杆菌，菌液pcr鉴定后送至测序公司测序，最后测序结果正确的对其进行无内毒素质粒提取，并保存于-20℃备用。
实施例4猪sult1c3基因启动子活性检验
当293t细胞在12孔板中生长汇合至75％～80％时，严格按照
严格按照dualluciferasereporterassaysystem(promega)试剂盒的说明书配制反应液，并根据其操作步骤在多功能酶标仪中测定不同表达载体的活性。
使用spss20.0软件分析数据。将阴性对照pgl3-basic的基础活性值定义为1，各表达载体的相对荧光活性值与空载比值作为启动子活性值。使用单因素方差分析不同长度及基因型启动子活性，*p<0.05表示差异显著，**p<0.01表示差异极显著。
将提取的无内毒素质粒和内参质粒prl-tk共转染进293t细胞，培养24小时后收集细胞，测定荧光活性。由图4可知，pgl3-basic活性最低，sult1c3-p1(-2405/+261)、sult1c3-p2(-1238/+261)、sult1c3-p3(-1084/+261)3个缺失片段显著比sult1c3-p4(-642/+261)、sult1c3-p5(-424/+261)、sult1c3-p6(-141/+261)3个缺失片段活性高(p<0.01)。sult1c3-p3(-1084/+261)片段活性最高，sult1c3-p4(-642/+261)活性突然降低，说明-642至-1084之间是核心启动子区，存在调控启动子活性的关键位点，且与预测结果一致。
实施例5
上面的测序结果利用contingexpress、bioedit、chromas、dnaman软件对测序的sult1c3基因启动子区序列进行拼接比对，分析大白猪与米猪有哪些snp位点。拼接后的序列利用promoterscan、neuralnetworkpromoterprediction工具预测核心启动子区，利用cpgislandsearcher预测甲基化位点，利用websignalscanserver、cluster-buster、genomatix工具预测转录因子结合位点。
前面本试验验证得出-642至-1084之间是sult1c3基因启动子核心区，且测序结果显示在该段区域有2个snp位点(c.-994g>a和c.-946g>a)。因此，对现有的大白猪和米猪分型，设计引物，扩增sult1c3-p7(-1100/-661)片段，发现4种基因型(gggg、aaaa、ggaa和gaaa，其中前两个碱基代表c.-994g>a位点处的个体基因型，后两个碱基代表c.-946g>a位点处的个体基因型)。经构建载体、转染293t细胞、双荧光活性检测，发现gggg基因型相对荧光活性显著大于pgl3-basic载体及其他3种基因型荧光活性(p<0.01，图5)。aaaa、ggaa和gaaa3种基因型与pgl3-basic载体之间相对荧光活性差异不显著，且相互之间差异同样不显著。说明影响启动子活性的snp位点是c.-946g>a，且gg型启动子活性显著高于aa型(p<0.01)。
实施例6sult1c3基因在大白猪和米猪的发情期和间情期差异表达
选择体型一致、身体健康、出生日期相似、初情期有记录且即将进入第2次发情期的大白猪和米猪后备母猪进行试验。以评分法(表4)选取并采集发情征状明显(分值为2分)的6头大白猪和5头米猪后备母猪的卵泡组织，置于液氮中用于后续的rna-seq分析。
表4发情征状评分标准表
严格按照
rna-seq结果发现sult1c3基因在4个组中差异表达，结果如下：
表5sult1c3基因在4个组表达量统计
sult1c3(enssscg00000028691)基因在间情期大白猪的卵泡中高表达，而在发情期米猪的卵泡中低表达。另外，经过血清雌激素水平检测结果也说明，sult1c3基因的表达水平与母猪发情期的血清雌激素水平呈负相关。
序列表
<110>南京农业大学
<120>一个与母猪发情征状相关的snp标记检测引物对及其应用
<160>18
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gcccagcaaacacctatcct20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
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<210>3
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
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<210>4
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
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<210>5
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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