一种用于致病菌检测及生存状态评估的太赫兹成像微孔检测板的制作方法

本实用新型属于检测装置，涉及一种用于致病菌检测及生存状态评估的太赫兹成像微孔检测板。

背景技术：

病原菌的快速检测对于环境监控、食品安全和感染性疾病的诊断至关重要。目前临床微生物学中病原菌培养与鉴定仍然是主流技术与方法，即根据病原菌培养后的酶学和生化反应特性进行细菌种属的鉴定。这种经典方法仍然是临床微生物学中的金标准，但是往往随需时间较长，通常在细菌分离培养后还需要进行复杂的酶学和生化反应实验才能准确获取病原菌的类型。为了克服此弊端，近年来出现了一系列新的快速细菌检测技术，大大缩短了检测所需时间，将传统的一周左右的细菌鉴定周期缩短到1到2天，但是均具有相应的技术缺陷。基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱作为一种革命性的细菌鉴定方法，可在细菌培养后省略了酶学和生化反应实验，直接通过菌落中特异性的电荷比所决定的质谱峰来区分不同类型病原菌，但是只能检测纯的菌落并与数据库进行比对进行结果的判断，无法检测混合感染样本的多种细菌相互交叠在一起的混合菌落样本。虽然荧光PCR方法可以通过多种荧光标记同时检测几种病原菌，荧光染料间的干扰影响其检测特异性容易导致假阳性结果的产生。此外，这些新方法均为检测细菌特异性的核酸片段或蛋白成分，特异性成分可来自活菌也可来自死菌，而对人体具有潜在危害的仅限于活菌部分，检测到死菌对感染性疾病诊断意义不大。因此，建立一种从细胞层面可区分死菌和活菌、可以检测混合样本的方法对感染性病原菌的快速诊断具有非常重要的意义。

太赫兹(THz，1THz＝10¹²Hz)波是频率在0.1～10THz的电磁波，由于其所在频段的特殊性频率比红外更低、比微波更高，早些年未能找到产生有效太赫兹源的电子学或光学方法。近十年来，THz技术在天文学、农学和化学领域已取得了明显运用，包括残余抗生素的检测、有机材料的无损探测和化学物质的构象区分等。而最近几年，生物医学领域同样掀起了THz应用研究热潮，这是由于核酸、蛋白、糖类和脂类生物大分子之间/内的弱相互作用力(氢键、范德华力)、骨架振动和偶极子旋转等正好处于THz频谱范围，当THz波通过生物大分子时，激发其低频振动模式，引起能级跃迁，从而根据吸收光谱上不同的吸收峰位置和强度实现物质的表征。因此，可以通过生物物质特定结构在THz频段下具有不同的吸收光谱的特性实现物质的无标记检测。THz技术作为一种“图谱合一”新技术，THz既可以做成像研究还可以光谱测量，由于THz成像检测区域更加灵活并提供直观的检测结果，在肿瘤组织检测中取得了广泛的运用基础研究，包括皮肤癌、乳腺癌和神经胶质瘤组织切片的快速检测。然而，到目前为止，国内外还未有采用THz成像技术进行细菌检测的报道，这是由于菌落(无数个细菌的合集)处于一种介于固体和液体之间的特殊凝胶质地，没有现有的样本检测池进行样本的加载以便于菌落的检测。此外，由于生物样本中水分对THz波的强烈吸收，样本太厚时THz波的强烈衰减导致其无法穿透，而样品太薄时则因为有效光程不够导致检测信号的信噪比过低，因此，筛选出具有合适的样本厚度、填充尺寸的样本检测池是THz成像技术用于细菌检测的重要需求。

技术实现要素：

有鉴于此，本实用新型的目的在于提供一种用于致病菌检测及生存状态评估的太赫兹成像微孔检测板，其结果简单便于批量加工，可以用于不同病原菌、活菌和死菌以及混合菌的检测。

为达到上述目的，本实用新型提供如下技术方案：

一种用于致病菌检测及生存状态评估的太赫兹成像微孔检测板，所述微孔检测板包括阻值>10000Ω的双抛高阻硅片基底，所述基底上设置有按阵列排列的样品填充区，所述样品填充区外周设置有对准标记线，所述对准标记线分别与X轴和Y轴平行且延长线过对准样品填充区中心点。

优选的，所述基底为直径100mm的圆形硅片，厚度300μm。

优选的，所述高阻硅片晶向为100，型号为P。

优选的，所述样品填充区为6×6阵列排列。

优选的，所述样品填充区为直径100μm、200μm、500μm、1000μm、2000μm或4000μm，深度为20μm的圆孔。

更优选的，所述对准标记线设置于以样品填充区中心点为圆心，直径为1cm圆环的圆周上。

本实用新型的有益效果在于：本实用新型公开了一种用于致病菌检测及生存状态评估的太赫兹成像微孔检测板，其结构简单，可以用于细菌培养后平板上多个菌落的直接定性可视化快速检测，可摒弃耗时较长的酶学和生化反应环节实现病原菌的快速检测(即：临床样本培养后10min内)；且对肉眼观察无明显差异的鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌的菌落太赫兹成像也出现不同顶部颜色的圆柱体。由于活菌和死菌具有不同的THz吸收光谱，因此THz成像结果也具有明显差异，即本方法可以区分同种细菌的活菌和死菌，还可以用于混合样本检测。且样本量需要少，单个菌落大小即可满足检测需求，能够满足临床病原菌的快速检测需求。

附图说明

为了使本实用新型的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本实用新型提供如下附图进行说明：

图1为微孔检测板结构图。

图2为四种常见致病菌(大肠埃希菌，鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)的差异性THz成像结果图。

图3为金黄色葡萄球菌活菌和死菌的不同成像结果图。

图4为大肠埃希菌和鲍曼不动杆菌混合样本的成像结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对本实用新型的优选实施例进行详细的描述。

一种用于致病菌检测及生存状态评估的太赫兹成像微孔检测板，其结构如图1所示。其中微孔检测板包括可透过太赫兹波的基底，所述基底上设置有按阵列排列的样品填充区1，所述样品填充区外周设置有对准标记线2，所述对准标记线分别与X轴和Y轴平行且延长线对准样品填充区中心点。优选的，基底选择双抛高阻硅材质，采用深硅刻蚀的方法制备，阻值>10000Ω的高阻；更优选的，所述基底为直径100mm的圆形硅片，厚度300μm；高阻硅晶向为100，型号为P；所述样品填充区为6×6阵列排列；更优选的，所述样品填充区为直径100μm、200μm、500μm、1000μm、2000μm或4000μm，深度为20μm的圆孔，能保证THz波的有效透过又能保证检测结果的有效信噪比。本发明中，不同直径的圆孔可以设置于同一检测板上，也可以在同一检测板上设置同一孔径。以下三个具体实施案例中采用直径为2000μm的样本填充区，所需样本体积仅为0.06μL，单个菌落即可满足检测要求。更优选的，所述对准标记线设置于以样品填充区中心点为圆心，直径为1cm圆环的圆周上。

实施例1:

将临床上常见的致病菌，分别为大肠埃希菌ATCC 25922，鲍曼不动杆菌ATCC 19606，铜绿假单胞菌ATCC 27853和金黄色葡萄球菌ATCC 25923接种于哥伦比亚血琼脂平板，在温度为37℃、CO2体积分数为5％的恒温孵箱中培养过夜后，分别挑取单菌落于高阻硅微孔检测板中后(图1)，采用盖玻片将样本压平，菌落充分填充入中心区域，多余样本则从边缘溢出，保证样本填充完整性。利用透射式THz成像仪进行检测，将四种菌落的透过率画作z轴并在同一坐标系内比较结果如图2所示。每个圆柱体代表微空内的细菌样本而底层代表微孔外溢出样本，圆柱体表面非常平整代表细菌样本填充完整、均匀。由于大肠埃希菌ATCC25922，鲍曼不动杆菌ATCC 19606，铜绿假单胞菌ATCC 27853和金黄色葡萄球菌ATCC 25923具有的不同的含水量和特定结构在THz频段下具有不同的吸收特性，其成像结果具有明显差异，圆柱体的表面颜色代表其透过率的差异，可通过成像颜色进行细菌类型的可视化区分。例如，鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌的菌落肉眼观察无明显差异，仅能通过耗时较长的酶学和生化反应实验才能区分，但是由于前者对太赫兹波的吸收明显大于后者，两种菌落的太赫兹成像结果分别为表面为紫色和天蓝色的圆柱体，因此本方法可以摒弃繁琐的酶学和生化反应步骤，直接在细菌培养后实现不同细菌的检测。

实施例2:

为了验证THz成像技术用于同种细菌活菌和死菌的区分，分别制备活菌和死菌。金黄色葡萄球菌ATCC 25923接种于哥伦比亚血琼脂平板，在温度为37℃、CO2体积分数为5％的恒温孵箱中培养过夜后，挑取单菌落作为活菌样本，死菌样本为活菌通过热处理获得。将金黄色葡萄球菌的活菌和死菌分别加于高阻硅微孔检测板中，采用盖玻片将样本压平，菌落充分填充入中心区域，多余样本则从边缘溢出，保证样本填充完整性。利用透射式THz成像仪进行检测，结果如图3所示。结果显示，金黄色葡萄球菌的活菌和死菌的成像结果也明显不同，通过圆柱体顶部颜色可以看出活菌的吸收更大导致样本透过率更低，这是由于死菌生物大分子变性导致低频振动模式的改变和胞内游离水和结合水比例变化所导致。该结果说明同一种细菌的活菌和死菌具有的不同胞内含水量和新陈代谢活性导致其差异性太赫兹吸收信号，采用该THz成像微孔检测板也可以被THz成像技术区分开。

实施例3:

为了验证本实用新型所述的THz成像微孔检测板用于混合样的检测，分别制备大肠埃希菌ATCC 25922和鲍曼不动杆菌ATCC 19606的活菌样本。将大肠埃希菌ATCC 25922和鲍曼不动杆菌ATCC 19606接种于哥伦比亚血琼脂平板，在温度为37℃、CO2体积分数为5％的恒温孵箱中培养过夜后，分别挑取单菌落采用1:1比例混合后加入微孔板中，采用盖玻片将样本压平，菌落充分填充入中心区域，多余样本则从边缘溢出，保证样本填充完整性。采用透射式THz成像仪进行检测，结果如图4所示。在可见光波段不易被肉眼区分的两种菌落的混合样本在THz成像图上具有明显差异，即两种菌落的太赫兹成像结果分别为表面为紫色和天蓝色的圆柱体。更为重要的是，两种样本的顶部颜色分别和纯菌落检测结果一致，说明了直接在混合样本中实现靶细菌的简单判读的可行性，对于混合感染性样本中特异性细菌的识别具有重要意义。

本发明的检测原理为：由于不同类型细菌的菌落具有差异性成像结果，当平板上存在多个菌落时可通过THz图像指纹自动识别软件，与构建的病原菌的“THz图像数据库”的菌落图像特征进行对比，获得所检测平板中存在的菌落的类型和数目，从而实现平板上多个菌落的可视化检测，当存在两种或者多种细菌的混合样本时，由于其THz吸收差异导致图像结果呈现为几种颜色的叠加从而判断混合样本，而活菌和死菌的差异性图像也可用于细菌生存状态的评估。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本实用新型的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本实用新型进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本实用新型权利要求书所限定的范围。