本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，涉及一种基于一步法荧光定量巢式rt-pcr检测寨卡病毒的引物组及试剂盒。
背景技术：
：寨卡病毒(zikavirus，zikv)于1947年通过黄热病监测网络在乌干达寨卡丛林的恒河猴样本中被首次鉴定，其名称也来源于此，并于1952年在乌干达和坦桑尼亚被报道可感染人类。zikv在分类上属于黄病毒科(flaviviridae)黄病毒属(flavivirus)，为单股正链rna病毒，其基因组全长约10.8kb。zikv粒子呈球形，直径约40～70nm。zikv基因组编码一个单一的开放阅读框(openreadingframe)，编码一个多聚蛋白，在翻译后被切割成不同的功能蛋白，包括3个结构蛋白(c、prm/m、e))和7个非结构蛋白(ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b、ns5)。遗传进化分析显示，zikv主要分成非洲型和亚洲型两个谱系，近几年在人际间流行传播的都是亚洲型。zikv主要通过伊蚊(包括埃及伊蚊和白纹伊蚊)进行传播，最新研究显示zikv也可以通过母婴传播、血液传播和性传播，进一步增加了zikv传播和流行的风险。大部分情况下zikv感染不会表现出临床症状，只有约20％的zikv感染者会表现出较轻症状，包括斑丘疹、结膜炎、轻度发热、头痛和关节痛等症状，临床症状与登革病毒感染引起的症状难以区分。引人关注的是，zikv感染能够引起胎儿小头症(microcephaly)，严重危害生育健康。大量研究表明，zikv感染是成人格林-巴利综合征(guillain-barrésyndrome，gbs)的一个诱发因子。另外zikv可在人类感染者的精液中被检测到，而在小鼠模型中可导致雄性不育和严重的睾丸损伤。建立快速、准确和方便的检测方法是监测和防控zikv的必要工具和前提。发明人前期的专利(cn105861753)公开了一种检测寨卡病毒的巢式rt-pcr方法、引物及试剂盒，需要分两次进行巢式rt-pcr，不仅步骤繁琐，而且容易造成样品污染，且检测灵敏度有待提高。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有寨卡病毒的巢式rt-pcr存在的缺陷和不足。建立了寨卡病毒的一步法荧光定量巢式rt-pcr检测方法，为快速灵敏地检测zikv提供了技术手段，对目前寨卡病毒的临床快速诊断和公共防控都具有重要意义。本发明的第一个目的是提供一种基于一步法荧光定量巢式rt-pcr检测寨卡病毒的引物组。本发明的第二个目的是提供一种检测寨卡病毒的试剂盒。本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种基于一步法荧光定量巢式rt-pcr检测寨卡病毒的引物组，包括一对外部引物zikv/1st和一对内部引物zikv/2nd，所述外部引物的上下游序列如seqidno：1～2所示，所述内部引物的上下游序列如seqidno：3～4所示。zikv/1st/f：5’-acttgaytgtgaaccraggacaggccttgacttttcagat-3’(seqidno：1)zikv/1st/r：5’-caagytccarcatcatcttdgagttctcagtgctttcagt-3’(seqidno：2)zikv/2st/f：5’-gacatyccattrccttggca-3’(seqidno：3)zikv/2st/r：5’-tgyacctccactgtgact-3’(seqidno：4)本发明是利用genbank中现有的所有zikv全长基因组序列进行多序列比对，选择zikv包膜蛋白(envelopeprotein)的保守区域(seqidno：5所示序列)设计了多对引物，最终筛选到了本发明上述seqidno：1～4所示的最佳引物组，所述引物组可以在一个反应体系中完成一步法荧光定量巢式rt-pcr。优选地，本发明外部引物zikv/1st上下游引物的工作浓度均为15nm，内部引物zikv/2nd上下游引物的工作浓度均为240nm，外套引物和内套引物的工作浓度比例为1:16。同时，本发明还保护上述引物组在检测寨卡病毒和/或制备寨卡病毒检测试剂盒中的应用。一种检测寨卡病毒的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述引物组。优选地，所述还包含一步法荧光定量巢式rt-pcr所需扩增试剂，阳性对照和阴性对照。更优选地，所述一步法荧光定量巢式rt-pcr所需扩增试剂为2×onestepsybrrt-pcrbuffer4，extaqhsmix，primescriptplusrtasemix及50×roxreferencedyeordyeii。优选地，所述试剂盒中的外部引物zikv/1st的工作浓度为15nm，内部引物zikv/2nd的工作浓度为240nm。优选地，所述试剂盒还包含rna提取所需试剂。优选地，所述试剂盒一步法荧光定量巢式rt-pcr的反应体系为：2×onestepsybrrt-pcrbuffer412.5μl，extaqhsmix1.5μl，primescriptplusrtasemix0.5μl，1μm外部上下游引物各0.375μl，10μm内部上下游引物各0.6μl，50×roxreferencedyeordyeii0.6μl，总rna5μl，rnasefreedh2o2.95μl，共25μl。优选地，所述试剂盒一步法荧光定量巢式rt-pcr的反应程序为：42℃逆转录10min；95℃预变性2min；95℃15sec，65℃15sec，72℃35sec，15个循环；95℃15sec，48℃15sec，72℃30sec，40个循环。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明设计的zikv一步法荧光定量巢式rt-pcr引物引物特异性好、灵敏度高其重复性好，设计的一步法荧光定量巢式rt-pcr检测方法可灵敏、准确、稳定和快速的检测寨卡病毒的存在，可以检测到的最低浓度是6.4×10-1tcid50/ml的病毒。为快速灵敏地检测zikv提供了技术手段，对目前寨卡病毒的临床快速诊断和公共防控都具有重要意义。附图说明图1为一步法荧光定量巢式rt-pcr特异性试验。红色融解曲线分别代表5株zikv；黑色融解曲线分别代表4株登革病毒、1株黄病毒和1株甲型流感病毒h5n6；蓝色融解曲线代表阴性对照。图2为一步法荧光定量巢式rt-pcr灵敏度试验。a：扩增曲线；b：融解曲线。红色代表不同稀释度的rna，蓝色代表阴性对照。图3为一步法荧光定量巢式rt-pcr标准曲线。a：扩增曲线，每个稀释度的rna重复3次；b：融解曲线；c：标准曲线。图4为一步法荧光定量巢式rt-pcr检测临床样本。a：扩增曲线；b：融解曲线；红色表示阳性样本，黑色表示阴性样本，蓝色表示阴性对照。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。zikvsmgc-1和zikvcas01为本实验室从输入性zikv感染者的血清中分离得到，在c6/36细胞中进行病毒培养繁殖，用vero细胞测定病毒滴度tcid50，本次实验中所用到zikvsmgc-1的滴度为6.4×107tcid50/ml。病毒繁殖和滴度测定时培养液中的血清浓度为2％。zikvmr_766和zikvprvabc59来自于中国科学院梁米芳教授实验室，zikvplcal_zv来自于garykobinger教授(universityoflavalandpublichealthagencyofcanada)。黄病毒(yfvbj01)和流感病毒h5n6a/shenzhen/th002由本实验室分离保存。4种登革病毒(1～4型)来自于军事医学科学院秦城峰教授实验室。rna提取试剂盒为qiaampviralrnaminikit(codeno.52906)，购自qiagen；onestepprimescripttmplusrt-pcrkit(codeno.rr096a)购自takara；实时荧光定量pcr仪为viiatm7real-timepcrsystem(appliedbiosystems)。实施例1引物的设计与合成利用genbank中现有的所有zikv全长基因组序列进行多序列比对，选择zikv包膜蛋白(envelopeprotein)的保守区域(575bp，seqidno：5)设计引物(表1)，引物由上海生工合成；表1一步法荧光定量巢式rt-pcr检测特异性引物引物序列中的m代表a或c，r代表a或g，y代表c或t，s代表c或g实施例2病毒rna提取及一步法荧光定量巢式rt-pcr病毒rna提取过程照qiaampviralrnaminikit说明书进行。以实施例1中的引物组进行一步法荧光定量巢式rt-pcr，反应体系如下：反应条件为：42℃10min逆转录，95℃2min预变性，外套pcr(95℃15sec，65℃15sec，72℃35sec)×15个循环，内套pcr(95℃15sec，48℃15sec，72℃30sec)×40个循环，融解曲线分析。实施例3一步法荧光定量巢式rt-pcr特异性试验选择4株zikv(均为亚洲株)、1株zikvmr_766(非洲株)、4株登革病毒(1～4型各1株)、1株黄病毒和1株甲型流感病毒h5n6细胞培养上清，提取rna进行一步法荧光定量巢式rt-pcr特异性试验，各取1μl总rna作为模板进行反应，以无核酸酶dh2o作为阴性对照；反应体系及反应条件与上述实施例2相同。结果如图1所示，5株zikv均可以被特异性地扩增，而4株登革病毒、黄病毒和甲型流感病毒h5n6均不会被扩增，说明本发明中所涉及的zikv一步法荧光定量巢式rt-pcr引物具有良好的扩增特异性。实施例4一步法荧光定量巢式rt-pcr灵敏性试验将zikvsmgc-1毒株细胞培养上清(病毒滴度为6.4×107tcid50/ml)140μl用于提取总rna，50μl无核酸酶dh2o溶解，并进行10倍稀释，使其浓度为6.4×105～6.4×10-2tcid50/ml，结果如图2和表2所示，本发明所设计的一步法荧光定量巢式rt-pcr检测方法可以检测到的最低浓度是6.4×10-1tcid50/ml；比本发明人前期的专利(cn105861753)公开的寨卡病毒巢式rt-pcr的检测灵敏度要高100倍。表2一步法荧光定量巢式rt-pcr灵敏度检测病毒滴度(tcid50/ml)ct值融解曲线6.4x10512.621√6.4x10416.136√6.4x10319.882√6.4x10223.403√6.4x10127.313√6.4x10030.690√6.4x10-132.133√6.4x10-238.883×negativecontrolundermined×实施例5一步法荧光定量巢式rt-pcr标准曲线将zikvsmgc-1毒株细胞培养上清(病毒滴度为6.4×107tcid50/ml)140μl用于提取总rna，50μl无核酸酶dh2o溶解，并进行10倍稀释，使其浓度为1×105～1×101tcid50/ml，每个稀释度重复检测3次。结果如图3所示，融解曲线单一，表明特异性非常好。标准曲线可靠，相关系数r2为0.9823。实施例6一步法荧光定量巢式rt-pcr检测zikv临床样本用1例输入性zikv感染者的8份连续血清或尿液样本以及20份临床疑似感染者血清和2份健康血清提取rna，进行一步法荧光定量巢式rt-pcr检测，同时以无核酸酶dh2o作为阴性对照。结果如图4和表3所示，只有zikv感染者的1份血清和2份尿液可以被检测到zikv，而其余20份临床疑似感染者血清样本(图中只列出2份)和2份健康血清样本没有检测到zikv，说明本发明所涉及的检测方法是可靠和实用的。表3临床样本及对应的检测ct值和融解曲线特异性分析样品名ct值2016.02.06血清36.4292016.02.07血清38.2912016.02.07尿液34.0522016.02.08血清35.7312016.02.09尿undetermined2016.02.10血清37.0292016.02.11尿30.9732016.02.14血清38.723#1疑似感染者血清39.584#2疑似感染者血清33.867#1健康血清undetermined#2健康血清undeterminednegativecontrolundetermined对比例1一步法荧光定量巢式rt-pcr对内套引物和外套引物的设计有着严格的要求，在设计引物时，我们选择了多种不同的外套引物，比如以下组合，使用该引物组进行一步法荧光定量巢式rt-pcr扩增时出现非特异性扩增，表现为融解曲线出现多峰现象。对比例2在设计引物时，我们也试验了不同长度的内套引物，比如以下引物组合，虽然可以得到良好的扩增，但是扩增灵敏度出现了明显的差异，无法满足检测需求。对比例3一步法荧光定量巢式rt-pcr对反应体系也有严格的要求，我们对反应体系进行了优化，比如在优化的过程中，我们使用了不同浓度的引物组合，比如外套引物和内套引物比例为1:1，该反应体系得到的结果出现非特异性扩增，无法满足检测需求。该反应体系如下：对比例4pcr反应程序同时也是影响一步法荧光定量巢式rt-pcr特异性扩增的重要因素；我们对pcr反应程序进行了优化，比如在优化的过程中，使用了不同的扩增条件，比如反应条件：42℃10min逆转录，95℃2min预变性，外套pcr(95℃15sec，65℃15sec，72℃35sec)×30个循环，内套pcr(95℃15sec，48℃15sec，72℃30sec)×30个循环，融解曲线分析。该反应条件得到的结果也是出现非特异性扩增，无法满足检测需求。序列表<110>深圳市第三人民医院<120>一种基于一步法荧光定量巢式rt-pcr检测寨卡病毒的引物组及试剂盒<130>1715186zbsh042<141>2017-12-25<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>40<212>dna<213>寨卡病毒(zikavirus)<400>1acttgaytgtgaaccraggacaggccttgacttttcagat40<210>2<211>40<212>dna<213>寨卡病毒(zikavirus)<400>2caagytccarcatcatcttdgagttctcagtgctttcagt40<210>3<211>20<212>dna<213>寨卡病毒(zikavirus)<400>3gacatyccattrccttggca20<210>4<211>18<212>dna<213>寨卡病毒(zikavirus)<400>4tgyacctccactgtgact18<210>5<211>575<212>dna<213>寨卡病毒(zikavirus)<400>5acttgattgtgaaccgaggacaggccttgacttttcagatttgtattacttgactatgaa60taacaagcactggttggttcacaaggagtggttccacgacattccattaccttggcacgc120tggggcagacaccggaactccacactggaacaacaaagaagcactggtagagttcaagga180cgcacatgccaaaaggcaaactgtcgtggttctagggagtcaagaaggagcagttcacac240ggcccttgctggagctctggaggctgagatggatggtgcaaagggaaggctgtcctctgg300ccacttgaaatgtcgcctgaaaatggataaacttagattgaagggcgtgtcatactcctt360gtgtaccgcagcgttcacattcaccaagatcccggctgaaacactgcacgggacagtcac420agtggaggtacagtacgcagggacagatggaccttgcaaggttccagctcagatggcggt480ggacatgcaaactctgaccccagttgggaggctgataaccgctaaccccgtaatcactga540aagcactgagaactccaagatgatgctggaacttg575当前第1页12