一种生产小分子右旋糖酐的方法及其产品和用途与流程

本发明涉及右旋糖酐降解技术领域，尤其涉及一种生产小分子右旋糖酐的方法及其产品和用途。

背景技术：

右旋糖酐为高分子葡萄糖聚合物，平均相对分子质量为几千到几十万道尔顿。小分子右旋糖酐通常指重均分子量为20000da以下的右旋糖酐，具有改善微循环，提高血浆胶体渗透压和渗透性利尿作用。

右旋糖酐铁注射液是目前国内外公认较好的仔猪补铁针剂，通过在仔猪出生后1-4天内一次性肌肉注射1ml铁含量为150g/l的右旋糖酐铁注射液，可满足仔猪整个哺乳期对铁的需要，预防仔猪缺铁性贫血，促进仔猪生长，降低仔猪死亡率。但目前国内生产的右旋糖酐铁注射液的重均分子量均较大，多为7-24kda，这对肌注后机体对药品的吸收极为不利，多造成注射部位有黑色的坏死灶而影响猪的胴体质量。而从欧洲进口的某品牌的右旋糖酐铁注射液的重均分子量为3-6kda，是目前国内外公认的质量较好的右旋糖酐铁注射液。国内厂家主要是采用酸解法对大分子右旋糖酐进行降解，加碱中和后再用乙醇分级沉淀来获得不同分子量的右旋糖酐，其生产成本高、对环境污染大，而且极难得到低分子量右旋糖酐(重均分子量3-6kda)，因而无法给下游生产厂家(即右旋糖酐铁的生产厂家)提供低分子量右旋糖酐产品。

cn101205256a公开了一种通过菌株发酵、膜分离、降解、脱色、膜分离、纯化制得右旋糖酐5的方法。cn102816812a公开了一种低分子量右旋糖酐的一步法发酵生产工艺，将右旋糖酐酶加入发酵液酶解后灭活、膜过滤、脱色和喷雾干燥得到成品。cn105671104a公开了一种固定化右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐的制备方法，将右旋糖酐酶菌液和卡拉胶混合滴加到氯化钙溶液中，制得右旋糖酐酶固定化细胞微球用于右旋糖酐降解，最后用乙醇沉淀分级产品。cn105385721a公开了一种定向发酵生产右旋糖酐的方法，采用定向发酵策略，可以根据需要控制发酵产物的分子量范围，有效降低发酵液的粘度系数，再用超滤、纳滤膜分离直接提取不同分子量规格的右旋糖酐产品。cn102942638a公开了一种利用右旋糖酐酶将重均分子量为7-8kda的右旋糖酐，直接降解到重均分子量为3-6kda的特微分子右旋糖酐的方法。上述专利表明，生物酶解和膜分离相结合是未来小分子右旋糖酐生产的发展方向。但现有酶解生产右旋糖酐的方法都是采用分批酶解的操作，酶解过程不可控，另外由于商品化超滤膜孔径分布范围较宽，造成右旋糖酐产品分子量范围较宽，同时产生大量还原糖副产物，降低产品收率和纯度，给后续的分离纯化带来负担；另外分批酶解存在产物抑制现象，产物浓度难以提高，且右旋糖酐酶无法重复使用，增加生产成本。

因此，如何实现右旋糖酐的同步酶解和分离以及右旋糖酐酶的重复使用，并且改善产品分子量分布、易于连续化和自动化生产已成为目前研究的热点。

技术实现要素：

鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种利用一体式酶膜反应器生产小分子右旋糖酐的方法，通过简单地过滤同时实现酶的可逆固定化和膜孔径分布调控，不仅可以改善小分子右旋糖酐产品的分子量分布，还可以实现酶和超滤膜的重复使用，降低成本，且易于连续化和自动化生产。

第一方面，本发明提供一种生产小分子右旋糖酐的方法，利用右旋糖酐原料在一体式酶膜反应器中进行同步酶解和分离，得到小分子右旋糖酐产品。本发明的小分子右旋糖酐产品指的是重均分子量为3000-20000da的右旋糖酐。

其中，所述一体式酶膜反应器包括吸附有右旋糖酐酶的超滤膜系统。与现有技术中的酶膜反应器不同的是，本发明首次将酶事先固定在超滤膜系统上，酶不仅是反应的催化剂，还起到调控膜孔径分布的作用，从反应开始前就对较大尺寸的膜孔进行了缩小或者堵塞，使得不符合目标分子量的产物难以通过超滤膜，从而保证所得产物的窄分子量分布，而现有技术中未见相关报道。

优选地，所述右旋糖酐酶吸附在所述超滤膜系统的膜表面和/或膜孔内。

优选地，所述超滤膜系统包括卷式超滤膜组件、管式超滤膜组件、平板式超滤膜组件或中空纤维式超滤膜组件中的任意一种或至少两种的组合，其中，典型但非限制性的组合为：卷式超滤膜组件与管式超滤膜组件的组合，平板式超滤膜组件与中空纤维式超滤膜组件的组合，管式超滤膜组件与平板式超滤膜组件的组合，卷式超滤膜组件、管式超滤膜组件与平板式超滤膜组件的组合，卷式超滤膜组件、管式超滤膜组件、平板式超滤膜组件与中空纤维式超滤膜组件的组合。

优选地，所述超滤膜系统的材料包括聚砜、聚醚砜、磺化聚醚砜、聚丙烯腈、聚丙烯或聚偏氟乙烯中的任意一种或至少两种的组合，其中，典型但非限制性的组合为：聚砜与聚醚砜的组合，磺化聚醚砜与聚丙烯腈的组合，聚丙烯与聚偏氟乙烯的组合，聚醚砜与聚偏氟乙烯的组合，聚砜、聚丙烯腈与聚丙烯的组合。

现有的超滤膜截留分子量往往是一个较宽的范围，本发明由于采用将酶事先固定在超滤膜系统上已经起到调控膜孔径分布的作用，因此本发明对超滤膜系统的截留分子量的选择范围增大，对于本发明的反应，根据目标产物的分子量要求，为进一步提高产物分子量的选择性，优选地，所述超滤膜系统的截留分子量为10000-50000da，例如10000da、15000da、20000da、25000da或30000da等，优选20000-30000da。

同理，所述右旋糖酐原料的重均分子量优选为20000-70000da，例如20000da、25000da、30000da、35000da、40000da、45000da、50000da、55000da、60000da、65000da或70000da等，优选30000-50000da。

优选地，所述生产小分子右旋糖酐的方法包括如下步骤：

(1)酶固定化：将右旋糖酐酶溶液加入所述超滤膜系统中进行超滤浓缩，将所述右旋糖酐酶吸附于所述超滤膜系统的膜表面和/或膜孔内，实现酶的固定化，得到所述一体式酶膜反应器；

(2)酶解和分离：在步骤(1)所得一体式酶膜反应器中加入右旋糖酐原料的溶液，进行同步酶解和分离，获得小分子右旋糖酐产品。

优选地，步骤(1)所述右旋糖酐酶溶液中右旋糖酐酶的浓度为0.01-5.0g/l，例如0.01g/l、0.02g/l、0.05g/l、0.1g/l、0.2g/l、0.3g/l、0.4g/l、0.5g/l、0.6g/l、0.7g/l、0.8g/l、0.9g/l、1.0g/l、2.0g/l、3.0g/l、4.0g/l或5.0g/l等，优选0.05-1.0g/l。

优选地，步骤(1)所述右旋糖酐酶溶液的液ph为5-9，例如5、6、7、8或9等，优选6-8；

优选地，步骤(1)所述超滤浓缩的压力为0.1-1.0mpa，例如0.1mpa、0.2mpa、0.3mpa、0.4mpa、0.5mpa、0.6mpa、0.8mpa或1.0mpa等，优选0.4-0.6mpa；

优选地，步骤(1)所述超滤浓缩的温度为20-50℃，例如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或50℃等，优选30-40℃。

本发明通过右旋糖酐酶的浓度配合压力和温度，通过简单的超滤浓缩实现了酶的固定和膜孔径分布调控。

步骤(2)所述右旋糖酐原料的溶液中右旋糖酐原料的浓度为10-100g/l，例如10g/l、30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l或100g/l等，优选40-60g/l。

优选地，步骤(2)所述右旋糖酐原料的溶液的ph为5.5-7.5，例如5.5、5.6、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.5、7、7.2或7.5等，优选5.8～6.2。

压力过小则反应时间延长降低产物纯度，压力过大则原料易形成滤饼堵塞超滤膜的孔道，不利于优化产物的分子量分布，优选地，步骤(2)所述进行同步酶解和分离的压力为0.1-0.6mpa，例如0.1mpa、0.2mpa、0.3mpa、0.4mpa、0.5mpa或0.6mpa等，优选0.3-0.5mpa。

优选地，步骤(2)所述进行同步酶解和分离的温度为20-50℃，例如20℃、22℃、25℃、30℃、33℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、48℃或50℃等，优选33-40℃。

本发明优化右旋糖酐原料的浓度与反应的压力、温度，充分发挥膜面剪切力的作用，进一步优化小分子右旋糖酐的分子量分布。

优选地，所述进行同步酶解和分离之后还包括：将所述超滤膜系统再生后继续用于生产小分子右旋糖酐。

优选地，所述将所述超滤膜系统再生具体包括：采用化学清洗剂对所述超滤膜系统进行清洗。

优选地，所述化学清洗剂包括氢氧化钠溶液和柠檬酸溶液。

优选地，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1-1.0wt％，例如0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.45wt％、0.5wt％、0.55wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％或1.0wt％等，优选0.4-0.6wt％。

优选地，所述柠檬酸溶液的浓度为0.2-3.0wt％，例如0.2wt％、0.3wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.8wt％、1.0wt％、1.2wt％、1.5wt％、1.8wt％、2.0wt％、2.2wt％、2.5wt％、2.8wt％或3.0wt％等，优选0.5-1.5wt％。

优选地，所述清洗的温度为20-40℃，例如20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、38℃或40℃等，优选30-35℃。

作为本发明优选的技术方案，所述生产小分子右旋糖酐的方法包括如下步骤：

(1)酶固定化：将ph为5-9、浓度为0.01-5.0g/l的右旋糖酐酶溶液加入所述超滤膜系统中，0.1-1.0mpa、20-50℃下进行超滤浓缩，将所述右旋糖酐酶吸附于所述超滤膜系统的膜表面和/或膜孔内，实现酶的固定化，得到所述一体式酶膜反应器；

(2)酶解和分离：在步骤(1)所得一体式酶膜反应器中加入ph为5.5-7.5、浓度为10-100g/l的右旋糖酐原料的溶液，0.1-0.6mpa、20-50℃下进行同步酶解和分离，获得小分子右旋糖酐产品；

(3)超滤膜系统再生：采用氢氧化钠溶液和柠檬酸溶液依次对所述超滤膜系统在20-40℃下进行清洗，所得再生的所述超滤膜系统继续用于步骤(1)。

第二方面，本发明提供一种利用如第一方面所述生产小分子右旋糖酐的方法生产的小分子右旋糖酐产品。

第三方面，本发明提供如第二方面所述小分子右旋糖酐产品的用途，所述小分子右旋糖酐产品用于仔猪补铁针剂、血浆代用品和血容量扩充药。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

1.本发明首次将酶事先固定在超滤膜系统上，酶不仅是反应的催化剂，还起到调控膜孔径分布的作用，不仅提高了酶的稳定性和重复实用性，降低了生产成本，而且通过酶固定化缩小了超滤膜的孔径分布，使获得的小分子右旋糖酐产品分子量更均一；本发明酶的固定和膜孔径分布调控可通过简单的超滤浓缩实现；由此，本发明实现了利用一体式酶膜反应器进行右旋糖酐酶解和分离，相较于现有技术中分批酶解-灭活-超滤膜分离的方法，其产率提高10％以上，右旋糖酐酶使用量减少60％以上，产品纯度提高20％以上；

2.本发明利用酶膜反应器生产右旋糖酐，通过同步酶解和分离避免了目标酶解产物在反应器内的进一步降解并且减缓了产物抑制现象，同时超滤的浓缩功能可提高底物浓度，进一步提高了产品的产率和纯度；

3.本发明采用的酶固定化原理是物理吸附和机械堵塞，可通过简单的化学清洗将失去酶活的超滤膜再生，实现超滤膜的重复使用；

4.本发明提供的右旋糖酐生产方法具有操作简单安全、无化学添加剂、易于连续化和自动化生产的优点。

附图说明

图1是本发明实施例1生产小分子右旋糖酐的方法示意图；

图2是本发明实施例1中酶固定在超滤膜系统上的示意图；

图3是本发明实施例1中分体式酶膜反应器生产小分子右旋糖酐的示意图；

图2-3中标记示意为：1、5：右旋糖酐原料；2、6：右旋糖酐酶；3、7：超滤膜；4、8：小分子右旋糖酐产物

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。但下述的实施例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

实施例1

一种生产小分子右旋糖酐的方法，如图1所示，具体步骤如下：

(1)将ph＝5、浓度为0.01g/l的右旋糖酐酶溶液加入截留分子量为10000da的聚丙烯腈卷式超滤膜系统中，在操作压力1.0mpa、温度30℃下进行过滤浓缩处理，如图2所示，使得右旋糖酐酶2完全吸附在超滤膜3的表面或膜孔内；得到酶膜反应器；

(2)在步骤(1)所得酶膜反应器中加入ph＝5.5、浓度为100g/l、重均分子量为20000da的右旋糖酐原料1的溶液，在操作压力为0.6mpa，温度为50℃下进行过滤，收集透过液中的小分子右旋糖酐产物4，测得其平均分子量为4500da，分子量分布宽度指数为1.8。而在同样条件下，采用分体式酶膜反应器，如图3所示，右旋糖酐酶6没有起到调控膜孔径的作用，右旋糖酐原料5酶解后通过超滤膜7后获得小分子右旋糖酐产物8，其平均分子量为5600da，分子量分布宽度指数为2.8，与小分子右旋糖酐产物4相比，分子量分布宽度指数增加，平均分子量增大。

(3)待膜通量或产率下降50％以上，将超滤系统内的料液顶出，加入0.1％的氢氧化钠溶液在40℃下清洗1小时，将超滤膜系统冲洗干净后再加入0.2％的柠檬酸清洗1小时，然后重新进行右旋糖酐酶的固定化和酶解分离。与传统的分批酶解-灭活-超滤膜分离的方法相比，实施例1进行右旋糖酐酶解和分离获得的产率提高20％，右旋糖酐酶使用量减少60％，产品纯度提高30％。

实施例2

一种生产小分子右旋糖酐的方法，步骤如下：

(1)将ph＝7、浓度为0.1g/l的右旋糖酐酶溶液加入截留分子量为30000da的聚醚砜管式超滤膜系统中，在操作压力0.4mpa，温度20℃下进行过滤浓缩处理，使得右旋糖酐酶完全吸附在超滤膜表面或膜孔内，得到酶膜反应器；

(2)在步骤(1)所得酶膜反应器中加入ph＝6、浓度为50g/l、重均分子量为40000da的右旋糖酐溶液，在操作压力为0.4mpa，温度为37℃下进行过滤，收集透过液中的小分子右旋糖酐产物，测得其平均分子量为5100da，分子量分布宽度指数为1.8。而在同样条件下，采用分体式酶膜反应器获得右旋糖酐平均分子量为7600da，分子量分布宽度指数为2.5；

(3)待膜通量或产率下降50％以上，将超滤系统内的料液顶出，加入0.5％的氢氧化钠溶液在35℃下清洗1小时，将超滤膜系统冲洗干净后再加入1％的柠檬酸清洗1小时，然后重新进行右旋糖酐酶的固定化和酶解分离。与传统的分批酶解-灭活-超滤膜分离的方法相比，实施例2所采用的一体式酶膜反应器进行右旋糖酐酶解和分离获得的产率提高40％，右旋糖酐酶使用量减少70％，产品纯度提高50％。

实施例3

一种生产小分子右旋糖酐的方法，步骤如下：

(1)首先将ph＝9、浓度为1g/l的右旋糖酐酶溶液加入截留分子量为50000da的聚砜平板超滤膜系统中，在操作压力0.1mpa、温度50℃下进行过滤浓缩处理，使得右旋糖酐酶完全吸附在超滤膜表面或膜孔内，得到酶膜反应器；

(2)在步骤(1)所得酶膜反应器中加入ph＝7.5、浓度为10g/l、重均分子量为70000da的右旋糖酐溶液，在操作压力为0.1mpa，温度为20℃下进行过滤，收集透过液中的小分子右旋糖酐产物，测得其平均分子量为7000da，分子量分布宽度指数为1.8。而在同样条件下，采用分体式酶膜反应器获得右旋糖酐平均分子量为10000da，分子量分布宽度指数为3.0；

(3)待膜通量或产率下降50％以上，将超滤系统内的料液顶出，加入1％的氢氧化钠溶液在30℃下清洗1小时，将超滤膜系统冲洗干净后再加入3％的柠檬酸清洗1小时，然后重新进行右旋糖酐酶的固定化和酶解分离。与传统的分批酶解-灭活-超滤膜分离的方法相比，实施例3所采用一体式酶膜反应器进行右旋糖酐酶解和分离获得的产率提高10％，右旋糖酐酶使用量减少60％，产品纯度提高20％。

对比例1

与实施例2相比，除没有酶固定化步骤以外，其它与实施例2相同，具体步骤为：

首先将ph＝6、浓度为50g/l、重均分子量为40000da的右旋糖酐溶液加入截留分子量为30000da的聚醚砜管式超滤膜系统中，启动超滤系统后再加入浓度为0.1g/l的右旋糖酐酶，在操作压力为0.4mpa，温度为37℃下进行过滤，收集透过液中的小分子右旋糖酐产物，测得其平均分子量为7600da，分子量分布宽度指数为2.5。待膜通量或产率下降50％以上，将超滤系统内的料液顶出，加入0.5％的氢氧化钠溶液在35℃下清洗1小时，将超滤膜系统冲洗干净后再加入1％的柠檬酸清洗1小时，然后重新进行右旋糖酐的酶解和分离。

对比例1与实施例2相比，小分子右旋糖酐产物的平均分子量增大49％，分子量分布宽度指数增加39％，右旋糖酐酶用量增加30％，产品纯度下降10％。经对比可以看出，本发明通过简单的过滤使酶分子吸附和堵塞在膜表面和较大的膜孔内，同时实现酶的固定化和膜孔径分布调控，构成一体式酶膜反应器对右旋糖酐进行同步酶解和分离，从而降低小分子右旋糖酐产品的分子量分布，减少了右旋糖酐酶用量，提高目标产品的纯度和产率，大幅降低小分子右旋糖酐的生产成本。

实施例4

与实施例2的区别仅在于：步骤(1)右旋糖酐酶的浓度降低到0.005g/l。

与实施例2相比，小分子右旋糖酐产物的平均分子量增大10％，分子量分布宽度指数增加10％，产品纯度下降5％。

实施例5

与实施例2的区别仅在于：步骤(1)右旋糖酐酶的浓度增加到10.0g/l。

与实施例2相比，小分子右旋糖酐产物的平均分子量减少50％，分子量分布宽度指数增加5％，右旋糖酐酶用量增加5％，产品纯度下降10％。

实施例6

与实施例2的区别仅在于：步骤(1)超滤浓缩的压力减小到0.5mpa。

与实施例2相比，小分子右旋糖酐产物的平均分子量增大10％，分子量分布宽度指数增加10％，右旋糖酐酶用量增加15％，产品纯度下降5％。

实施例7

与实施例2的区别仅在于：步骤(1)超滤浓缩的压力增大到1.5mpa。

与实施例2相比，小分子右旋糖酐产物的平均分子量减少10％，分子量分布宽度指数增加5％，产品纯度下降20％。

实施例8

与实施例2的区别仅在于：步骤(1)超滤浓缩的温度降低到10℃。

与实施例2相比，小分子右旋糖酐产物的平均分子量增大10％，分子量分布宽度指数增加10％，右旋糖酐酶用量增加5％，产品纯度下降5％。

实施例9

与实施例2的区别仅在于：步骤(1)超滤浓缩的温度增加到50℃。

与实施例2相比，小分子右旋糖酐产物的平均分子量减少10％，分子量分布宽度指数增加10％，右旋糖酐酶用量增加25％，产品纯度下降5％。

对照实施例2与实施例4～9可知，本发明通过旋糖酐酶的浓度配合压力和温度，通过简单的超滤浓缩实现了酶的固定和膜孔径分布调控。当用简单的超滤浓缩的方法实现酶的固定时，酶的浓度、操作压力和温度之间存在协同关系，三者在本发明所述优选范围内互相配合，可以优化酶的固定和膜孔径分布调控，进一步增加酶的稳定性并降低分子量分布宽度指数，进一步提高产物纯度和产率。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。