本发明涉及dna探针合成技术领域，具体为一种新型的y-str基因座检测用dna探针合成方法。
背景技术：
短串联重复序列(简称str)也称微卫星,是一类广泛存在于原核及真核生物基因组中的核苷酸重复序列。其一般由2一6个核苷酸为重复单元组成的几十至一百多个的核酸重复序列,不同数目的核心序列呈串联重复排列,而长度呈现多态性。str基因座数量大,分部广泛,约占整个基因组的3％,而且多态性高,其多态性主要源自核心序列重复次数在个体间的差异,并且这种差异在遗传过程中遵循孟德尔遗传规律。因此,人们可以根据两端保守性序列,设计引物和dna探针,进行str扩增,然后通过聚丙烯酞胺、琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等检测遗传标记的多态性。这种str扩增检测技术被广泛用于个体识别、亲缘鉴定和群体遗传学研究；
因其多态性好、识别能力强、灵敏度高、易于自动化等特点,目前str扩增检测技术已经迅速成为法医dna鉴定中个体识别和亲子鉴定的主要技术手段,在世界各地的dna实验室得到广泛应用,并取得了令人瞩目的成果。在案件分析中，为案件侦破提供有力的证据。国内最著名的案例就是2016年通过“y-str检测技术”对犯罪嫌疑人高承勇进行初步判定，然后经过指纹和dna比对最终确定，甘肃白银案告破。
近年来，随着y-strdna检测技术作为法医鉴定的主要技术手段，其应用也越来越广泛。与此同时，用户针对y-str检测试剂盒的灵敏度、准确度和均衡性等性能指标提出了更高的要求。而y-str检测试剂盒的灵敏度、准确度和均衡性等试剂的均与关键原料dna探针质量有关。因此，解决dna探针合成质量问题，即可大幅提升y-str检测试剂盒的灵敏度、准确度和均衡性等性能指标。
dna探针的合成是一个化学合成过程。传统的dna探针合成主要是采用固相亚磷酰胺三酯法，先合成dna探针的寡聚核苷酸序列骨架，然后再在序列骨架的两端通过亚磷酰胺法连接荧光基因等化学修饰基团。但是，该合成方法却存在着非常大的问题，就是利用该方法合成出来的dna探针荧光强度低，荧光标记基团容易脱落，造成检测灵敏度不高，检测结果不稳定等问题。特别是y-str检测用的dna测序仪采用的是单一激光，波长为488nm，然而大部分的荧光标记基团激发波长却分布在500nm到650nm之间，因此在测序仪的488nm激光波长下，这些dna探针没有没完全地激发,从而造成荧光强度不够。同时，传统方法合成的dna探针是先连接荧光修饰基团后再进行氨解去除保护基团，在经过经过氨解反应的高温高压浓氨环境时，荧光修饰基团在此过程中非常容易从序列骨架上脱落，造成dna探针的不可使用。而国外dna探针合成公司采用的是具有专利保护的liz等荧光基团，可以避免上述问题，然而由于专利保护，这些荧光基团单体在国外售价极其昂贵，不利于大规模应用于dna探针的合成，从而制约了y-str检测试剂盒的国产化和推广应用。目前在国外特殊荧光标记基团受专利保护的情况下，急需一种全新的更加高效的能提高荧光强度和避免荧光脱落的dna探针合成方法，来解决上述问题。
技术实现要素：
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种新型的y-str基因座检测用dna探针合成方法，解决了在国外具有专利保护的荧光基团单体在国外售价极其昂贵，不利于大规模应用于dna探针的合成，从而制约了y-str检测试剂盒的国产化和推广应用问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种新型的y-str基因座检测用dna探针合成方法。
目前常见的y-str扩增体系为六色扩增体系,本发明所用荧光标记基团有fam、hex、tamra、rox、620、657等，及其光谱波长分析图如下图1；
一种新型的y-str基因座检测用dna探针合成方法，包括以下步骤：
(1)针对y-str基因座dys481，设计一条28个碱基的寡聚核苷酸序列5`-ttaatacaacaaaaatttggtaatctg-3`，然后设计该序列中间需要修饰荧光基团的碱基位；所述序列中间修饰荧光基团的碱基位的设计表如下；
(2)寡聚核苷酸序列的合成：合成方法为固相亚磷酰胺三酯法，具体过程为：在固相载体上完成dna链的合成，合成的方向是由待合成引物的3`端向5`端合成的，相邻的核苷酸通过3`→5`磷酸二酯键连接进行连接，将步骤(1)中设计的寡聚核苷酸序列输入自动化dna合成仪进行自动合成，其中在对应的修饰碱基位上，通过固相亚磷酸胺法将amino-modifierserinolphosphoramidite连接到对该碱基位的单体上，分别合成6条同样的序列的寡聚核苷酸；
(3)序列5`端的speciallinker制备：设计5`端c链结构，并通过亚磷酸胺法，重复地连接相应链长的thiol-modifierc6s-sphosphoramidite和5’c6-nh2-tfa，以得到对应链长的c链，其中c链长度及对应speciallinker合成方案如下；
(4)上述合成结束后，对完成合成的寡聚核苷酸进行气相氨解去除保护基团，并进行脱盐纯化回收；
(5)经测量回收产物浓度后，分别取每一条寡聚核苷酸的20nmol量进行干燥，干燥后再用ph7.8的缓冲液进行溶解；
(6)荧光标记基团原料的溶解：
按0.06m的浓度溶解原料，溶剂为无水的can；
(7)取适量的活化脂原料粉末(按1/3mg每条引物)充分溶解于每条寡聚核苷酸105ul的fam原料溶液中，并在37℃下振荡混匀，以使fam荧光基团原料充分活化；
(8)之后将上述活化好的荧光原料加入之前溶解好的寡聚核苷酸中，并将反应容器密封，在37℃温度下震荡培养120s，最终将fam连接到寡聚核苷酸中间碱基和5`末端的-nh2上，最终合成如下序列结构；
(9)反应结束后，进行hplc纯化回收，并测量浓度；
(10)分别取同样量的dna探针，使用光谱分析仪对每一条dna探针进行光谱分析。
本发明提案的技术原理为：
一是根据荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,fret)技术原理，两个荧光发色基团在达到足够的距离时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高电子能态，通过偶极子相互作用，将供体激发态能量到受体激发态的过程，使受体可以发射更强于本身的特征荧光。简单地讲，在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团(供体)的发射光谱与另一个基团(受体)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象,即前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光，且荧光强度远强于这后一个基团本身的荧光强度。其荧光标记基团必须满足以下两个条件：①、受、供体的激发光要足够分得开；②、供体的发光光谱与受体的激发光光谱要重叠。利用此原理，可使合成的dna探针荧光强度提高近10倍。
二是利用活化脂(nhsester)原料活化荧光基团上的羟基，使其与-nh2基团之间化学反应，从而将荧光标记的功能基团连接到一段带有-nh2活性基团的寡核苷酸序列上的原理。即先合成寡核苷酸序列骨架，之后在需要修饰的碱基位或c链上通过亚磷酰胺法连接一个-nh2基团，经过解氨纯化回收后，再将活化脂活荧光基团，并与寡核苷酸序列上的-nh2基团，最终得到带有荧光基团的dna探针。该方法与传统的荧光基团先连接寡核苷酸序列后氨解的技术工艺相比，不仅提高了荧光基团的连接效率，dna探针结构更为稳定，还避免传统合成方法合成氨解过程的tca(三氯乙酸)、高温高浓度氨的影响，从而避免了荧光基团的脱落。
(三)有益效果
本发明提供了序列5`端的speciallinker制备方法及结构式，采用先合成寡聚核苷酸序列和linker制备，后氨解纯化，最后进行荧光基团修饰连接的工艺方法，突破的y-strdna检测试剂盒dna探针合成关键技术问题，提高dna探针的荧光强度8-10倍，从而使y-strdna检测试剂盒成本更低、荧光均衡性更优、检测灵敏度和准确性更高。
附图说明
图1为六色荧光标记基团光谱波长分析图；
图2为amino-modifierserinolphosphoramidite结构式；
图3为thiol-modifierc6s-sphosphoramidite结构式；
图4为5’c6-nh2-tfa结构式；
图5为五种链长c链对应的dna探针结构式；
图6为光谱分析--dna探针荧光强度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种新型的y-str基因座检测用dna探针合成方法，包括以下步骤：
(1)针对y-str基因座dys481，设计一条28个碱基的寡聚核苷酸序列5`-ttaatacaacaaaaatttggtaatctg-3`，然后设计该序列中间需要修饰荧光基团的碱基位；所述序列中间修饰荧光基团的碱基位的设计表如下；
(2)寡聚核苷酸序列的合成：合成方法为固相亚磷酰胺三酯法，具体过程为：在固相载体上完成dna链的合成，合成的方向是由待合成引物的3`端向5`端合成的，相邻的核苷酸通过3`→5`磷酸二酯键连接进行连接，将步骤(1)中设计的寡聚核苷酸序列输入自动化dna合成仪进行自动合成，其中在对应的修饰碱基位上，通过固相亚磷酸胺法将amino-modifierserinolphosphoramidite连接到对该碱基位的单体上，分别合成6条同样的序列的寡聚核苷酸；amino-modifierserinolphosphoramidite的结构式如图2所述；
(3)序列5`端的speciallinker制备：设计5`端c链结构，并通过亚磷酸胺法，重复地连接相应链长的thiol-modifierc6s-sphosphoramidite和5’c6-nh2-tfa，以得到对应链长的c链，其中c链长度及对应speciallinker合成方案如下；
其中5’c6-nh2-tfa结构式如图4所述；
thiol-modifierc6s-sphosphoramidite结构式如图3所述；
(4)上述合成结束后，对完成合成的寡聚核苷酸进行气相氨解去除保护基团，并进行脱盐纯化回收；
(5)经测量回收产物浓度后，分别取每一条寡聚核苷酸的20nmol量进行干燥，干燥后再用ph7.8的缓冲液进行溶解；
(6)荧光标记基团原料的溶解：
按0.06m的浓度溶解原料，溶剂为无水的can；
(7)取适量的活化脂原料粉末(按1/3mg每条引物)充分溶解于每条寡聚核苷酸105ul的fam原料溶液中，并在37℃下振荡混匀，以使fam荧光基团原料充分活化；
(8)之后将上述活化好的荧光原料加入之前溶解好的寡聚核苷酸中，并将反应容器密封，在37℃温度下震荡培养120s，最终将fam连接到寡聚核苷酸中间碱基和5`末端的-nh2上，最终合成如下序列结构；
其中五种链长c链对应的dna探针结构式如图5所述；
(9)反应结束后，进行hplc纯化回收，并测量浓度；
(10)分别取同样量的dna探针，使用光谱分析仪对每一条dna探针进行光谱分析，其光谱分析结果如图6；
从以上光谱检测结果可以看出，当在序列5`端向3`端方向的第六个碱基连接荧光标记基团的同时，5`端speciallinker的c链长度达到c24的情况下，其结构可以使用5`端的荧光强度达到最强。即可说明该发明可实现有效增益。
因此，上述提到的先合成寡核苷酸序列骨架，然后再制备5`端c链长度长度达到c24的speciallinker,之后在需要修饰的第六个碱基位或5`端c链上通过亚磷酰胺法连接一个-nh2基团，经过解氨纯化回收后，再将活化脂活化荧光基团后与寡核苷酸序列上的-nh2基团，最终得到带有荧光基团的dna探针，该合成方法可以有效合成dna探针的同时，还大大地提高了dna探针的荧光强度，为一般直接合成法合成的探针的10倍左右。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。