本发明涉及生物技术领域的提取方法，具体涉及从牛睾丸中提取透明质酸的方法。
背景技术：
透明质酸(hyaluronicacid，简称ha)，是一种酸性多聚粘多糖，是由n-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通过β-1，4和β-1，3糖苷键反复交替连接而成。由于其独特的保水、润滑等高分子多糖的性质及天然、无过敏和与人体组织良好的生物相容性，被广泛应用于化妆品、保健食品和医药领域。
目前从动物组织中提取透明质酸主要以鸡冠、人脐带、动物眼球等为原料，或者由细菌发酵生产，但是在提取过程中，提取液或者发酵液中菌体和蛋白质等杂质的存在给透明质酸的提取和精制带来极大的困难，同时也降低了透明质酸的品质，限制了其应用范围。目前报道的去除ha提取液或者发酵液中菌体和蛋白质等杂质的方法有季铵盐法、氯仿抽提法、高速离心法、絮凝法和微孔滤膜法。但季铵盐法在沉淀ha的同时容易将蛋白质一起沉淀，降低ha的纯度，且季铵盐用量较大；氯仿抽提法不但操作工艺繁琐，而且对人体和环境会造成损害；由于透明质酸的高粘性，高速离心法难以使菌体与发酵液完全分离，难以应用于工业生产；絮凝法与季铵盐法同样存在生产成本高、杂质去除不彻底的问题；微孔膜孔道直径在压力的不断作用下会变大，无法完全截留发酵液中的菌体和蛋白质。如何有效地去除这些杂质对获得高品质的透明质酸和扩大其应用范围具有重要的意义
水的临界压力及临界温度分别为22.1mpa和374℃，在f>374℃，p>22.1mpa条件下，水的介电常数为5-15。在比374.2℃和22.1mpa稍微低一些的低温压下成液体状态的水称为“亚临界水”。将水加热至沸点以上，临界点以下，并控制系统压力使水保持为液态，这种状态的水被称为亚临界水，在文献中也有称它为超热水和高温水。通常条件下，水是极性化合物。在505kpa压力下，随温度升高(50-300℃)，其介电常数由70减小至1，也就是说其性质由强极性渐变为非极性，可将溶质按极性由高到低萃取出来。在温度和压力都较高的条件下、水的极性降低，可以萃取非极性化合物；温度和压力都较低的条件下，水的极性提高，可以萃取极性化合物。在实际萃取过程中，由于压力对介电常数的影响不如温度的影响大，所以主要通过调节温度来控制水的介电常数。由于是不使用酸、碱和催化剂的水在高热高压下的处理技术，因此亚临界水的提取方法被称之为“绿色的处理法”。此外，提取可以在数秒钟到数分钟的短时间内完成，故而具有可以进行连续处理的优点。亚临界水萃取技术在天然产物领域的活性成分的提取上很有前景。
技术实现要素：
本发明的目的是提供从牛睾丸中提取透明质酸的方法，该方法操作简便，成本低廉，能有效去除蛋白质类杂质，从而提高了透明质酸的品质，并已成功应用于ha的工业化生产中。
本发明通过以下技术方案实现。
从牛睾丸中提取透明质酸的方法，具体包括如下步骤：
1)将新鲜牛睾丸去皮后，切成小片；
2)亚临界水萃取：将处理好的原料置于萃取釜中，加入乙酸钠，将脱氧去离子水注入釜中，萃取温度120-130℃，压力8-10mpa，萃取时间20-30min，对牛睾丸进行萃取，萃取结束，泄压，萃取液流入收集罐中冷却至室温，得到萃取液；
3)抽滤：向上步骤得到的萃取液中加入硅藻土，抽滤，得到滤液；
4)醇沉：将上步得到的滤液加入2倍体积的95％v/v乙醇搅拌均匀，静置使分层，过滤，得到沉淀；
向沉淀中继续加入2倍体积的95％v/v乙醇搅拌均匀，静置使分层，过滤，得到沉淀；
5)干燥：将上步得到沉淀，用丙酮洗涤以脱水，随后置于放有五氧化二磷的真空干燥器中干燥，即得成品。
本发明步骤2)所述的加入乙酸钠，优选加入相当于原料0.010-0.015重量份的乙酸钠。
步骤3)所述的抽滤：优选加入相当于萃取液0.010-0.012重量份的硅藻土，0.1mpa压力抽滤。
步骤5)所述的干燥，优选干燥12-15h。
与现有技术相比，本发明的优点：
1、现有技术中，牛睾丸的提取，主要有以下几种方法：①用乙醇溶液浸泡新鲜牛睾丸至变硬并置于干燥箱中干燥，干燥后将其粉碎.向粉碎的牛睾丸粉末加入数倍的去离子水浸泡，搅拌后静置浸泡过夜；②新鲜牛睾丸投料、加入水，加热到80℃，保温30-60min后用水洗净，冷却后用绞肉机绞碎。以上方法存在一些不足，乙醇提取，时间长；加热水提，成分复杂，后期纯化比较困难。而采用本发明的方法，提取时间短、成分也简单。
2、现有研究表明，通过细菌发酵得到的发酵液中的透明质酸分子在较高的温度下会发生降解，预处理工艺中过滤温度对透明质酸成品的分子量、收率和过滤通量会有所影响。本发明的透明质酸来源于牛睾丸的提取，为了防止透明质酸分子的降解，本发明在进行亚临界水萃取时，在物料中加入一定量的乙酸钠是关键，可以缓解透明质酸多糖链的降解。加入乙酸钠，产品的分子量在190万左右，而不加入乙酸钠，分子量会下降到170万左右。
3、现有技术中，去除多糖溶液中的游离蛋白，会加入体积4:1的氯仿-正丁醇混合溶液进行充分振摇,或经抽滤、离心或分液去除蛋白质,但是这些方法条件温和,但需要反复多次才能除去尽可能多的蛋白质，而本发明方法因为前面采用了亚临界处理，只需要一次该步骤就可以，节省了工时。本发明得到的透明质酸mr大于106，分子量分布指数接近1。
具体实施方式
下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1：
从牛睾丸中提取透明质酸的方法，具体包括如下步骤：
1)将新鲜牛睾丸去皮后，切成小片；
2)亚临界水萃取：将处理好的原料置于萃取釜中，加入相当于原料0.010重量份的乙酸钠，将脱氧去离子水注入釜中，萃取温度120-130℃，压力8-10mpa，萃取时间20min，对牛睾丸进行萃取，萃取结束，泄压，萃取液流入收集罐中冷却至室温，得到萃取液；
3)抽滤：向上步骤得到的萃取液中加入相当于萃取液0.010重量份的硅藻土，0.1mpa压力抽滤，得到滤液；
4)醇沉：将上步得到的滤液加入2倍体积的95％v/v乙醇搅拌均匀，静置使分层，过滤，得到沉淀；
向沉淀中继续加入2倍体积的95％v/v乙醇搅拌均匀，静置使分层，过滤，得到沉淀；
5)干燥：将上步得到沉淀，用丙酮洗涤以脱水，随后置于放有五氧化二磷的真空干燥器中干燥12h，即得成品。
实施例2：
从牛睾丸中提取透明质酸的方法，具体包括如下步骤：
1)将新鲜牛睾丸去皮后，切成小片；
2)亚临界水萃取：将处理好的原料置于萃取釜中，加入相当于原料0.012重量份的乙酸钠，将脱氧去离子水注入釜中，萃取温度120-130℃，压力8-10mpa，萃取时间25min，对牛睾丸进行萃取，萃取结束，泄压，萃取液流入收集罐中冷却至室温，得到萃取液；
3)抽滤：向上步骤得到的萃取液中加入相当于萃取液0.012重量份的硅藻土，0.1mpa压力抽滤，得到滤液；
4)醇沉：将上步得到的滤液加入2倍体积的95％v/v乙醇搅拌均匀，静置使分层，过滤，得到沉淀；
向沉淀中继续加入2倍体积的95％v/v乙醇搅拌均匀，静置使分层，过滤，得到沉淀；
5)干燥：将上步得到沉淀，用丙酮洗涤以脱水，随后置于放有五氧化二磷的真空干燥器中干燥15h，即得成品。
实施例3：
从牛睾丸中提取透明质酸的方法，具体包括如下步骤：
1)将新鲜牛睾丸去皮后，切成小片；
2)亚临界水萃取：将处理好的原料置于萃取釜中，加入相当于原料0.015重量份的乙酸钠，将脱氧去离子水注入釜中，萃取温度120-130℃，压力8-10mpa，萃取时间30min，对牛睾丸进行萃取，萃取结束，泄压，萃取液流入收集罐中冷却至室温，得到萃取液；
3)抽滤：向上步骤得到的萃取液中加入相当于萃取液0.012重量份的硅藻土，0.1mpa压力抽滤，得到滤液；
4)醇沉：将上步得到的滤液加入2倍体积的95％v/v乙醇搅拌均匀，静置使分层，过滤，得到沉淀；
向沉淀中继续加入2倍体积的95％v/v乙醇搅拌均匀，静置使分层，过滤，得到沉淀；
5)干燥：将上步得到沉淀，用丙酮洗涤以脱水，随后置于放有五氧化二磷的真空干燥器中干燥15h，即得成品。
对比例1：
1)将新鲜牛睾丸去皮后，切成小片；
2)亚临界水萃取：将处理好的原料置于萃取釜中，将脱氧去离子水注入釜中，萃取温度120-130℃，压力8-10mpa，萃取时间30min，对牛睾丸进行萃取，萃取结束，泄压，萃取液流入收集罐中冷却至室温，得到萃取液；
3)抽滤：向上步骤得到的萃取液中加入相当于萃取液0.012重量份的硅藻土，0.1mpa压力抽滤，得到滤液；
4)醇沉：将上步得到的滤液加入2倍体积的95％v/v乙醇搅拌均匀，静置使分层，过滤，得到沉淀；
向沉淀中继续加入2倍体积的95％v/v乙醇搅拌均匀，静置使分层，过滤，得到沉淀；
5)干燥：将上步得到沉淀，用丙酮洗涤以脱水，随后置于放有五氧化二磷的真空干燥器中干燥15h，即得成品。
对比例2：
用乙醇溶液浸泡新鲜牛睾丸至变硬并置于干燥箱中干燥，干燥后将其粉碎.向粉碎的牛睾丸粉末加入数倍的去离子水浸泡，搅拌后静置浸泡过夜；滤液加入10％固体氯化钠，加入等体积的氯仿、正丁醇混合液，后续步骤同实施例3。
对比例3：
新鲜牛睾丸投料、加入水，加热到80℃，保温30min后用水洗净，冷却后用绞肉机绞碎，加入丙酮浸泡并搅拌，脱水脱脂，采用胃蛋白酶酶解；后续步骤同实施例3。
实验例
1、葡萄糖醛酸的测定：参照butter-muir法测定，以葡萄糖醛酸为标准。
2、蛋白质含量用lowry法测定，以牛血清白蛋白为标准。
3、mr按中国药典2010年版用ubbelohde法测定。
结果：
采用本发明方法得到的成品透明质酸中葡萄糖醛酸含量达48.09％，蛋白质含量仅为0.01％，分子量为190万，分子量分布指数接近1，明显优于对比例。