一种单细胞生物检测芯片的制作方法

本实用新型涉及面向生物单细胞检测应用的微米结构基底，特别是一种辅助单细胞可视化、药物筛选、毒性检测的生物明胶材料微米结构芯片。

主要是通过两次压印工艺，在生物活性材料薄膜的表面加工出高精度的微米级结构图形，在这些微米结构上培养观察微生物个体，可以实现生物单细胞检测，还可以对大分子药物进行筛选，检测毒性。

背景技术：

自然界中不同种类的微生物一般都是以群体的形式存在，个体之间通过某些特殊方法进行信息交流和沟通。近年来，研究人员对微生物种群中的个体之间信息交流方法的研究越来越广泛。由于这种个体间信息交流方法在自然界中普遍存在和广泛应用，因此通过研究微生物个体间的行为特征和信息交流，可以实现药物筛选、毒性检测等，参见Parsek,M.R.and E.P.Greenberg, Sociomicrobiology:the connections between quorum sensing and biofilms.Trends in Microbiology,2005.13(1):p.27-33.。随着生物微操作技术的快速发展，3D打印，参见Connell,J.L.,et al.,3D printing of microscopic bacterial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013.110(46):p.18380-18385.、微流道、微腔和微滴发生器等技术，被广泛应用于生物单细胞检测领域，这些技术实现了对微生物个体间的信息交流和行为特征变化的高精度观察。以上所述技术尽管实现了生物单细胞检测，但是都需要昂贵的设备和较高的加工成本，难以应用在需要高通量的生物单细胞检测领域，并且在后期对微生物个体的行为特性进行观察统计时也不具备可视化的优点。

随着MEMS技术的快速发展，其被广泛应用在各个领域。微纳加工为单细胞生物检测领域提供了一种新的方法，而微纳压印由于其成本低廉、操作简单等优点，有很好的应用前景。热压印工艺是在微纳米尺度获得并行复制结构的一种成本低而速度快的方法，仅需一个模具，完全相同的结构可以按需复制到大的表面上。热压印由Stephen Y.Chou于1995年首次提出并申请专利，参见专利US5772905“Nanoimprint lithography”。

目前，基于生物活性材料的微压印工艺，在技术实现上还是遇到非常大的难题，这是因为微压印工艺及脱模过程中温度、压力条件单一且压印模板固定，很容易损坏生物材料的活性，不利于后续细菌或细胞的培养。

技术实现要素：

本实用新型为了克服上述细胞检测过程中所遇到的困难与缺点，针对基于生物活性材料的微压印工艺难以实现这一技术难题，采用了成本低廉、操作简单的两步压印技术，研制出了一种基于微结构的生物单细胞检测芯片。

本实用新型技术方案：

一种单细胞生物检测芯片，包括生物检测芯片；

包括生物检测芯片表面带有的微米图形结构；

其中所述的微米图形结构为倒金字塔、锥形或孔柱、沟槽阵列；

所述的图形结构之间为等间隔或为变间隔分布。生物检测芯片及其表面带有的微米图形结构为一体结构。

本实用新型生物检测芯片材料为生物明胶薄膜。

其实现步骤如下：

第1、在基底表面采用刻蚀法、生长法、电镀法、光刻法或沉积法制备微米结构作为模板，所制备的微米结构为倒金字塔、锥形或孔柱阵列；所述的基底材料为硅、镍、铜或锌等硬质薄板；

第2、热压印工艺前，为使脱模简单，在上述微米结构模板表面采用旋涂法、喷涂法、浸润法、蒸发法或溅射法制备疏水涂层，疏水涂层材料为本征静态接触角大于90度的任意疏水材料，得到带有疏水涂层的微米结构模板；

第3、基于上述第2步所述带有疏水涂层的微米结构模板，进行热塑性聚合物材料的一次热压印工艺，压印温度略高于热塑性聚合物材料的熔点，且在压印过程中通过晶圆镊子手动施加压力，并保持所施加压力的均匀性，经过 2min-6min的压印时间，对模板和聚合物材料迅速冷却至室温，然后进行脱模工艺，经历一次热压印工艺的图形复刻，得到表面带有微结构的聚合物材料。

第4、以上述第3步带有微结构的聚合物材料为模板，进行生物活性材料的二次涂覆压印工艺。以旋涂、喷涂或浸润方法在聚合物模板表面涂覆一层配置好的生物活性材料，这种生物活性材料是用于实现生物单细胞检测过程中的细菌或细胞培养基，经过2℃-8℃低温环境冷藏8h-14h后，进行脱模工艺，聚合物材料的微米结构被复刻到生物活性材料薄膜表面。

本实用新型的有益效果是：本实用新型创新性地使用了一种两步压印工艺和图形复刻的技术，即一次热压印工艺和二次涂覆压印工艺。由于直接基于带有微结构的硅模板或者金属硬质模板的生物活性材料的单次压印方法中，脱模工艺比较困难，且容易损坏生物材料的活性，因此，根据本实用新型所采用的技术，先进行基于带有微结构的硅模板或者金属硬质模板的热塑性聚合物材料的一次热压印工艺，把模板上的微结构图形复刻到热塑性聚合物薄膜上，然后以制得的聚合物薄膜为模板，进行生物活性材料的二次压印和脱模工艺，以此把硅模板或者金属硬质模板上的微结构完整地复刻到生物活性材料薄膜上。本实用新型实现简单方便，图形复刻精度高，经济效益好，且不损坏生物材料的活性，实现的单细胞生物检测具有高通量、可控、可视化的优点，应用前景广阔。

附图说明

图1(a)-(f)为倒金字塔硅模板制备工艺流程图。

图2(a)-(f)为两次压印工艺流程图。

图3(a)-(c)为3维结构示意图，其中(a)为倒金字塔结构硅模板，(b)为脱模后 Teflon FEP模板，(c)为脱模后明胶薄膜。

图4(a)-(c)为刻蚀和两次压印工艺的SEM结果，其中(a)为倒金字塔硅模板SEM 图，(b)为热压印后的聚合物Teflon FEP表面的SEM图，(c)为涂覆压印后的生物明胶材料表面的SEM图。

图中，1硅基底，2倒金字塔结构，3 Teflon FEP基底，4正金字塔结构，5 生物明胶基底，6倒金字塔结构。

具体实施方式

为使本实用新型的目的、技术方案和优点更加清晰明白的说明，下面就结合具体实施例对本实用新型进行解释说明，并不旨在表示可以构建或使用本实用新型示例的唯一形式。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本实用新型，阐述本实用新型示例的功能，以及用以构建和操作本实用新型示例的步骤的序列，并不用于限定本实用新型的范围。

实施例1

一种单细胞生物检测芯片，实现步骤如下：

(1)在硅基底1表面采用刻蚀法局部制备微米结构，所述基底1材料为硅片，所制备的微米结构为倒金字塔结构2，制备工艺具体如下：①清洗，将四寸硅片和掩膜板分别放入丙酮中，超声清洗15分钟，然后放入异丙醇中，继续超声清洗10分钟，最后将硅片和掩膜板放入去离子水超声清洗10分钟，用氮气枪吹干备用；②采用LPCVD工艺在上述硅片表面生长一层二氧化硅作为掩膜，厚度为1微米，如图1(a)中所示；③采用蒸发法在硅片表面涂覆黏附剂，将清洗干净的上述②中硅片放入黏附剂HDMS箱体中，设置时间10分钟；④光刻，将涂有黏附剂的硅片放在涂胶机上，滴入光刻胶，光刻胶采用AZ5214，转速4000r/s，旋涂30s，然后放在热板上烘90s，温度为95℃；曝光机曝光6.5s，然后放入3038显影液中显影45s，取出用去离子水清洗并用氮气吹干后，放在热板上烘2min，温度为110℃，如图1(b)(c)中所示；⑤采用RIE工艺刻蚀20min，刻蚀掉生长的二氧化硅层，如图1(d)中所示；⑥清洗，将上述经过RIE刻蚀的硅片放入丙酮中，超声清洗15分钟，然后倒出丙酮，加入异丙醇，继续超声清洗15分钟，最后将硅片取出，用去离子水超声清洗5-15分钟，用氮气枪吹干；⑦KOH刻蚀，将上述清洗完的硅片放入浓度为30％的KOH溶液中刻蚀20min，温度保持在80℃，如图1(e)中所示；⑧清洗，将上述经过KOH刻蚀的硅片放入丙酮中，超声清洗15分钟，然后倒出丙酮，加入异丙醇，继续超声清洗15 分钟，最后将硅片取出，用去离子水超声清洗5-15分钟，用氮气枪吹干；⑨去胶，将上述刻蚀好的硅片依次放入丙酮和异丙醇中分别浸泡10min，然后用去离子水清洗，并用氮气吹干，将清洗干净的硅片放入等离子去胶机中干法清洗，功率为600w，时间15min，制得倒金字塔微米结构，所得倒金字塔结构硅模板结构如图3(a)所示，其SEM如图4(a)中所示。

(2)在上述所得倒金字塔硅模板的表面采用旋涂法制备疏水涂层，其中疏水涂层的材料为浓度0.05wt％的Teflon AF1600溶液，得到带有疏水涂层的倒金字塔硅模板，具体方法如下：首先，将质量为50mg的溶质Teflon AF1600和100g 的溶剂FC40混合均匀，配比得到浓度为0.05wt％的Teflon AF1600溶液，使用磁力搅拌器搅拌24h，然后将步骤1)中得到的倒金字塔硅模板裁剪为长宽均为 1cm的方片，将配置得到的浓度为0.05wt％的Teflon AF1600溶液旋涂在经过裁剪的倒金字塔硅模板的表面，最后进行烘干操作，将其在温度为170℃的热板上烘干5min，之后温度升高至340℃继续烘干30min，这样混合溶液中的FC40被蒸发，Teflon AF1600均匀的涂覆在倒金字塔硅模板的表面，以使后续脱模工艺容易操作。

(3)根据上述倒金字塔硅模板的尺寸，同样裁剪厚度为3.5mm的聚合物 Teflon FEP薄膜为1cm*1cm的方片，首先将Teflon FEP薄膜夹在倒金字塔硅模板和玻璃片之间，这样使得压印过程中Teflon FEP薄膜受力受热均匀，然后把夹好的Teflon FEP薄膜放在热板上，温度设定在280℃，在加热的过程中手动通过晶圆镊子施加一个恒定的中等压力在玻璃片上，并保持所施加压力的均匀性，这样使得处于玻璃态的Teflon FEP能完全渗入到倒金字塔硅模板表面的倒金字塔结构的槽内，如图2(c)中所示。经过5min的热压印过程，迅速使用平口钳把Teflon FEP转移到不锈钢冷台上，经过充分的降温处理，再进行脱模工艺，由于倒金字塔硅模板表面的倒金字塔的V型结构，又因本实用新型在步骤2) 中进行的疏水涂层的预处理，使得本方法脱模工艺相对简单，得到的Teflon FEP 基底3表面的正金字塔结构4平整光滑，脱模后Teflon FEP模板结构如图3(b) 所示，其SEM如图4(b)所示。

(4)首先称量3g的明胶颗粒和0.3g的牛血清蛋白，然后混合在10ml的蒸馏水中，搅拌均匀，然后100℃水浴加热20min，并且期间不断搅拌混合溶液，使得明胶和牛血清蛋白混合均匀，接着使用搅拌棒蘸取三滴明胶混合溶液，涂覆在步骤(3)中的热压印后的聚合物Teflon FEP材料的表面，涂覆均匀，如图 2(e)中所示，最后把Teflon FEP低温冷藏12h，温度设置在4℃。明胶混合溶液固化后进行脱模，由于聚合物材料的低粘附性和明胶材料的弹性，因此脱模工艺相对简单。由此制得与生物明胶基底5为一体的表面具有倒金字塔结构6 的生物明胶材料，倒金字塔结构复刻完整，其结构如图3(c)所示，其SEM如图4(c)中所示，可以用于下一步的单细胞生物检测技术中。在后续进行单细胞生物培养和观察的实验中，本实用新型制备的倒金字塔结构明胶培养基底非常好的实现了单细胞生物检测，实验成功率接近100％。

此处实施例的描述只是作为示例给出并且本领域的技术人员可以做出各种修改。以上说明、示例和数据提供了对本实用新型的各示例性实施例的结构和使用的全面描述。本实施方式中仅仅以倒金字塔结构作为实施例对本实用新型做出进一步的说明，但本实用新型生物检测芯片上的微米图形结构不限于倒金字塔结构，同样可为锥形或孔柱、沟槽阵列，其效果及制备与本实施例中的倒金字塔结构完全相同，在此不一一赘述。虽然上文以一定的详细度或参考一个或多个单个实施例描述了本实用新型的各实施例，但是，在不偏离本实用新型的精神或范围的情况下，本领域的技术人员可以对所公开的实施例做出很多修改。