用于预测急性疼痛转变为慢性疼痛的MYO1A以及MYO1A用于治疗疼痛的用途的制作方法

本发明涉及将Myo1a鉴定为急性疼痛转变为慢性疼痛的生物标志物，并鉴定为治疗靶标。本发明特别涉及用于评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的产品和方法，并且特别适用于哺乳动物，优选人类受试者。本发明更具体地涉及优选使用MYO1A基因作为生物标志物来评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向。在本文中本发明人提供对MYO1A具有特异性的结合试剂，含有所述试剂的组合物、装置、试剂盒，以及动物模型，并进一步描述了它们用于评估受试者罹患慢性疼痛的倾向的用途。本发明还涉及用于诊断、预防、管控或治疗慢性疼痛的产品和方法。

背景技术：

疼痛通常分为急性和慢性疼痛。急性疼痛持续时间短，并且对于维持我们的身体完整性是必需的，而慢性疼痛在正常愈合时间后持续并对我们的健康产生不利影响。慢性炎性或神经性疼痛导致高度衰弱和持久的感觉异常，如痛觉过敏、异常性疼痛和自发性疼痛(Munro等人,2009)。这些症状由外周和中枢神经系统中疼痛路径的异常延长的敏化引起，从而导致疼痛传递回路中的促进增加或抑制减弱。(Sandkuhler,2009；Zeilhofer等人,2012)。在发炎和神经损伤的情况下通过各种机制发生减少的脊髓抑制。这些包括前列腺素E2介导的对抑制性甘氨酸受体的抑制(Ahmadi等人,2002；Harvey等人,2004；Muller等人,2003；Zeilhofer等人,2012)和来源于脑的神经营养因子(BDNF)介导的氯化钾输出物KCC2下调，这扰乱了氯化物稳态，从而改变了GABA能和甘氨酸能抑制功能(Coull等人,2005；Coull等人,2003；Zeilhofer等人,2012)。最近的研究解密了数种微回路，所述微回路涉及参与控制急性和损伤诱导的持续疼痛的脊髓(SC)兴奋性和抑制性中间神经元的不同子集(Bourane等人,2015a；Bourane等人,2015b；Duan等人,2014；Foster等人,2015；Peirs等人,2015；Petitjean等人,2015)。这些数据一起展示我们对如下分子和细胞机制有很多了解，这些机制是控制损伤诱导的急性疼痛发作的外周和中枢敏化的基础。然而，我们对触发急性疼痛向慢性疼痛转变的分子和细胞事件的了解仍然有限。例如，已确定在常见的外科程序如胸外科、腿截肢和冠状动脉旁路后，约10％至50％的个体会在急性术后疼痛后出现持续疼痛(Gilron等人,2013；Kehlet等人,2006)。这些患者中仅一小部分如何以及为何产生慢性术后疼痛(CPSP)尚未知晓。在临床中，已经提出了数种预测CPSP产生的风险因素。这些因素包括年龄、性别和手术类型、患者对引起的疼痛刺激的反应的术前和术后评估以及他们对产生CPSP的遗传易感性(Kehlet等人,2006)。

鉴于缺乏关于慢性疼痛的产生、预防和治疗的信息，显然需要鉴定可适当管控慢性疼痛的新生物标记物以及可预防、减弱或治疗慢性疼痛的新治疗化合物。

技术实现要素：

令人惊讶地，发明人在本文中首次展示，Myo1a的缺失或其表达的改变与受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向有关。

因此，本发明的第一目的涉及编码肌球蛋白IA(Myo1a)的DNA或mRNA、优选Myo1a基因或Myo1a蛋白的用途，其用作生物标志物来评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向。

本发明还涉及一种评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的体外方法，其中所述方法包含对从受试者的生物样品中获得的Myo1a核酸序列进行分析、通常是测序的步骤，检测到在与以SEQ ID NO：1鉴定的Myo1a野生型核酸序列比较时受试者的Myo1a的核酸序列改变，则指示受试者倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛，而不存在改变则指示受试者没有产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向。

本发明的其它目的涉及编码Myo1a的DNA、编码Myo1a的mRNA或Myo1a蛋白(“肌球蛋白IA”)的激动剂，其用于预防或治疗受试者的疼痛，特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛；涉及包含Myo1a蛋白的激动剂以及药学上可接受的载体或承载体的组合物；并且涉及其用于预防或治疗受试者的疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的用途。

本文还描述了一种Myo1a调节剂的体外或离体筛选方法，所述方法包含确定候选药物活化或刺激或相反地降低或抑制Myo1a功能性表达和/或生物学功能的能力，并且如果所述能力得到证实，则将候选药物鉴定为Myo1a激动剂(活化剂)，并可能鉴定为用于预防、减少或治疗疼痛的候选药物，或相反地鉴定为Myo1a拮抗剂(抑制剂)。

发明人在本文中揭示了Myo1a KO(Myo1a^-/-)动物模型用于筛选Myo1a调节剂和/或筛选用于预防、减少或抑制疼痛的药物的潜在用途。

本发明还涉及适用于实施上述方法的试剂盒和装置，例如包含固定在承载体上的至少一种互补核酸的装置，所述互补核酸结合Myo1a基因或Myo1a基因座的全部或部分，通常是用于对Myo1a核酸进行测序的寡核苷酸，或用于评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的试剂盒，所述试剂盒包含用于对从受试者的生物样品中获得的Myo1a核酸进行测序的寡核苷酸。

在一个特定方面，本发明涉及包含固定在承载体上的至少一种互补核酸的装置用于评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的用途，所述互补核酸结合Myo1a基因或Myo1a基因座的全部或部分。

在另一个特定方面，本发明涉及试剂盒用于评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的用途，其中所述试剂盒包含用于对从受试者的生物样品中获得的Myo1a核酸进行测序的寡核苷酸。

在本发明的上下文中，所述受试者是任何哺乳动物受试者，特别是人类受试者。

具体实施方式

疼痛是与实际或潜在组织损害相关的令人不快的感觉体验。因此，疼痛是各种损伤和疾病的最常见症状。存在不同的疼痛分类，例如伤害性疼痛通常区别于炎性疼痛和病理性疼痛，病理性疼痛是由损害神经系统(即神经性疼痛)或其异常功能(功能障碍性疼痛，如在纤维肌痛、肠易激综合征、紧张型头痛等中)引起的疾病状态。

疼痛通常是短暂的，只持续到有害刺激被去除或潜在的损害或病理已经治愈为止，但是一些疼痛病状，如类风湿性关节炎、外周神经病、癌症和特发性疼痛(在创伤或病理已经治愈后持续或没有任何明显原因产生的疼痛)，可能会持续多年。持续长时间的疼痛被称为慢性疼痛，并且迅速消除的疼痛被称为急性疼痛。传统上，急性和慢性疼痛之间的区别依赖于距离发作的任意时间间隔；两种最常用的标志物是疼痛发作后3个月和6个月(Turk,Okifuji,疼痛的术语和疼痛的分类(Pain terms and taxonomies of pain)；Bonica,Loeser,Chapman,Turk,Butler,Bonica的疼痛管控(Bonica's management of pain).Hagerstwon:Lippincott Williams&Wilkins,2001)，但一些理论家和研究人员认为在12个月时急性疼痛转变为慢性疼痛(Spanswick,Main,疼痛管控：跨学科的方法(Pain management:an interdisciplinary approach).Edinburgh:Churchill Livingstone,2000)。其他人认为持续少于30天为急性疼痛，持续时间多于六个月为慢性疼痛，并且持续一至六个月为亚急性疼痛(Thienhaus,Cole,疼痛的分类(Classification of pain).Weiner,疼痛管控：临床实用指南(Pain management:a practical guide for clinicians).Boca Raton:CRC Press,2002)。慢性疼痛的不涉及任意固定持续时间的一个通俗替选定义为“超出预期的治愈期的疼痛”(Turk,Okifuji,2001,疼痛术语和分类(Pain terms and taxonomies).Loeser,Butler,Chapman等人,Bonica的疼痛管控(Bonica's management of pain),Lippincott Williams&Wilkins.ISBN 0-683-30462-3)。慢性疼痛可分为癌症疼痛或良性疼痛(Thienhaus,Cole,2002,疼痛的分类(Classification of pain).Weiner,疼痛管控：临床实用指南(Pain management:A practical guide for clinicians),American Academy of Pain Management,ISBN 0-8493-0926-3)。

疼痛感通过感觉神经元传输到大脑，所述感觉神经元也被称为伤害感受器。伤害感受器被认为是多模式的，因为其可以响应多种形式的有害或强烈刺激，如热量(热/冷)、机械和化学刺激。伤害感受器的感觉传入纤维在许多方面是异质的。例如，感觉神经根据其直径和髓鞘化程度分为Aα、-β、-δ和C-纤维。接着，通过涉及脊髓内的兴奋性和抑制性中间神经元的复杂回路将来自外周的感觉输入加工并传输到更高的脑区(Basbaum等人,2009；Todd,2010)。刺激和抑制之间的平衡对于维持正常的感觉功能是至关重要的，并且这些回路的功能障碍导致疼痛如炎性和神经性疼痛的产生。

疼痛的治疗包括使用阻断神经元传输并影响感觉以及疼痛的局部麻醉剂，以及使用缓解疼痛并且还可以干扰发炎的化学介导物的活性的镇痛剂。急性疼痛通常用药物如镇痛药和麻醉剂来管控。然而，慢性疼痛的管控则困难得多。此外，疼痛的治疗不充分广泛存在于外科病房、重症监护室、事故现场和急诊部中，一般实践中，所有形式的慢性疼痛包括癌症疼痛管控中以及临终关怀中。这种忽视延伸到所有年龄段，从新生儿到体弱的老人。迄今为止，患者仍然非常需要改善的疼痛治疗，特别是在考虑无论所选的已知镇痛分子是何种治疗仍不完全的神经性、炎性和/或慢性疼痛时。

本发明的目的在于区分那些易于产生慢性疼痛的受试者，以帮助从业者优化对其的疼痛治疗。

在本发明的上下文中，患者或受试者是动物，优选是脊椎动物，通常是哺乳动物。在一个优选实施方式中，哺乳动物是人类，无论其年龄或性别如何。所述哺乳动物还可以是动物，特别是家畜或繁殖动物，特别是马、狗、猫等。

发明人在本文中展示，在Myo1a KO小鼠中，短暂持续且可逆的炎性、神经性和术后疼痛转变为不可逆的慢性疼痛，指示Myo1a的缺失使小鼠倾向于产生慢性疼痛而无论引发病变的病因如何。使用行为药理学，他们发现在发炎和神经损伤的情况下，Myo1a KO小鼠选择性地对GABAA-R激动剂蝇蕈醇的镇痛作用不敏感，从而展示了Myo1a的缺失损害了离子型GABA能信号传导。因此，SC切片上的电生理学记录展示，在炎性病状下，蝇蕈醇引起的板层II中间神经元的兴奋性谷氨酸能活性增加在Myo1a KO小鼠中被完全消除。发明人使用无偏RNA深度测序筛选揭示了DRG和SC神经元两者中GABAA-R(GABRA2)的α2亚基的选择性上调。同时，其数据将Myo1a基因鉴定为通过选择性改变离子型GABA能信号传导产生损伤诱导的慢性疼痛和发炎诱导的慢性热性疼痛的预测性遗传因子。

发明人现在在本文中描述编码肌球蛋白IA(Myo1a)的核酸序列、通常编码Myo1a的DNA或mRNA、优选Myo1a基因的用途，其用作生物标志物(或预测性遗传因子)来评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向。机械性或热性疼痛可以是机械性或热性异常性疼痛(由通常不令人疼痛的刺激引起的疼痛)或痛觉过敏(对通常令人疼痛的刺激的放大反应)。

损伤诱导的慢性机械性疼痛通常是炎性、神经性和/或术后慢性机械性疼痛。这三种典型不同种类的疼痛中的每一种都是由损伤触发的，即与组织损伤有关。更具体地，在本发明的上下文中：

-炎性慢性机械性疼痛与组织损伤和免疫细胞浸润有关；

-神经性慢性机械性疼痛由如下损伤触发，所述损伤影响神经系统并且可以涉及或不涉及对神经系统的实际损害，即神经可以被肿瘤浸润或压缩，被疤痕组织绞窄或因感染而发炎。疼痛经常具有灼烧、刺痛或触电的特性。持续异常性疼痛也是神经性疼痛的常见特征。疼痛可以在任何受损组织明显治愈后持续数月或数年。

神经性疼痛的实例包括疱疹后(或带状疱疹后)神经痛、反射性交感神经营养不良/灼痛(神经创伤)、癌症疼痛分量、幻肢痛、嵌压性神经病(例如腕管综合征)和外周神经病(广泛神经损害)。在外周神经病的多种原因中，糖尿病是最常见的，但这种病状也可能是由于长期使用酒精、暴露于其他毒素(包括多种化学疗法)、维生素缺乏以及多种其他医学病状引起，所述病状的原因未进行诊断的情况并不罕见；并且

-术后慢性机械性疼痛直接由手术期间发生的组织损害引起。

Myo1a基因编码肌球蛋白超家族的成员——肌球蛋白-1a(本文中也鉴定为“Myo1a”)。该蛋白质代表一种非常规肌球蛋白。其不应与常规骨骼肌肌球蛋白-1(MYH1)相混淆。非常规肌球蛋白含有常规肌球蛋白特征性基本(basic)域，并且通过其尾域进一步区别于类成员。它们作为基于肌动蛋白的分子马达起作用。已知肌球蛋白IA在脊髓神经元中[更具体地在来自成年腰背根神经节(DRG)的LTMR神经元中，所述成年腰背根神经节的LTMR神经元在本文中也被称作“腰LTMR”]和在肠的特定区域的神经元中表达。肌球蛋白IA还在三叉神经中表达(Tyska,M.J.等人)。

Myo1a基因已被鉴定为高度多态的。实际上观察到比预期多的变体(同义：预期153.1，观察到158，z＝-0.25。错义：预期363.9，观察到405，z＝-1.05)。

在本发明的典型实施方式中，当与表达功能性肌球蛋白Ia(Myo1a)的Myo1a纯合子(Myo1a^+/+)参比受试者中观察到的表达比较时，受试者中肌球蛋白IA(Myo1a)的表达缺失、减少或不足或非功能性表达使受试者倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛。

表达功能性肌球蛋白Ia的参比受试者是Myo1a纯合子(Myo1a^+/+)受试者。参比受试者的Myo1a基因由SEQ ID NO：1或其功能性变体组成。SEQ ID NO：1的功能性Myo1a变体编码功能性肌球蛋白Ia(SEQ ID NO：2)。功能性Myo1a变体可以例如且不限于选自SEQ ID NO：1的直向同源物，如SEQ ID NO：3(狗)和SEQ ID NO：5(猫)。

肌球蛋白IA的非功能性表达通常与背根神经节(DRG)和脊髓中的GABA受体(GABA-R)的α2亚基的选择性上调有关，并且因此可由技术人员间接检测。同样，检测到受试者中GABA能信号传导改变应该是检验所述受试者中肌球蛋白IA的表达或对Myo1a进行测序的原因。

本领域技术人员可用于检测或定量蛋白质——通常是肌球蛋白Ia的方法是本领域技术人员公知的，并且在以下说明书中进一步鉴定。

评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的优选方法是一种体外方法，所述方法包含对从受试者的生物样品中获得的Myo1a核酸序列进行分析、优选测序的步骤，检测到在与以SEQ ID NO：1鉴定的Myo1a野生型核酸序列比较时受试者的Myo1a的核酸序列改变，则指示受试者倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛，而不存在改变则指示受试者没有产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向。

核酸序列的改变引起当与表达功能性Myo1a的Myo1a纯合子(Myo1a^+/+)参比受试者中观察到的表达比较时Myo1a核酸的异常表达，通常是减少、降低或不足的表达，或由核酸编码的蛋白质(Myo1a)的异常、通常是非功能性的表达或活性。

通常，核酸序列的改变可以在Myo1a基因、通常是DNA、cDNA或RNA的水平上确定。优选地，通过对基因座的全部或部分进行测序或通过选择性杂交或扩增基因座的全部或部分来进行检测。更优选地，在改变鉴定步骤之前进行基因座特异性扩增。

改变的核酸或基因座通常是在基因座的编码和/或非编码区中包含突变或突变组合的核酸或基因座序列。

突变通常是点突变，或两个或更多个残基(碱基)的缺失或插入。

点突变可以是将一个碱基与另一个碱基交换的替换，将额外的碱基插入核酸序列的新位置中的插入。点突变可以为：错义突变，其是一种点突变，其中单个核苷酸被改变以引起不同氨基酸的替换；或无义突变，例如移码突变，其在转录的mRNA和截短的或不完整的蛋白质产物中产生过早终止密码子或无义密码子。

缺失可以涵盖基因座的编码或非编码部分中的两个或更多个残基的任何区域，如两个残基至整个基因或基因座。典型的缺失影响较小的区域，如少于约50个连续碱基对的域(内含子)或重复序列或片段，但也可能发生较大的缺失。插入可以涵盖在基因座的编码或非编码部分中添加一个或数个残基。插入通常可以包含在基因座中添加1至50个碱基对。重排包括序列的反转。基因座改变可导致终止密码子的产生、移码突变、氨基酸替换、特定RNA剪接或加工、产物不稳定性、截短的多肽产生等。

在本发明的上下文中遇到的所有情况下，突变停止或降低了功能性蛋白质产物的产生或导致非功能性蛋白质产物。突变通常是功能丧失突变。

不影响肌球蛋白Ia的功能性表达的变异或多态性将不会被技术人员鉴定为核酸序列的改变。

在本发明的上下文中，“Myo1a基因座”表示细胞或生物体中的所有序列或产物，包括Myo1a编码序列、Myo1a非编码序列(例如内含子)、控制转录和/或翻译的Myo1a调节序列(例如启动子、增强子/沉默子区、终止子、5'UTR、3'UTR等)、所有相应的表达产物如Myo1a RNA(例如mRNA)；以及在Myo1a基因的起始密码子(侧接5'UTR区)上游20kb区域、优选15.3kb区域，在非翻译区(侧接3'UTR区)下游20kb区域、14.1kb区域的周围序列。在一个特定实施方式中，大多数改变不在启动子序列中。

在一个特定实施方式中，改变的Myo1a核酸是如下Myo1a野生型核酸，其包含至少一个点突变，优选单核苷酸多态性(SNP)，例如功能丧失SNP，即引起核酸编码的蛋白质的表达缺失或异常(非功能性)的SNP。Myo1a野生型核酸还可以包含数种单核苷酸多态性(SNP)。

在包含Myo1a的目的基因组区中鉴定出第一个SNP后，可以鉴定与这个第一SNP连锁不平衡的其他额外SNP。I实际上，与和慢性疼痛倾向表型相关的第一SNP连锁不平衡的任何SNP都与这种特性有关。因此，一旦证实给定的SNP与慢性疼痛倾向表型之间的关联，发现与这种特性有关的其它SNP就可以是非常有意义的，以增加这个特定区域中SNP的密度。与给定SNP连锁不平衡的其它SNP的鉴定涉及：(a)从来自多个个体的包含或包围第一SNP的基因组区扩增片段；(b)鉴定含有或包围所述第一SNP的基因组区中的第二SNP；(c)进行所述第一SNP与第二SNP之间的连锁不平衡分析；以及(d)选择与所述第一标志物连锁不平衡的所述第二SNP。还考虑包含步骤(b)和(c)的子组合。这些连锁不平衡的SNP还可以用于根据本发明的方法中，并且更具体地，用于根据本发明评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的方法中。

引起慢性疼痛倾向表型的基因座突变可以通过比较来自呈现慢性疼痛倾向表型的患者的基因座的序列和来自参比患者的基因座的序列(如上文所定义含有SEQ ID NO:1或其功能性变体的序列)来鉴定。基于鉴定的SNP或Myo1a基因的SNP的关联，可以针对突变扫描鉴定的基因座。在一个优选实施方式中，针对突变扫描基因座的功能区如外显子和剪接位点、启动子和其他调节区等。优选地，呈现慢性疼痛倾向表型的患者携带显示与慢性疼痛倾向表型相关的突变或突变等位基因，并且参比患者不携带与慢性疼痛倾向表型相关的突变或突变等位基因。用于检测这些突变的方法通常包含以下步骤：从来自呈现慢性疼痛倾向的患者和来自参比患者的基因座的DNA样品扩增包含与慢性疼痛倾向表型相关的SNP或SNP组的目的基因座区域；对扩增的区域进行测序；比较来自呈现慢性疼痛倾向表型的患者和来自呈现参比表型的患者的Myo1a基因的DNA序列；确定对呈现慢性疼痛倾向表型的患者具有特异性的突变。

在一个特定实施方式中，评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的方法是一种体外方法，所述方法包含以下步骤：(a)从受试者获得Myo1a DNA、cDNA或RNA、优选DNA的测试样品，(b)使测试样品与至少一种核酸探针接触，其中所述核酸与改变的目标Myo1a核酸序列互补并且特异性杂交而形成杂交样品，其中所述改变的目标Myo1a核酸序列优选包含至少一种突变，通常是点突变，例如单核苷酸多态性(SNP)，(c)在足以使目标核酸序列与核酸探针发生特异性杂交的条件下维持杂交样品，以及(d)检测是否存在改变的目标核酸序列与核酸探针的特异性杂交，这种特异性杂交揭示受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向。

本文描述的评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的大多数优选方法是对从生物样品的细胞获得的核酸进行的，所述生物样品通常是受试者的血液样品、血浆样品或血清样品。

虽然不太优选，但也可以在肌球蛋白IA多肽(例如，前蛋白和成熟蛋白)的水平上确定改变。

在本说明书中详述了特定技术的实例，所述特定技术的目的在于确定特定核酸的异常(特别是低或缺失)表达，或相应肌球蛋白IA多肽或蛋白质的异常表达。

本领域技术人员可以使用本领域的方法容易地检测核酸中改变的存在，所述方法如限制性消化、测序、选择性杂交(例如与核苷酸阵列上存在的核酸探针)和/或选择性扩增，如下文进一步说明。

还可以通过确定改变的RNA表达的存在来检测基因的改变。改变的RNA表达包括存在改变的RNA序列、存在改变的RNA剪接或加工、存在改变的RNA量等。这些改变的RNA表达可以通过本领域已知的各种技术检测，包括例如通过对RNA的全部或部分进行测序或通过所述RNA的全部或部分的选择性杂交或选择性扩增。

可以特别地通过实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)使用设计用于在目标核酸序列内杂交的探针检测目标核酸如Myo1a的异常表达的存在(参见O'Driscoll L.等人,1993和Yajima T.等人,1998)。

在另一个变体中，该方法包含检测由目的基因编码的多肽或蛋白质的改变的表达的存在。改变的多肽表达包括存在改变的多肽序列、存在改变的多肽量、存在改变的组织分布等。这些改变的多肽表达可以通过本领域已知的各种技术检测，包括例如通过测序和/或与特异性配体(如抗体)结合。

在一个特定实施方式中，本领域技术人员可以通过测量编码正常蛋白质的mRNA的细胞水平来容易地进行异常蛋白质表达的检测，与对照或标准水平相比降低的水平与异常蛋白质表达相关。

测序可以使用本领域中众所周知的技术使用自动测序仪进行。测序可以对完整的基因座进行，或更优选地对其特定域进行，通常是已知或怀疑携带有害突变或其他改变的域。

扩增基于用于引发核酸再生的互补核酸序列之间的特异性杂交体的形成。扩增可以根据本领域已知的各种技术进行，如通过聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。这些技术可以使用市售试剂和方案进行。优选的技术使用等位基因特异性PCR或PCR-SSCP。扩增通常需要使用特异性核酸引物来引发反应。适用于从目的基因座扩增序列的核酸引物能够与基因座中侧接所述基因座的目标区域的一部分特异性杂交，在倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的受试者中所述目标区域发生改变。

本发明的另一个特定目的在于一种核酸引物，所述核酸引物适用于从Myo1a基因或包括周围区域的目的基因座扩增序列。这些引物优选与基因座中的核酸序列互补并特异性杂交。特定引物能够与基因座中侧接所述基因座的目标区域的一部分特异性杂交，在倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的受试者中所述目标区域发生改变。可用于扩增包含SNP的目标区域的引物可以基于所述目标区域的序列或基于Myo1a基因的基因组序列进行设计。

本发明还涉及一种核酸引物，所述引物与在倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的某些受试者中改变的Myo1a基因座编码序列(例如基因或RNA)的一部分互补并特异性杂交。在这方面，本发明的特定引物对Myo1a基因座或RNA中的改变序列具有特异性。通过使用这些引物，扩增产物的检出指示基因座中存在改变。相反，没有扩增产物指示在所考虑的样品中不存在特定改变。

本发明还涉及如上所述和如本文所鉴定的核酸引物或核酸引物对在评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的方法中的用途。

杂交检测方法基于用于检测核酸序列改变的互补核酸序列之间特异性杂交体的形成。特定的检测技术涉及使用对野生型(或其功能变体)或改变的基因或相应的RNA具有特异性的核酸探针，接着检测杂交体的存在。探针可以悬浮或固定在基质或承载体上(如在核酸阵列或芯片技术中)。通常对探针进行标记来便于检测杂交体。

在这方面，本发明的一个特定实施方式包含使来自受试者的样品与对改变的Myo1a基因座具有特异性的核酸探针接触，并评估杂交体的形成。

在一个特别优选的实施方式中，所述方法包含同时使样品与一组探针接触，所述探针分别对野生型Myo1a基因座和其各种改变形式具有特异性。在这个实施方式中，可以直接检测样品基因座中各种形式的改变的存在。此外，可以同时处理来自单个受试者或来自各种受试者的各种样品。

在本发明的上下文中，探针是指一种多核苷酸序列，其与Myo1a基因或RNA(的目标部分)互补并且能够特异性杂交，并且其适用于检测与倾向于损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的基因等位基因(“突变的等位基因”)有关的突变。

探针优选与特定Myo1a基因、RNA或其目标部分完全互补。探针通常包含长度为8至1000个、如10至800个、更优选15至700个、通常20至500个核苷酸的单链核酸。应了解，也可以使用较长的探针。本发明的优选探针是长度为8至500个核苷酸的单链核酸分子，其可以与携带改变的Myo1a基因座或RNA的区域特异性杂交。

本发明的方法使用对改变(例如突变)的Myo1a基因或RNA具有特异性的核酸探针，即与所述改变的Myo1a基因或RNA特异性杂交并且基本上不与缺乏所述改变的Myo1a基因或RNA杂交的核酸探针。

特异性表明与目标序列杂交产生特异性信号，所述信号可以不同于通过非特异性杂交产生的信号。优选将完全互补的序列用来设计根据本发明的探针。然而，应了解，只要特异性信号可以不同于非特异性杂交，就可以容忍某些错配。

本发明还涉及如上所述和如本文所鉴定的核酸探针在评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的方法中的用途。

如上所表明，还可以通过筛选表达目的蛋白质(肌球蛋白IA)的组织的样品中Myo1a多肽序列或表达水平的改变来检测Myo1a基因座中的改变。为了检测蛋白质，可以将免疫组织化学(例如在活组织检查中)、免疫印迹(特别是蛋白质印迹)、蛋白质组学或针对目的蛋白质(肌球蛋白IA)的基于抗体的生物传感器以及本领域技术人员已知的任何其他方法施用于来自目的受试者的含有肌球蛋白IA的生物样品。

还描述了使样品与对特定核酸序列编码的肌球蛋白IA具有特异性的配体接触和确定复合物的形成。

可以使用不同类型的配体，如特异性抗体。在一个特定实施方式中，使样品与对特定核酸编码的肌球蛋白IA具有特异性的抗体接触，并确定复合物的形成。可以使用用于检测这种复合物的各种方法，如ELISA、放射免疫分析(RIA)和免疫酶分析(IEMA)。

在本发明的上下文中，抗体表示多克隆抗体、单克隆抗体以及具有基本上相同抗原特异性的其片段或衍生物。片段包括Fab、Fab'2、CDR区等。衍生物包括单链抗体、人源化抗体、多功能抗体等。对由特定基因编码的多肽具有特异性的抗体表示选择性结合所述多肽的抗体，即针对所述多肽或其含表位片段而产生的抗体。尽管可能发生对其他抗原的非特异性结合，但是与目标多肽的结合以更高的亲和力发生，并且可以可靠地区别于非特异性结合。

优选在任何外科程序之前对受试者进行评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的根据本发明的方法。

还公开了评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的试剂盒，所述试剂盒包含用于在来自受试者的样品中检测以下各项中存在改变的产品和试剂：Myo1a基因座或相应多肽或蛋白质；Myo1a基因或相应多肽或蛋白质表达；和/或Myo1a基因活性。

这些试剂盒包含本发明中描述的任何核酸，通常任何引物、任何引物对和/或任何核酸探针(野生型和突变体)；任何配体，优选抗体；和/或包含固定在承载体上的这种(这些)核酸和/或配体的任何装置。本文描述的试剂盒还可以包含用于进行杂交、扩增或抗原-抗体免疫反应的试剂和/或方案。这些试剂盒还可以包含用于本文所述方法并通过定量PCR或多重技术读取的微阵列。特定装置包含固定在承载体上的至少一种互补核酸，优选数种互补核酸，所述互补核酸结合Myo1a基因或Myo1a基因座的全部或部分。

特定试剂盒，通常是用于评估受试者产生损伤诱导的慢性机械性疼痛或发炎诱导的慢性热性疼痛的倾向的试剂盒，是如下试剂盒：

-用于对从受试者生物样品中获得的Myo1a核酸进行测序的试剂盒，其中所述试剂盒包含核酸序列，通常是寡核苷酸，例如引物或引物对；

-检测受试者的生物样品、通常是血液样品中受试者的Myo1a基因的异常/改变的表达的试剂盒，该试剂盒包含(i)至少一个引物对，(ii)至少一种标记/可检测的(例如荧光)探针，例如两种不同的探针，其允许定量检测Myo1a的表达，以及(iii)提供对应于对照群体中Myo1a的对照定量表达值的活页；以及

-检测受试者的生物样品、通常是血液样品中受试者的Myo1a基因的异常/改变的表达的试剂盒，该试剂盒包含(i)至少一个引物对，(ii)至少两种不同标记的探针，第一种探针识别野生型等位基因，并且第二种探针识别Myo1a的突变等位基因。

当受试者不表达或异常表达肌球蛋白Ia，即不充分表达肌球蛋白Ia或表达非功能性肌球蛋白IA时，发明人在本文中表明必须对受试者使用“适应性疼痛治疗”来预防或治疗疼痛。实际上，发明人已经发现，一旦在所述受试者中形成了损伤诱导的慢性疼痛，所述疼痛就不能用生物碱，特别是GABAA-R激动剂如蝇蕈醇逆转，并且变得不可逆。

在本发明的上下文中，术语“治疗”受试者的疼痛表示在使用或施用根据本发明的合适化合物或组合物后，延迟、稳定、治疗、治愈、减轻、缓解、改变、改进、改善、补救或影响如本文所述的受试者的任何形式的疼痛，或与疼痛有关的任何疾病或病状(特别是与疼痛有关的任何炎性或神经性病症)或这种疾病或病状的任何症状。术语“治疗”还指疼痛(可以与任何损伤、病理或病状有关)治疗成功的任何指标，包括任何客观或主观参数，如减轻、缓解、减缓进展或严重程度、稳定、去除疼痛症状或使其更能被受试者耐受。术语“治疗”疼痛还包括提高疼痛耐受性和/或减少感知的疼痛。在特定的实施方式中，本发明的方法、化合物和组合物用于提高疼痛耐受性和/或用于减少感知的疼痛。如本文所用，术语“疼痛耐受性”是指受试者在情绪和/或身体上崩溃之前可以感知和承受的疼痛量。疼痛耐受性与疼痛阈值(产生疼痛所需的最小刺激)不同。如本文所用，“提高疼痛耐受性”通常是指如下情形，其中与先前状态相比，例如在向受试者施用合适化合物或组合物后，受试者可以产生更高的疼痛耐受性(即，感知的疼痛更少)。

在本发明的上下文中，与受试者的疼痛相关的“预防”是指在使用或施用根据本发明的合适化合物或组合物后，至少降低受试者获得任何类型疼痛的风险的可能性(或易感性)。例如，“预防”包括使疼痛、通常慢性疼痛的至少一种临床症状不在受试者中、通常鉴定为倾向于产生慢性疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛但尚未经历或呈现出疼痛症状的受试者中产生。

根据本发明的适应性疼痛治疗通常涉及外源性供应，例如向受试者施用编码Myo1a的核酸序列(通常是DNA或mRNA)和/或肌球蛋白1a蛋白的激动剂。施用可以是例如鞘内(i.t.)施用。

因此，本发明的一个目的涉及编码Myo1a的核酸序列(通常是DNA或mRNA)和/或肌球蛋白1a蛋白的激动剂，其中Myo1a是功能性Myo1a，所述核酸序列或激动剂用于预防或治疗本文所定义的受试者的疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛。

在本发明中，术语“肌球蛋白1a蛋白的激动剂”用于表示能够活化或刺激野生型肌球蛋白IA蛋白的生物学功能或恢复功能改变的肌球蛋白IA蛋白的功能的任何蛋白质。这种激动剂可以是天然或重组蛋白质或蛋白质片段，所述重组蛋白质或蛋白质片段展现相应野生型蛋白质的特性，特别是能够活化或刺激野生型肌球蛋白IA蛋白的生物学功能或恢复功能改变的肌球蛋白IA蛋白的功能。

本发明还涉及编码Myo1a的DNA、编码Myo1a的mRNA或肌球蛋白1a蛋白的激动剂的用途，其中Myo1a是功能性Myo1a，，所述DNA、mRNA或激动剂用于制备组合物，通常是药物组合物，用于预防或治疗受试者的疼痛，特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛。

本发明还涉及一种包含编码Myo1a的DNA、编码Myo1a的mRNA或肌球蛋白1a蛋白的激动剂以及药学上可接受的载体或承载体的组合物，通常是用于预防或治疗受试者的疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的组合物。

可用于所有本发明的适当的赋形剂、稀释剂或载体可选自例如盐水、等渗、无菌或缓冲溶液等。它们还可以包含稳定剂、甜味剂和/或表面活性剂等。它们可以通过使用盖伦医学(galenic)本身已知的技术以安瓿、烧瓶、片剂或胶囊的形式配制。

本发明还涉及一种预防或治疗疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的方法，所述方法包含向有需要的受试者、通常是哺乳动物、特别是人类施用至少一种选自前述产品的化合物。

需要治疗或预防的受试者是已经根据上述方法测试并且鉴定为倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的受试者。

本发明还提供：

-一种用于筛选或选择能够预防受试者的急性疼痛转变为慢性疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛发生的化合物的体外、体内或离体方法，其中所述受试者被鉴定为倾向于产生这种疼痛，所述方法包含在测试化合物存在下评估特定细胞、组织或动物模型的Myo1a表达的步骤，其中与未暴露于测试化合物或未与测试化合物接触的对照细胞、组织或动物模型相比，特定细胞、组织或动物模型的功能性Myo1a的表达增加指示所述化合物具有预防受试者的急性疼痛转变为慢性疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛发生的能力，其中所述受试者被鉴定为倾向于产生这种疼痛；

-一种用于筛选可用于预防或治疗受试者的疼痛、特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛的化合物的体外、体内或离体方法，其中所述受试者具有改变的Myo1a核酸、改变的Myo1a核酸表达或相应肌球蛋白IA蛋白的改变/异常的表达或活性，所述方法包含体外、体内或离体确定测试化合物的下述能力：(i)恢复所述改变或异常的肌球蛋白IA蛋白的功能性表达、(ii)诱导或增加所述蛋白质的表达或活性或(iii)诱导或增加所述蛋白质的激动性配体的表达或活性；

-一种Myo1a调节剂的体外、体内或离体筛选方法，所述方法包含确定候选药物活化或刺激或相反地降低或抑制Myo1a功能性表达和/或生物学功能的能力，并且如果所述能力得到证实，则将候选药物鉴定为Myo1a激动剂(活化剂)，并潜在地作为用于预防、减少或治疗疼痛的候选药物，或相反地鉴定为Myo1a拮抗剂(抑制剂)；以及

-一种用于预防、减少或治疗疼痛的候选药物的体外或离体筛选方法，所述方法包含确定候选药物活化或刺激或相反地降低或抑制Myo1a功能性表达的能力，并且如果所述能力得到证实，则将候选药物鉴定为Myo1a激动剂，并作为用于预防、减少或治疗疼痛的候选药物，或相反地鉴定为Myo1a拮抗剂。

在本发明的上下文中，可以使用利用本文所述的筛选方法之一鉴定的化合物来预防或治疗受试者的疼痛，特别是损伤诱导的慢性机械性疼痛和/或发炎诱导的慢性热性疼痛。

在本文中，发明人还描述了第一动物模型，即Myo1a KO(Myo1a^-/-)小鼠，其中功能丧失突变引起损伤后不可逆的疼痛病状。这种小鼠模型描述于Tyska等人(2005年)中。

因此本发明的一个目的涉及这种Myo1a KO(Myo1a^-/-)动物模型用于筛选Myo1a调节剂和/或筛选用于预防、减少或抑制疼痛的药物的用途。

这种模型可用于设计适当的药理学疗法来预防慢性疼痛的发作和形成。

这种模型还可以用作实验室工具来用于研究中以深入了解触发急性疼痛向慢性疼痛转变的细胞和分子机制。

本发明的其他特征和优点在以下实验部分(参考图1-8和表1-4)中给出，所述实验部分应被视为说明性的而非限制本申请的范畴。

附图说明

图1.LTMR富含的Myo1a的缺失将损伤诱导的急性机械性疼痛转变为慢性疼痛。

(A-C)成年腰背根神经节(DRG)中表达Myo1a的神经元的表征。使用Myo1a反义探针(红色)进行ISH，然后用抗GINIP(蓝色)抗体和IB4(绿色)(A)或抗Ret抗体(蓝色)(C)双重免疫标记。(B)使用Myo1a(红色)和TrkB反义探针(绿色)进行双重ISH。比例尺：100μm。

(D-E)在E15和新生(P0)DRG和SC组织中通过ISH进行的Myo1a表达分析(红色)。比例尺：50μm(D)和100μm(E)。

(F)使用Myo1a探针(白色，左图)或不使用探针(右图)对成年SC组织进行的ISH。虚线区域界定SC的板层I-IIo。

(G)成年DRG和SC中Myo1a转录物的定量(相对于β-肌动蛋白)。数据代表3次独立实验的平均值±SEM。

(H-J)角叉菜胶诱导的发炎(对于WT，n＝11，并且对于KO，n＝13)(H)、CCI手术(对于WT，n＝9，并且对于KO，n＝10)(I)和爪切割手术(对于WT，n＝10，并且对于KO，n＝10)(J)后WT和KO小鼠的机械反应。对于每个组，数据以平均值±SEM的形式呈现(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。(还参见图5-7)。

图2.蝇蕈醇和地西泮介导的镇痛作用在Myo1a KO小鼠中减弱。

(A-D)SNI手术并且在指定时间点鞘内施用10nmol SNC80、0.2nmol DAMGO(A)、0.1μg巴氯芬、2μg TAFA4(每种基因型n＝6只小鼠)(B)、40μg牛磺酸、腹膜内施用3mg/kg普瑞巴林(每种基因型n＝8只小鼠)(C)和鞘内施用0.15μg蝇蕈醇(每种基因型n＝8只小鼠)(D)后的WT和KO小鼠的机械反应。

(E-G)酵母聚糖诱导的发炎(每种基因型n＝9只小鼠)(E)并且在指定时间点鞘内施用0.15μg蝇蕈醇、10nmol SNC80(每种基因型n＝9只小鼠)(F)和0.09mg/kg DZP(G)(每种基因型n＝7只小鼠)后的WT和KO小鼠的机械反应。对于每个组，数据以平均值±SEM的形式呈现(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；ns：不显著)。

图3.来自WT和Myo1a KO小鼠的DRG和SC组织的转录分析揭示Gabra2表达增加。

(A)呈现KO小鼠相对于WT的DRG(97个差异表达(DE)基因)和SC(31个DE基因)神经元中DE基因的数量(5％错误发现率)的Venn图。仅在DRG中差异表达的基因以红色呈现(84个基因)，仅在SC中差异表达的基因以蓝色呈现(18个基因)或在DRG和SC神经元两者中表达的基因以黄色呈现(13个基因)。

(B)DRG和SC神经元两者中的DE基因的热图表示，其中显示表达增加的基因以红色显示，而那些显示表达降低的基因以绿色显示。比例表示相对于WT的在KO小鼠中观察到的表达的Log2倍数变化。

(C)来自WT和KO小鼠的DRG和SC组织中Wdfy1、Gabra2和Nnt转录物的定量。数据表示KO相对于WT的平均倍数变化±SEM(n＝3次独立实验)。

(D)来自WT(左)和KO(右)小鼠的L5DRG(上图)和腰SC(下图)中通过ISH评估的Gabra2转录物表达(红色)。比例尺：100μm。

(E)显示来自WT(左)和KO(右)小鼠的腰SC的背角中的GABRA2蛋白表达(绿色)的免疫染色。比例尺：50μm。

(F)来自WT和KO小鼠的SC的板层I-III中GABRA2免疫荧光强度的定量。数据表示KO相对于WT的平均倍数变化±SEM(n＝3次独立实验)。

(G)显示WT(左)和KO(右)小鼠的腰SC背角中的GABRA1蛋白表达(红色)的免疫染色。比例尺：50μm。(还参见表1-4)。

图4：蝇蕈醇诱导的EPSC频率增加在酵母聚糖发炎后的Myo1aKO小鼠中丧失。

(A)在解离的C-LTMR中蝇蕈醇诱导的电流(Musc)的全细胞记录的代表性迹线。

(B)来自WT：Tafa4^+/Venus和KO：Tafa4^+/Venus小鼠的C-LTMR中记录的浴施指定剂量Musc后的电流幅度(平均值±SEM)。在直方图上指明记录的细胞数。

(C-F)原初的(C-D)和酵母聚糖发炎的WT和KO小鼠(E-F)中Musc施用后，板层II中间神经元中的自发EPSC的全细胞记录。

左图：在ACSF下(黑色迹线)、表面灌注5μM Musc之后(蓝色迹线)和洗涤期间(棕色迹线)获得的EPSC的代表性迹线。

中图：左图中显示的实验的EPSC间隔(秒)的累积分布。注意到Musc/蓝色曲线向左移动(C、D、E中图)，指示EPSC频率可逆增加。

右图：在ACSF下、表面灌注5μM Musc和洗涤期间的归一化EPSC频率(平均值±SEM)。注意到在来自酵母聚糖发炎小鼠的切片中Musc无效。右图中指明记录的细胞数(*p<0.05；**p<0.01；ns：不显著)。(还参见图8)。

图5：成年DRG神经元存活、规格、中枢和外周神经支配在MYO1A缺失时不受损害。

(A-B)来自WT和KO小鼠的成年腰L4 DRG切片上实现的总PGP9.5⁺(A)和指示的子集(B)的细胞计数。数据表示三次独立实验的平均绝对值(A)或PGP9.5神经元的平均值％(B)±SEM。基因型之间没有观察到统计学显著差异。

(C-E)Myo1a KO小鼠中保留了SC的感觉神经元神经支配。

用抗CGRP(红色，C)、GINIP(蓝色C-E)、IB4(绿色，D)和抗PKCγ(红色，E)对来自WT(上图)和KO(下图)小鼠的SC横向切片进行的免疫染色。比例尺：100μm。

(F-G)Myo1a KO小鼠中保留了毛皮的感觉神经元神经支配。

用抗PGP9.5(红色，F)和抗S100(红色，G)对来自WT(上图)和KO(下图)小鼠的毛皮切片进行的免疫染色。比例尺：PGP9.5和S100显示毛皮神经支配：50μm。PGP9.5显示表皮神经支配：15μm。(与图1相关)。

图6：在缺失MYO1A的情况下保留了C-LTMR和Aδ-LTMR电生理学特性。

(A-D)C-LTMR的电生理学特性。

(A-B)图表显示了WT和KO C-LTMR的电容和静息膜电位。

(C)说明WT和KO C-LTMR对去极化电流脉冲(50pA，1000ms)的反应的代表性迹线。

(D)该图表示通过对WT(黑色)和KO C-LTMR(灰色)进行具有增加幅度的去极化电流步骤(Δ10pA，1000ms)引起的动作电位(AP)的数值。

(E-I)Aδ-LTMR的电生理学特性。

WT和KO Aδ-LTMR的细胞电容(上图)和静息膜电位(下图)如E中所示。通过去极化(F-G上图)或超极化(F-G下图)电流注入(分别为1000ms，Δ0.1nA或Δ-0.1nA)引起AP。(F)该图显示了对于WT(黑色)和KO(红色)Aδ-LTMR获得的代表性迹线。(G)曲线分别表示在去极化电流注入期间(上图)或超极化电流注入之后(下图)AP发放随注入电流变化的概率。在超极化脉冲终止时观察到的AP回弹是Aδ-LTMR的特征。

(H)通过在-60mV的保持电位下对体细胞进行递增的机械刺激在WT(黑色)和KO(红色)Aδ-LTMR中引发代表性机械活化(MA)电流。

(I)将峰值幅度(I峰值)归一化，获得电流/探针位移曲线。曲线显示归一化的峰值电流(I峰值)随探针位移的变化。

WT和KO Aδ-LTMR之间的平均归一化幅度没有变化。

C-LTMR和Aδ-LTMR中的基因型之间没有观察到统计学显著差异。数据表示为平均值±SEM。(与图1相关)。

图7：原初Myo1a KO小鼠和Myo1a^+/-小鼠的行为表征以及损伤后的热和机械超敏反应。

WT和KO在旷场(A)和旋转杆(B：时间和C：速度)测试中的行为。对爪冷却(D：丙酮测试)和有害热(E：热板测试)的热敏感性显示基因型之间没有差异。

(F)该图说明福尔马林测试中的WT和KO小鼠疼痛行为。直方图表示第1阶段和第2阶段期间的反应持续时间。注意到在这个测试中KO小鼠展现增加的反应持续时间(***p<0.001)。

(G-H)在Hargreaves测试中测定角叉菜胶诱导发炎(G)和爪切割手术(H)之后WT和KO小鼠的热超敏反应(***p<0.001，ns：不显著)。

(I)角叉菜胶诱导发炎后WT、Myo1a^+/-和KO小鼠的机械反应(***p<0.001，Myo1a^+/-相对于WT)。

(J)鞘内注射荷包牡丹碱(0.01μg，10μL)后WT和KO小鼠的机械反应(ns：不显著)。

对于每个组，数据以平均值±SEM的形式呈现。(与图1相关)。

图8：Myo1a KO原初或发炎小鼠中SC板层II神经元被动、主动和突触特性的电生理学表征。

(A-F)这些图表示在原初情形下以及在角叉菜胶(Carra.)和酵母聚糖(Zymo.)诱导的发炎下，来自WT和KO小鼠的SC板层II中间神经元的平均膜电位(A)、膜电阻(B)、电容(C)、响应于-25pA超极化脉冲的垂跨(Sag)比(D)、响应于-25电流脉冲的回弹AP的数值(E)和响应于+25pA电流脉冲的AP的数值(F)。记录的细胞的数量：原初：16个WT和26个KO，Carra.：29个WT和23个KO，以及Zymo.：10个WT和12个KO。

(G)该图说明了在原初情形下以及在Carra.和Zymo诱导的发炎下WT和KO小鼠的SC板层II中间神经元中记录的成对脉冲比。记录的细胞的数量：原初：19个WT和33个KO，Carra.：9个WT和13个KO，以及Zymo.：9个WT和9个KO。

对于每个组，数据以平均值±SEM的形式呈现。基因型之间没有观察到显著差异。(与图4相关)。

图1A、B、C、D、E、图3D、E、G和图5C、D、E、F、G各自显示两次(相同的图片显示具有不同对比度的颜色)。

实验部分

材料与方法

小鼠

将小鼠饲养在标准的居住条件(23℃，40％湿度，12h光照循环，并且自由获取食物和水)下。尽量使本研究中使用的小鼠的数量以及应激和痛苦达最小。所有方案均符合欧盟关于动物实验的建议。

Myo1a KO小鼠根据Tyska等人,2005(Tyska等人,2005)产生。室内培育对照野生型(WT)C57BL/6小鼠。分别通过将WT和Myo1a KO小鼠与Tafa4^Venus/Venus(Delfini等人,2013)和Myo1a^+/-：Tafa4^+/Venus小鼠杂交产生WT：Tafa4^+/Venus和Myo1a KO：Tafa4^+/Venus小鼠。

组织学

为了获得用于原位杂交(ISH)和免疫染色的成年背根神经节(DRG)和脊髓(SC)样本，用氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物深度麻醉小鼠，接着用冰冷的4％多聚甲醛在0.1M磷酸盐缓冲液中的溶液(4％PFA)经心灌注。将组织在冰冷的4％PFA中进一步固定24h。将新生P0小鼠牺牲，在冰冷的PBS中快速洗涤，取出内脏并在冰冷的4％PFA中固定24h。将E15胚胎收集在冰冷的PBS中并在冰冷的4％PFA中固定24h。切除成年背部毛皮并在冰冷的4％PFA中固定2h。对于GABRA1和GABRA2免疫染色，快速解剖腰SC(L1-L3)并在冰冷的4％PFA中固定30min。将样本转移到30％(w/v)蔗糖溶液中进行冷冻保护，接着在OCT封固介质中冷冻。使用标准低温恒温器(Leica)获得12μm冷冻切片(DRG)和18-20μm冷冻切片(SC、E15和P0)。

原位杂交

使用来自成年小鼠DRG的基因特异性PCR引物和cDNA模板合成地高辛(Digoxigenin)标记的Myo1a和Gabra2反义探针和荧光素标记的TrkB探针，并如(Reynders等人,2015)中所述进行原位杂交或双原位杂交。用于探针合成的引物如下所列：

Myo1a F1：GAAAATACTTCCGGTCAGGTG

Myo1a R1：CAAGGGTTCTTCATCTCTGAGT

Myo1a F2：TACCAGTGGAAGTGCAAGAAGT

Myo1a R2+T7：

TAATACGACTCACTATAGGGACACTACGAAGTTCTGCTCCAG

Gabra2 F1/F2：ACTTGGTTACTTTTGGGCTGT

Gabra2 R1：TGATTGAAGTGAGCTGAAAGGT

Gabra2 R2+T7：

TAATACGACTCACTATAGGGAACATCCTTTCATGGTGACTCA

TrkB-F1：CTGAGAGGGCCAGTCACTTC,

TrkB-R1：CATGGCAGGTCAACAAGCTA,

TrkB-F2：CAGTGGGTCTCAGCACAGAA,

TrkB-R2+T7：

TAATACGACTCACTATAGGGCTAGGACCAGGATGGCTCTG。

免疫染色

用以下试剂进行免疫染色：大鼠抗GINIP(1:500，Moqrich laboratory)、山羊抗Ret(1:500，R&D Systems)、兔抗TrkA(1:1000，来自University of California，Dr.L.Reichardt的慷慨赠予)、山羊抗TrkC(1:500，R&D Systems)、兔抗CGRP(1:1000，ImmunoStar)、兔抗PKCγ(1:500，Santa Cruz)、兔抗PGP9.5(1:200，Thermo Scientific)、兔抗S100(1:1000，Darko)、兔抗GABRA2(1:2000，Synaptic Systems)和豚鼠抗GABRA1(1:1000，Synaptic Systems)。用来自Invitrogen的Alexa Fluor 488结合的IB4进行IB4标记。用ImmuMount(Thermo Scientific)封固载玻片，接着在AxioImager Z1(Zeiss)荧光显微镜下观察。使用Photoshop软件调节对比度。

为了比较WT与Myo1a KO之间的Gabra2表达，使用相同的曝光参数获取图像，并且相同地调节对比度。

为进行SC和皮肤神经支配以及GABRA染色，使用LSM-780共焦显微镜(Zeiss)进行图像获取，并且在WT与Myo1a KO样本之间考虑相同的针孔孔径、激光强度以及增益参数。

细胞计数和统计分析

如在Gaillard等人,2014中所述，在来自成年WT和Myo1a KO小鼠的腰L4 DRG上计数DRG神经元的总数和子集。简言之，将L4 DRG的12μm连续切片分布在6个载玻片上，对所述载玻片使用不同的标志物，包括泛神经元标志物PGP9.5。这种方法允许我们将所有计数称为神经元(PGP9.5)的总数。对于每种基因型，进行三次独立实验。数据以平均值±平均标准误差(SEM)的形式呈现。

GABRA2荧光强度

使用ImageJ软件在WT和Myo1a KO SC切片的板层I-III中测定与GABRA2表达有关的每平方毫米荧光强度(目的区域中像素的平均荧光)。对于每种基因型，进行三次独立实验并分析5-10个SC切片，并计算Myo1a KO相对于WT样本的荧光强度的倍数变化。

药物

将SNC80(Tocris Bioscience)溶解于100mM HCl溶液中，将DAMGO(Sigma Aldrich)溶解于盐水(0.9％NaCl)中，将巴氯芬(Baclofen)(Sigma Aldrich)溶解于H2O(pH7.6)中，将重组人类TAFA4(R&DSystems)溶解于盐水中，将地西泮(Diazepam)(DZP，Roche)溶解于10％二甲亚砜(DMSO)/90％盐水中，将蝇蕈醇(Tocris Bioscience)、牛磺酸(Taurine)(Sigma Aldrich)、荷包牡丹碱(Bicuculline)(Sigma Aldrich)和普瑞巴林(Pregabalin)(Sigma Aldrich)溶解于磷酸盐缓冲液(PB，50mM，pH7.4)中。

除普瑞巴林外，所有药物均通过鞘内(i.t)注射施用。剂量如图例所示。腹膜内注射普瑞巴林(i.p)。在药物施用后30min至6h记录对机械刺激的反应，如图例中所示。

行为测试和统计分析

对8-12周龄的Myo1a KO和WT雄性进行所有行为分析。所有实验均在室温(约22℃)下进行。在所有实验之前，使动物适应其测试环境一小时。实验者在测试期间不清楚小鼠的基因型。测试动物的数量如图例部分所示。所有误差线表示SEM。依序使用双向重复测量ANOVA和Bonferroni事后检验进行所有统计分析。如Gaillard等人,2014(Gaillard等人,2014)中所述进行旷场、旋转杆、热板和福尔马林测试。

丙酮测试

使用丙酮液滴蒸发分析(Hulse等人,2012)来评估原初小鼠对无害皮肤冷却的敏感性。使用1ml注射器在左后爪上施加一滴丙酮。在丙酮施用后立即记录退缩/疼痛样行为的持续时间(秒)，总共持续2分钟。将测试重复两次并计算退缩/疼痛行为的平均持续时间。

热超敏反应

如Gaillard等人,2014所述，使用Hargreaves测试，在角叉菜胶发炎之前和之后以及在爪切割手术之后测定后爪热超敏反应。对于角叉菜胶炎性疼痛模型，在从发炎后一天开始直至60天的数个时间点(见图例)进行测试。对于爪切割疼痛模型，在从发炎后一天开始直至30天的数个时间点(见图例)进行测试。

机械阈值

如前述(Gaillard等人,2014)，在发炎、神经病和爪切割手术之前和之后的数个时间点，使用Von Frey线用上下方法(Chaplan等人,1994)确定足底表面的机械阈值。

损伤诱导的疼痛模型

角叉菜胶和酵母聚糖-A诱导的发炎

使用30G针式注射器将20μl含有1％角叉菜胶的H2O溶液(重量/体积，Sigma)或20μl含有0.06mg酵母聚糖-A在0.9％NaCl中的溶液(重量/体积，Sigma)皮下注射到左后爪足底侧。

对于角叉菜胶诱导的发炎，在发炎之前和从发炎后1小时开始直至60天的数个时间点(见图例)测定机械阈值。对于酵母聚糖发炎，在注射之前、在第1天和直至第60天的数个时间点(见图例)测量机械阈值。此外，在发炎之前，在药物施用之前和之后的第1天和第2天测量酵母聚糖模型中的机械阈值。

慢性压迫性损伤(CCI)

在氯胺酮/甲苯噻嗪(xylasin)麻醉的小鼠中，通过使用单丝(monocryl)可再吸收缝合线(6-0，Ethicon,Piscataway,NJ,USA)在总坐骨神经周围进行三个松散束缚的结扎(间距约1mm)(Bennett和Xie,1988)来诱导单侧外周单神经病。将神经压迫到仅仅可辨别的程度，以使得通过神经外膜脉管系统的循环不会中断。手术后，使动物在温暖的室内恢复，然后使它们返回其居住的笼。在CCI之前和在从手术后3天开始直至60天的数个时间点(见图例)测量机械阈值。

爪切割

如Brennan(1999)中所述进行爪切割疼痛模型。简言之，用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉小鼠，并且从与后跟的近端边缘相距2-5mm开始，对右后爪的足底面进行5mm纵向切割。然后用镊子小心地抬高足底肌肉并用刀片纵向切割，同时保持肌肉的起源完整。使用6.0丝单丝线(Ethicon,Piscataway,NJ,USA)用一种水平褥式缝合法闭合伤口，并用必妥碘(betadine)软膏覆盖伤口部位。手术后，使动物在温暖的室内恢复，然后使其返回其居住的笼。在手术之前和手术之后从损伤后6小时开始直至60天(见图例)测定机械阈值。

选择性神经损伤(SNI)

如(Shields等人,2003)所述进行选择性神经损伤手术。简言之，用氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物麻醉小鼠，并在坐骨神经三根分叉部的水平上穿过皮肤和大腿肌肉切开。使用6.0丝线(Ethicon,Piscataway,NJ,USA)结扎总腓肠和腓骨神经并横切，同时保持胫神经完整。手术后，使动物在温暖的室内恢复，然后使它们返回其居住的笼。在手术后第7、9和14天，在药物施用之前和之后测定机械阈值。

RNA提取

用氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物对小鼠进行深度麻醉，并用5-10mL RNA Later(Qiagen)经心灌注。快速解剖L3至L5DRG和SC，并根据制造商的说明使用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen)提取RNA。为了质量控制，将RNA负载到RNA NanoChip(Agilent)上并用2100生物分析系统(Agilent technology)加工。

高通量测序和分析

从来自2-3只小鼠中的每一只的实验重复样中提取WT和Myo1a KO DRG和SC RNA。使用TruSeq RNA样品制备试剂盒(Illumina)制备RNA-seq库。使用Agilent DNA 1000芯片验证所有库的浓度和片段大小。在HiSeq 2000(Illumina)上进行测序，使用RTA(Illumina)进行碱基调用，并使用FastQC(FASTQC，2010)和RSeQC进行质量控制(Wang等人,2012)。使用Subread(Liao等人,2013)(C版本1.4.6-p2)使用默认值将序列唯一地映射到mm10基因组。使用featureCounts(Liao等人,2014)(C版本1.4.6-p2)计数映射到基因外显子(GRCm38.p4基因组装)的读序。使用DESeq2 BioConductor R包(Love等人,2014)，使用5％错误发现率(FDR)截止值，使用来自生物学重复样的外显子计数进行差异基因表达。

qRT-PCR

使用Superscript III逆转录酶(Invitrogen)将从每个样品获得的RNA转变为cDNA。使用qPCR Sybr-Green主混合物(ThermoFisher)通过定量PCR(qPCR)评估基因表达。样品在StepOne qPCR仪器(Applied Biosystems)上运行40个循环。编码每个基因的转录物的相对量通过使用标准ΔCt或ΔΔCt方法归一化至β-肌动蛋白来确定。

所有实验一式三份地进行，并且数据表示Myo1a KO相对于WT的转录物表达水平的倍数变化(平均值±SEM)。用于qPCR的引物序列为：

Myo1a F：CTACGAGCAGCTTCCCATCT

Myo1a R：CCACATTTGCCAAAGCATAG

Gabra2 F：ACAAAAAGAGGATGGGCTTG

Gabra2 R：TCATGACGGAGCCTTTCTCT

Wfdy1 F：AAAGGCCGGACACTCCTC

Wdfy1 R：TGAGCTGCAGGTAGCACAGT

Nnt F：CCTGGTGGCACCTTCGTA

Nnt R：CTGAGCCCAGGTACATGATTT

DRG神经元分离和培养

将成年WT、Myo1a KO、WT：Tafa4^+/Venus和Myo1a KO：Tafa4^+/Venus小鼠深度麻醉(氯胺酮/甲苯噻嗪)，并快速解剖DRG，收集在冰冷的HBSS-glu(HBSS 1×(Gibco)、0.1M D-葡萄糖(Sigma)、50mM HEPES(Gibco)，ph7.4)中，并且使用2mg/ml 1型胶原酶(Gibco)和5mg/ml分散酶(均来自Gibco)在37℃下进行两次酶消化，每次20min。将DRG用HBSS-glu洗涤两次并再悬浮于NBc培养基(NBc:Neurobasal(Gibco)、1％(v/v)B27(Gibco)、1000U/ml青霉素(Invitrogen)、1000μg/ml链霉素(Invitrogen))中。通过穿过直径减小的3个针头(规格18、21、26)获得单细胞悬浮液。将细胞涂布在聚鸟氨酸-层粘连蛋白包被的培养皿上，并在37℃下保持1-2小时，然后添加10ng/ml神经营养蛋白4(NT4，Peprotech)和2ng/ml来源于神经胶质细胞系的神经营养因子(GDNF，Invitrogen)。通过活Venus荧光鉴定C-LTMR，并且由于其“玫瑰花结”样形态而鉴定出Ad-LTMR(Dubreuil等人,2004)。在涂布后18-30h进行膜片钳记录。

培养的DRG的电生理学

使用Axopatch 200B放大器进行电生理学记录。通过pCLAMP 10.5(Molecular Devices)分析数据。

C-LTMR和Aδ-LTMR的全细胞记录

用1至2MΩ移液管进行培养的C-LTMR的膜片钳记录，所述移液管填充有基于KCl的溶液，该溶液含有(以mM计)：134KCl、1MgCl2、4.8CaCl2、10HEPES、4Mg-ATP、0.4Na-GTP和10EGTA(pH 7.3)。用1至3MΩ移液管进行培养的Aδ-LTMR的膜片钳记录，所述移液管填充有基于KCl的溶液，该溶液含有(以mM计)：105天冬氨酸钾、10NaCl、27KCl、4Mg-ATP、0.4Na-GTP、5磷酸肌酸(钠盐)、1CaCl2、10EGTA、1MgCl2、10HEPES(用KOH调节到pH 7.2，≈329mOsm)。

使用含有以下(以mM计)的标准外部溶液以2-3ml/min的流速灌注神经元：140NaCl、4KCl、2MgCl2、2CaCl2、10HEPES和10葡萄糖(pH 7.4)。

在水中制备GABAA受体激动剂蝇蕈醇(Tocris Bioscience)的储备溶液，并以所要浓度溶解在外部溶液中。在浴槽中施用蝇蕈醇10s。

机械活化的电流

使用连接到压电致动器(Step Driver PZ-150M；Burleigh)的密封火抛光玻璃微量移液管实现机械刺激，该微量移液管与水平方向成45度角安置并用作机械探针。通过pClamp软件(Molecular Devices)驱动探针朝向细胞的向下移动。使用对于Aδ-LTMR的整个膜片钳记录相同的溶液，在-60mV的保持电位下记录电压钳制的机械活化电流。机械刺激的基线定义为诱导机械活化的电流的探针位移的距离(μm)减去0.5μm。

来自连有背根的脊髓切片的全细胞膜片钳记录

制备来自幼年(P24至P45)Myo1a KO和WT小鼠的连有背根的横向脊髓切片来进行全细胞记录。简言之，使用戊巴比妥(Pentobarbital)(200mg/kg)麻醉动物，用冰冷的含氧低钙人造脑脊液(ACSF；以mM计:NaCl 101；KCl 3.8；MgCl2 18.7,MgSO4 1.3；KH2PO4 1.2；HEPES 10；CaCl2 1；葡萄糖1)灌注，然后斩首。迅速去除脊柱和周围的肌肉并浸入冰冷的含氧ACSF中。椎板切除术后，轻轻地去除脊髓并将其腰部放入小的3％琼脂糖块中。使用Leica VTS1000振动切片机切割脊髓切片(300μm厚)，并转移到用95％O2-5％CO2平衡至少1小时的温热(31℃)ACSF(以mM计：NaCl 130.5；KCl 2.4；CaCl2 2.4；NaHCO3 19.5；MgSO4 1.3；KH2PO4 1.2；HEPES 1.25；葡萄糖10；pH 7.4)中，接着开始膜片钳记录。将脊髓切片置于用温热(31℃)ACSF洗涤的记录室中。使用多钳2B(Molecular devices)在Olympus BX51显微镜的控制下进行电生理学测量。用基于C的移液管溶液(以mM计：甲烷磺酸铯120；CsCl 20；CaCl2 0.1；MgCl2 1.3；EGTA 1；HEPES 10；GTP 0.1；cAMP 0.2；亮抑酶肽0.1；Na2ATP 3；D-甘露醇77；pH 7.3)填充膜片移液管(7-11Ω)。使用连接到Master 8(A.M.P.Instrument Ltd)刺激器的玻璃抽吸电极刺激背根。通常，使用一对高持续时间(500μs)高强度刺激(350μA)来募集记录的切片中的大多数初级传入纤维。所有药物都购自Sigma。使用Kolmogorov-Smirnov检验评估每个细胞的EPSC频率的统计学比较。

结果

损伤诱导的急性机械性疼痛在Myo1a KO小鼠中转变为慢性疼痛。

在最近的一项研究中，发明人鉴定在成年C-LTMR中富含大量Myo1a(Reynders等人,2015)。共表达分析显示，Myo1a确实在GINIP⁺/IB4^-C-LTMR中表达(图1A)，但其表达也发生在由TrkB标记的AδLTMR和AβRet⁺LTMR的子集中(图1B和1C)，并且完全排除于肽能TrkA⁺和本体感受性TrkC⁺神经元(数据未显示)。在发育水平，Myo1a在E15的大DRG神经元的子集中表达(图1D)，并且其表达在出生时延伸至大多数DRG神经元(图1E)。通过原位杂交和q-RT-PCR证实，发育过程和成年的SC中的Myo1a的表达水平几乎检测不到(图1D-G)。

为了深入了解MYO1A在感觉生理学中的作用，发明人试图分析Myo1a KO小鼠(Tyska等人,2005)。这些小鼠是活的，可育的，并且大多数描述的波动与高度表达这种非典型肌球蛋白的肠道生物学有关(Kravtsov等人,2012；Mazzolini等人,2012)。然而，对于MYO1A在体感系统中的作用一无所知。

为了测试MYO1A的缺失是否改变DRG神经元的发育，发明人进行了一系列定量和定性分析。他们发现WT和Myo1a KO小鼠之间腰DRG神经元的总数或TrkA⁺、TrkB⁺、TrkC⁺、Ret⁺和TH⁺神经元的数量没有差异(图5A和5B)。在解剖学水平上，SC切片的双重和三重染色实验显示，肽能CGRP⁺和非肽能GINIP⁺传入物的子集在SC的背角中呈现其各自板层的正常中心投影(图5C-E)。在外周，PGP9.5和S100染色揭示了所有DRG神经元和支配毛囊的(hair follicles-innervating)LTMR的正常外周目标神经支配(图5F和1G)。最后，为了测试MYO1A的缺失是否影响DRG神经元的神经元兴奋性，发明人对培养的C-LTMR和D-毛发Aδ机械感受器进行了膜片钳记录。通过将Myo1aKO小鼠与Tafa4^Venus小鼠杂交来观察C-LTMR，并通过其玫瑰花结样形状鉴定D-毛发神经元。在两种类型的神经元中，两种基因型在被动和内在电特性方面没有差异(图6A-G)。此外，他们发现从WT和Myo1aKO小鼠培养的D-毛发神经元对压电驱动的机械刺激的敏感性没有差异(图6H和6I)。这些数据一起展示MYO1A对于DRG神经元的存活、分子成熟、解剖组织和电生理学特性是非必要的。

为了深入了解MYO1A在体感中的作用，发明人在急性和损伤病状下对Myo1a KO小鼠进行了大量的体感测试。Myo1a KO小鼠在旷场和旋转杆测试中具有正常行为(图7A-C)，它们在热板测试中感知有害热刺激的能力没有差异，并且对丙酮测试呈现正常反应(图7D和7E)。接着他们测试了他们的小鼠在急性和3种不同病理学病状下的机械敏感性：角叉菜胶诱导的发炎、慢性压迫性损伤模型(CCI)(Bennett和Xie,1988)和Brennan测试(Brennan,1999)。在基础条件下和损伤后的数个时间点使用上下方法测试机械敏感性(图1F-H)。在所有三种范例中，两种基因型之间在基线水平的机械阈值类似(图1F-H)。足底内注射角叉菜胶在发炎后1小时开始诱导两种基因型的机械阈值的大幅下降(图1F)。令人印象深刻的是，发炎后三天，WT小鼠恢复到基线水平，而在Myo1a KO小鼠中机械超敏反应延长到发炎后长达60天，展示急性和可逆性发炎诱导的机械性疼痛转变为持久且不可逆的慢性疼痛。在神经损伤和术后模型中观察到相同的行为反应。在WT小鼠中，CCI诱导的机械超敏反应的显著逆转在第30天开始并且在第40天左右恢复到基线水平，但是如在角叉菜胶诱导的发炎中一样，Myo1a KO小鼠的机械超敏反应持续长达CCI后60天(图1G)。最后，在Brenan测试中，切割诱导的机械超敏反应在Myo1a KO小鼠中是不可逆的，而它在WT小鼠中持续不到10天(图1H)。使用Hargreaves测试在角叉菜胶和Brenan范例中评估热超敏反应。在角叉菜胶模型中，Myo1a KO小鼠的热超敏反应延长，但在发炎后第60天恢复到基线水平(图7G)。然而，在Brenan模型中，WT与Myo1a KO小鼠的术后诱导的热超敏反应之间没有差异(图7H)。最后，Myo1a KO小鼠在两个阶段都展现福尔马林引起的疼痛反应行为的显著增强(图7F)。总之，这些数据展示Myo1a KO小鼠倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛，并且表明这些小鼠可以用作解密触发急性疼痛转变为慢性疼痛的机制的优秀模型系统。

MYO1A的缺失特异性改变了离子型GABA能信号传导

已确定损伤诱导的慢性疼痛是由SC中兴奋性和抑制性神经传递之间的不平衡引起的，并且同时放大的疼痛可以被多种化合物如阿片样物质、GABA和甘氨酸受体激动剂、钙通道拮抗剂以及发明人最近鉴定的TAFA4瞬时逆转。为了揭示这些信号传导路径中的哪些在Myo1a KO小鼠中功能失调，发明人使用选择性神经损伤(SNI)神经性疼痛模型(Decosterd和Woolf,2000)测试了这些化合物的镇痛作用。选择SNI模型是因为其具有高度可再现性，并且还诱导持久且不可逆的机械性疼痛。他们使用这种范例显示，鞘内(IT)施用δ和μ阿片样物质受体激动剂SNC80和DAMGO(图2A)、GABAB受体激动剂巴氯芬和TAFA4(图2B)、α2δ电压门控钙通道抑制剂普瑞巴林和甘氨酸受体激动剂牛磺酸(图3C)显著逆转了两种基因型中SNI诱导的机械超敏反应。然而，与WT小鼠相反，IT施用GABAA激动剂蝇蕈醇完全不能逆转Myo1a KO小鼠中SNI诱导的机械性疼痛(图2D)。在酵母多糖A诱导的炎性疼痛模型中也证实了Myo1a KO小鼠对蝇蕈醇镇痛作用的抵抗力(Witschi等人,2011)。发明人首先显示，酵母聚糖诱导的发炎也在Myo1a KO小鼠中引起延长且不可逆的机械超敏反应(图2E)。IT施用蝇蕈醇或GABAA-R阳性变构调节剂地西泮(DZP)强烈逆转了WT小鼠中酵母聚糖诱导的机械超敏反应，但对Myo1a KO小鼠没有影响(图2F和2G)。重要的是，注射SNC80强烈逆转了两种基因型的机械性疼痛(图2H)。这些数据一起展示Myo1a KO小鼠倾向于产生损伤诱导的慢性机械性疼痛是由于离子型GABA能抑制性神经传递的选择性损害。

MOY1A的缺失使DRG和SC神经元两者中GABRA2选择性上调

已确定，GABA能抑制的丧失可以通过外周和中枢神经系统两者中的数种方式改变。这些包括改变的GABAA-R的亚基组成、改变的GABA水平、GABA释放概率和其从突触间隙中去除的速度以及将GABA介导的抑制转变为兴奋的氯化物梯度的变化(Sandkuhler,2009)。为了揭示在Myo1a KO小鼠中这些机制中的哪些受到影响，我们使用了无偏RNA深度测序筛选。对从WT和Myo1a KO小鼠的DRG和SC神经元制备的polyA mRNA的生物学重复样进行具有非常高测序深度的高通量测序(平均每个重复样112×10⁶个映射到外显子组的读序)，代表平均250×全外显子组覆盖(表1)。

表1：从WT和Myo1a KO小鼠的DRG和SC制备的polyA mRNA的RNA-seq的读序映射的总结

识别出Myo1a表达缺失后高度显著差异表达(DE)的基因(<5％FDR；<p 0.00025)，使得在DRG神经元中鉴定出98个DE基因(图3A和表2)，并且在SC神经元中鉴定出32个DE基因(图3A和表3)。

表2：Myo1a KO小鼠相对于WT小鼠的DRG中差异表达的基因

表3：Myo1a KO小鼠相对于WT小鼠的SC中差异表达的基因

虽然大多数DE基因是正常表达Myo1a的DRG神经元所独有并不令人惊讶(图1A-G)，但是有少数(14个)DE基因在DRG和SC神经元两者中是反常的，并且18个DE基因为SC神经元所独有(图3A和3B)。为了证实RNA seq数据，发明人使用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)关注了在两种组织中差异表达的少数基因。在两种组织中，Nnt、Gabra2和Wdfy1在Myo1a KO小鼠中呈现出非常显著地增加(图3C)。然而，发明人未能证实下调基因的差异表达(数据未显示)。

通过本发明人的行为实验揭示的离子型GABA能神经传递的Myo1a KO小鼠选择性改变促使他们关注Gabra2基因。Gabra2是在Myo1a KO小鼠中呈现改变的表达的唯一GABA受体亚基(表4)。

表4：

为了补充qRT-PCR结果，他们使用原位杂交和免疫组织化学。使用原位杂交，他们发现与SC相比，在DRG中Gabra2上调非常明显，其中在大尺寸神经元中具有非常强的上调(图3D)。使用免疫组织化学，他们证实Gabra2上调伴随有SC背角中GABRA2蛋白的显著增加，其中初级传入神经末梢和局部中间神经元混合(图3E和3F)。重要的是，根据GABRA2的选择性上调(表4)，他们发现两种基因型之间GABRA1(α1亚基)的免疫反应性没有差异(图3G)。最后，为了测试GABRA2上调是否影响GABAA-R功能，他们对培养的WT和Myo1a KO的表达Venus的C-LTMR进行全细胞膜片钳记录。他们发现，浴施增加浓度的蝇蕈醇在两种基因型中触发类似的电流幅度(图4A和4B)，展示GABRA2上调不会改变GABAA-R对其选择性激动剂蝇蕈醇的反应。

蝇蕈醇引起的板层II中间神经元的兴奋性谷氨酸能活性的增加在发炎的Myo1a KO小鼠中严重受损。

为了对Myo1a KO小鼠对蝇蕈醇的镇痛作用的不敏感提供合理的解释，发明人对SC切片使用全细胞膜片钳记录。首先，对急性病状下和发炎(角叉菜胶和酵母聚糖)后内部板层II神经元的大量电生理学特性的全面表征揭示WT和Myo1a KO小鼠之间没有差异(图8)。然后，他们研究了浴施蝇蕈醇对急性病状下和酵母聚糖发炎后WT和Myo1aKO小鼠中板层II神经元中的自发兴奋性突触后电流(sEPSC)的影响。在这些病状下，两种基因型之间的sEPSC的总体平均幅度类似(数据未显示)。在原初WT小鼠中，浴施5μM蝇蕈醇诱导sEPSC频率的显著增加，如sEPSC间隔累积分布曲线向左移动所示(图4C)。在用酵母聚糖发炎的WT小鼠的切片中，这种作用几乎加倍(图4E)。有趣的是，在来自Myo1a KO小鼠的原初切片中，蝇蕈醇诱导sEPSC频率急剧增加544％(图4D)。然而，这种作用在从酵母聚糖发炎的KO小鼠中获得的切片中完全丧失，因为浴施蝇蕈醇对sEPSC频率没有影响(图4F)，从而进一步支持发明人观察到的Myo1a KO小鼠在损伤后对蝇蕈醇的镇痛作用的不敏感(图2D和2F)。

结论

在这些实验中，发明人显示MYO1A的缺失将损伤诱导的急性且可逆疼痛转变为持久且不可逆的疼痛。这种疼痛慢性病对两种炎性疼痛模型，即一种神经性和一种术后疼痛模型的机械敏感性具有选择性，表明MYO1A的缺失使个体倾向于产生损伤诱导的慢性疼痛，并揭示这些小鼠是揭示触发急性疼痛向慢性疼痛转变的细胞和分子机制的理想动物模型。实际上，发明人发现MYO1A的缺失选择性地损害了离子型GABA能信号传导，因为Myo1a KO小鼠中损伤诱导的机械超敏反应可以被阿片样物质、巴氯芬、普瑞巴林、TAFA4和牛磺酸瞬时逆转，但不能被蝇蕈醇和地西泮逆转。他们还发现MYO1A的缺失导致GABAA-R的α2亚基的组成型上调，表明这种亚基的改变的表达可能参与损伤诱导的疼痛慢性病的过程。

慢性疼痛是一种严重且高度异质的医学问题，其患病率为世界人口的20％至30％(Bouhassira等人,2008；Breivik等人,2006)。鉴于只有一小部分个体产生慢性疼痛，因此假设遗传因素的作用(Belfer等人,2015；Devor,2004；Macrae,2008；Tegeder等人,2006；Voscopoulos和Lema,2010)。在本文中，发明人使用四种不同的疼痛范例显示Myo1a KO小鼠在损伤后产生不可逆的慢性疼痛，展示MYO1A的缺失与慢性疼痛产生之间的因果关系。非常重要的是，发明人发现Myo1a^+/-小鼠中Myo1a基因的一个拷贝的缺失在炎症情形中诱导了持久且不可逆的机械性疼痛，进一步支持了Myo1a作为产生损伤诱导的慢性疼痛的倾向基因的作用(图7I)。

发明人使用行为药理学显示，Myo1a KO小鼠中损伤诱导的机械超敏反应不能被蝇蕈醇逆转。这种受损的离子型GABA能信号传导进一步通过其电生理学记录证实，其中发明人显示，在急性病状下，蝇蕈醇引起板层II中间神经元的兴奋性谷氨酸能活性急剧增加，而在发炎后，这种作用被完全消除。他们还显示，GABAA-R的选择性拮抗剂荷包牡丹碱在原初WT和Myo1a KO小鼠中引起类似的机械超敏反应(图7J)，展示GABAA-R在急性病状下在Myo1a KO小鼠中发挥功能。这些数据一起指示损伤使脊髓GABAA-R从活性状态转变为非活性状态，进一步使Myo1a KO小鼠中的离子型GABA能抑制性神经传递沉默，从而导致慢性疼痛的产生。对这种现象的一个合理的解释是，损伤诱导Myo1a KO小鼠中GABAA-R的大量内化。实际上，已经在实验诱导了危及生命的难治性惊厥性癫痫持续状态(SE)的动物中观察到由内吞作用增强引起的突触GABAA-R的减少(Naylor等人,2005；Terunuma等人,2008)。有趣的是，表面受体的这种减少主要靶向含有苯并二氮杂卓敏感性亚基的GABAA-R，这解释了SE患者对苯并二氮杂卓的药物耐药性和癫痫发作的非终止性质两者。值得注意的是，发明人展示，在损伤病状下，Myo1a KO小鼠对蝇蕈醇和DZP完全不敏感，并且在这些相同病状下，损伤诱导的机械超敏反应一旦形成后，其在这些小鼠中变得不可逆转。

对观察到的表型的另一种可能解释来自发明人的RNA深度测序数据。他们发现MYO1A的缺失伴随有稳态状态下DRG和SC神经元两者中Gabra2的大量且选择性上调，指示这种改变的表达可能参与观察到的损伤诱导的疼痛慢性病。虽然他们证实gabra2上调使GABRA2蛋白显着增加，但这种增加对Myo1a KO CLTMR中蝇蕈醇引起的电流的幅度没有影响。鉴于GABRA2是唯一在DRG和SC神经元中差异表达的GABAA-R亚基，发明人的数据表明GABRA2上调可能有助于将平衡移向更多含有α2亚基的GABAA-R。在这种情况下，在大尺寸初级传入神经元中，α2/α1比率将主要受到影响(参见图3D)，因为α2和α1是DRG中表达的主要亚基。

根据这一假设，最近的一项研究表明，难治性惊厥性癫痫持续状态和难治性癫痫患者具有显著更多的含α2 GABAA-R，而含α1受体较少(Loddenkemper等人,2014)。已批准探讨含α2的GABAA-R是否比含有其他α亚基的GABAA-R易于过度内化的未来研究。

总之，虽然未解密Myo1a KO小鼠中损伤病状下损害GABAA-R功能的确切机制，但发明人描述了第一小鼠模型，其中功能丧失突变导致损伤后不可逆的疼痛状态。他们还提供了如下的有力论据，Myo1a基因应该被认真考虑作为产生损伤诱导的慢性疼痛的预测遗传因子，并指出离子型GABA能系统是促进急性疼痛向慢性疼痛转变的主要机制。发明人的研究还提供了一种有力的临床前动物模型，该模型可用于(i)深入了解触发急性疼痛转变为慢性疼痛的分子和细胞机制，以及(ii)设计“定制(à la carte)”药物疗法以预防慢性疼痛的形成。

参考文献

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序列表

<110> 艾克斯-马赛大学等

<120> 用于预测急性疼痛转变为慢性疼痛的MYO1A以及MYO1A用于治疗疼痛的用途

<130> B2197PC00

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22249

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

aatgcaaggg ggagttcaat gaaactggga catctataca catgtgaggt attattacta 60

atcactttaa tctttgggtc tctatgatag ggtctgattc atgggggaag ggaagtggag 120

aagaatttgg ggattttgtc tgcttagctc tccaagtaat ctcattaaca tcccctgact 180

cccgataaga taggaagagt aggtatgagg gaggtactgt ttttttgcta ggaagacact 240

ctttgtaaag acgtgtctcg ccatgttgcc taggctggtc tcgaactcct gggctcaagt 300

gatcctcccg ccttggcctc ccaaagtgct gggagtatag gcatgagcaa ccgcacttgg 360

ccctacctgt ccttgacaaa attcctgact tctctttggg aaatattttc cttggctata 420

aattccattc ttccagcttt catttccaaa tttgggagac aatggagcaa gaaccctcct 480

ttagttaagc ctctcagcta acgccagcca gatacccttt cctacctaga gggagcttga 540

gtgtctccct ctggggcttc aggcctgtga agggttaagt gagccacacc ctcagcagga 600

acagtctgga ctttgtgctg atcagccatc tccggcctct cctggtttga ctggcacagg 660

gagcctgggc tggaagaggc agcaaaaggg aaaatcagaa gagtggacac tggcaagagg 720

agggcagcct ttttcccagc ttccttgcac catggacagc tcccattaag ccacctctcc 780

atcctggggc caggactctt atgccccatt cctgtcaaat tgagatttca tccaccattc 840

tccaaggaca gtgaagttat accctagttc cagtgttggg tgagtcctgc cttgacctgt 900

cactgcttct ctttaacacc ttggggcgcc ccatctgggg cctcttgcct ttttcccttc 960

cccaccctca accagtcaca ttcccactcc cttcaaatcc aaatccaaag aagatgactg 1020

ctcccaaccc accttctgct tctcaccctt ccctgccaag ttagttaaaa gacttagctt 1080

tttgtaaaat ctagaaaata caaaaatagt atctacttca tggggatatt gtaagcacta 1140

aatgaattag tgtatgtaca gtgcttagag ccctgcccag ttcgtggtaa acgctgcatg 1200

attcctagag actgctatta ttgatattct tattgcttcc tcagttgtgt ccttctggta 1260

agtgacaagt gctctctttt cctagagctt ggggaaagcc aagtgaaggg agaaggaagc 1320

ctgtgcccct tcttgcccca cttccgttcc tccttcctcc gctcctccac ccgggttcag 1380

agatgcaata gcataggagg atgtgtctct ttcattcctg ttcaggagtg gccttgacca 1440

ttgtactaat aatcctgtcc tgtgcctggc cactctgcct actcagtctc acaggaaaga 1500

ctgaggaggg ccaggtttcc tccttaggga acacctgcca tgtgcctact gcatgggggc 1560

caagccccac caccctccct gtagttccaa ctgtgctcct ccttgcccac tcccgcaaga 1620

agctaggtgt gtccctctgg ggcaaagtcc atgccagaag tttacaggag tgggtgtaaa 1680

agctagagat ggaaaaatag agacagacat gtagcacatc cagaggtcct gacaactgcc 1740

tgtttgttgg ggaagcaaac cccactttca ttttctttgg gaaattccaa tctcttatgg 1800

aggaatcctg cctctatcct ctataattct gccttgtcaa gttcccattt taaaaatgaa 1860

gctcactgta gcaatgacag ggaaggagag acctttggaa gaacttctga aatggttatg 1920

ggtaggttgg gtgtctttaa taggggctgt gagaggtaag gtgttgagaa gaagcactgg 1980

gggtagatgg ggagtctgga ccctggccag ggcccattgt aggagagaga gggctttctg 2040

tacctggcgg cagcacaagt ctttgcttac actttcctcc tcagccctct ctccttcagt 2100

cacaactctg ctcccccagt tgtagcccac tgggtgcctg ccttcccctg gtggtcagag 2160

gaaggtgttc ctgttccacc cctgccccac ccccaccaac tgtaacccag gcagcagagg 2220

atctccccca cctcctgctg agagtttcag cctccctatt agcttgggct ggtccagagg 2280

cctctcctag gttgggggct ctctttaggg ccagggtagg aagagaggaa ggctcttttg 2340

gtccttctgc catcctcccc tcaaacagtt actggcccct aaagctgagt ggacatcagc 2400

aaactgtgcc tcttattccc aggatcagtg gcccctctgg acatgcctct cctggaaggt 2460

tctgtggggg tggaggatct tgtcctcctg gaacccttgg tggaggagtc actgctcaag 2520

aatcttcagc ttcgctatga aaacaaggag atttatgtga gtgtcatatg ggtgcctctg 2580

gctgtggata tgtggctgga gaggtcacag gctcccacct caccctcaag ctcattccct 2640

tcaccttctt cctggctcca gacctacatt gggaatgtgg tgatctcagt gaatccctat 2700

caacagcttc ccatctatgg gccagagttc attgccaaat atcaagacta tactttctat 2760

gagctgaagc cccatatgtg agtaggggga ccaagggaag gctgacaggg ccccagcttc 2820

ttgacactga gtcatcctaa tttcctttgt cccttcccct gaaggggctt ctccagctgc 2880

cccttccttc cctggccttc tggaggcccc ttccaaggcc tgtcacatct tgcccagtct 2940

gctccaagta gagagagtgg atgaacctgc gtgctggaga ttgagtgaaa gatggtgtct 3000

tgaactggtt tcacaatagt cattgcccac ttcctcccca caagctacgc attggcaaat 3060

gtggcgtacc agtcactgag ggacagggac cgagaccagt gtatcctcat cacaggcgag 3120

agtggatcag ggaagactgg tgaggcccct ggctggggga acacatggag tcacctctgg 3180

aactgcttcc ttgtctcttt gcaagccaga cctagacctg accctccacc ccacagaact 3240

tcctttccac tttttctgac tccaaggggt ggtgaggcac tggggtgaag caagttaagg 3300

aggtgggggg atgggctagt cctgggtggg gacccatgag agcgttttgc ctgcacagag 3360

gccagcaagc tggtgatgtc ttatgtggct gccgtctgtg ggaaaggaga gcaggtgaac 3420

tctgtgaagg agcagctgct acagtctaac ccagtgctgg agggtgagaa ttctgctctc 3480

tgccctctcc accctccatc taacccccag aatcactgag ccctagaccc tcttccccag 3540

tgctgcaaaa tcacctctct tgttcgaccc agaaaaatct gagattgtca tgaggactgg 3600

aagcccttcc tcctttccct tctctagagt ttcacttctc ccctcctcat ctctgtagct 3660

tttggcaatg ccaagaccat tcgcaacaac aattcctccc gatttgtgag taaatgtctc 3720

cccacctggg aagagaggat gtgggggctt aagagggagg aatgtggcac agaccccttc 3780

caggcagggt ggtgagaaga ggaagaagct aagtctctct ctctggtctc tctctgaagg 3840

gaaaatacat ggatattgaa tttgacttca agggatcccc cctcggtggt gtcatcacaa 3900

actgtacgtg tctccccaat tccactcacc tgtcttccac ctgcctccca tggccctttc 3960

tgctaatctg ttcctgtaga aaggcagaat gttagacgtc aaggagactt cccaaccact 4020

aggaatgccg gcgatggggg cattctccag tagggctgga gaagctacgg catctcccag 4080

gccctcagga tattattttt ctaattctct gccagatctg cttgagaaat cccgattagt 4140

gaagcagctc aaaggagaaa ggaacttcca catcttctat cagctgctgg ctggagcaga 4200

tgaacagctg ctgagtatgt gcctgcatgg ggaaagtgtc ctcatgagtg acacatggca 4260

aagtccccaa cctccattca gtcccagaac ccctgttccc tctgggcccc tacagccctc 4320

ttcccttgag cctcccagat tttccttgct gcatttccca ttctcagcct cacccactca 4380

ttgttgggaa caaattcctt tacccctgtg ttctcttcct tttctggggt tttattgcca 4440

gggatatgcc ttcttgcctc ttcactgttc tcgttcctct ttcctgcctg ggttctgctt 4500

tccctgagct ggcttcaaat ataaaacact tatatccatc tactttcctt cctaccttca 4560

acttaagggg atttaattaa agcagggaag caggcagaat gttgtaagtg ttcaggaact 4620

ttcagtgaac tctagttgaa gctgtcctgg gtctacatct gccttaccta ggaccctgtt 4680

cctgattttc ttttcattca ttcattcact cattcattta ttcattcatt caacatctct 4740

tgaacaccta tgatcaaata ttatgctagc ctctagggat acagagttga gtaagacatg 4800

accctgtcct cgaagaactt atagtcttct agggataaga ggtgtgtgag cagatccatt 4860

gtaatattgt gtgatcgggg ccatcaggcc tgtgcagctg gctataagag cagaagacct 4920

agagcccctt ggcttggcct ggggaagggt ccatcacagc ctggatgctg gactggcctg 4980

aagtggctct gggtgggcat cactggagtg tctggtggac tttaagccct actggagttt 5040

gcctcccaat ctcctctctg gctgtgagca ccgtgggtgt ctggccccta agaatgtctc 5100

tttggtttct ggtgattcta tgatagacct gtgctatctc cttttccact cttggagatc 5160

tctgtgatct tcaggaaccc ctgcagatct catgctcttt cctggcttaa tagttttggt 5220

tatgttcaac ttgtctgcat catgggcatt agtgtcttgt tctggttggt ctgtcatcta 5280

ttggtttaaa tcaactctag atgaggtctc ccaggtatca tcatccccag acattctgac 5340

tcattctccc tccagatacc ctccttagca ggcccttgtt tcaaactttg tgtgctgggg 5400

gagctgccat tagactatag tttgagggat actccctgat tctcagatca tttgcatacc 5460

agataattga catccctcaa actccatgat taaccgaatc cctcccatcc tagggaaaca 5520

gctttgatca ttcacttgat tcatttatta aaaagagaaa atttcctgca tgccagaaag 5580

gcacacagaa tatggagatg agaaacacag tcccaaccca caagttgctc atttatggga 5640

gagacagaaa aaaacaaaac ctagcccata tgatatgggc tgggatatag attcaccagt 5700

ggggaatgca agacagccat ttggctcagg ccctcagcat cagagaaaac ttttcagaag 5760

aggtgtcagg gtcagggaac atgctacctg ccactttatt ggtgtttggt gttcaaacaa 5820

tgaatgagca acccacgcca agagttgagg ctgggggcag gcaggagata tgcgcttacc 5880

cttctcccct taccttcacc gtccagaggc acctgcgtag gatggaaggg ttgcttgttt 5940

atttttattg tttagaaccc tgagggtagg gagaagagta aaatgagggt tttgtttcat 6000

aaaagttggg ggaaaaccca atcaatatga gcatcaaaac cctaaacact acttaaaagt 6060

atacttaaaa atttagtctg ttaggccgag tgactcatgc ctgtaatccc agcactttga 6120

gaggccgagg cgggtggatt gcttgagtgc aggagtcaag accagcctgg ccaacataga 6180

gaaaccccat ctctactaaa aataccaaaa ttagccaggc gtggtggcat gcacccatag 6240

tcccagctac acaggaggct gaggcatgag aatcacttga acctgggagg tggtgcttgc 6300

agtgagctga gatcgcacca ctgccctcca gcctgtgtga cagagtgaga ccctgtctca 6360

acaacaacaa aaattagtct atcatcacag gaattaatga tcccaaaaca aaggaggcag 6420

gggaagaacc caaaacaaaa atgactcctt tggataagtg aatgaatcca ttagggcaag 6480

ggctgtgagg tgtcaaggct ggagggctcc agagagcctg ggtactaacc atcttcccca 6540

acactggccc tcccagaggc cctgaagctt gagcgggata caactggcta tgcctatctg 6600

aatcatgaag tatccagagt ggatggcatg gacgacgcct ccagcttcag ggctgtacag 6660

gtgggtgccc agggtgaggc aggcttgggc ccttaggtca tcctctattc gcattggact 6720

ggcaccaaca gttcagcttt tgatttctgc tttctgccta agagtgcaat ggcagtgatt 6780

gggttctcgg aggaggagat tcgacaagtg ctagaggtga catccatggt gctaaagctg 6840

gggaacgtgt tggtggctga tgagttccag gccagtggga taccagcaag tggcatccgt 6900

gatgggagag gtctgcatcc cagcctgctg gagctcctac ccagaccctg aatttcctac 6960

tacaagtcgt gtccttctac catctctagc ataattgatc tcaccctgat gcagtcccac 7020

tcagcccact cctgagttct cccctaaaca gactcactga gaactcccga tgaagcatat 7080

tggaatgagc ttttgaaatt tgatatatct aggtctggaa attctctgag tctgagttga 7140

ttcttctgca gaatggggat aatcacacct aattcaggag attctcatat taaagtagat 7200

gatacatgca aaatgcccag atcccctttc ttctgtcccc caactccctg agattcctcc 7260

agggccatgt tctgggttgg ctgcaatgac ttctccagtg agaccccagg acaccagtgt 7320

ctcaggcagt ttcacttatc agattgcact ccctcccctg agagaaagct gcctctaagg 7380

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tggaaatgcc cactaagaaa cactaatatg ctgggtgtgg tggtccatgc ctgtaatccc 8040

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atctctttct atgcccttct ctaacatctc agagtccttg gtctcccccg ggccctagct 9960

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aggacctatc ctaattctgg aggacgtggg tcaggctgga tgggaagacc cacctggaag 15000

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cagccatcac tgccatccat ctccatatgc gtttttcatc accccaaact gaaactctgt 19980

acccattaag caataacccc ctattctccc attcccctag cccctgatat cttataatct 20040

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agaaggtcaa tcgtggcaat ggcaaggtaa gggcctgcag gctgaactcc tcccgcagct 21060

agtgcagagc tgtgggctgg catctggaga gcagatggca ggctgtgttt gcgccctgcc 21120

aggtggagtg ggggcaatta atcctgcctt tcctcaccct tgcctgttcc gtccctagac 21180

ttcttctcgg attctcctcc tgaccaaggg ccatgtgatt ctcacagaca ccaagaagtc 21240

ccaggccaaa attgtcattg ggctagacaa tgtggctggg gtgtcagtca ccagcctcaa 21300

ggatgggctc tttagcttgc atctgagtga ggtatcagag ctgggtgggg caagccttgg 21360

actggagaag gtggtatgca tcccagggct ggggcaggct ggaggtgatg gggaccagac 21420

ctttcgctct gggcctttga tgtccctcag gtgctcctga agagaaaaaa tgaatccctt 21480

tcctgctatt tttccctctt cctaagatgt catcggtggg ctccaagggg gacttcctgc 21540

tggtcagcga gcatgtgatt gaactgctga ccaaaatgta ccgggctgtg ctggatgcca 21600

cgcagaggca gcttacagtc accgtgactg agaagtgagg ccatgaactg ggggtgaggg 21660

gcggcttacg gtagatggcc aggctgatgg tcatcgtgac caggatcaga aagcgaagca 21720

tgtagggcag tgcaggccgg ggcttggagg tgtttctcag gcccccaccc aggttctctg 21780

gggcctcaag tcctctgact cgcatgatgg gggggccatc atggaaatgc gggagtcggg 21840

gtgaggggat gggcactaga cttggttttc tgttccctct ccaggttctc agtgaggttc 21900

aaggagaaca gtgtggctgt caaggtcgtc cagggccctg caggtggtga caacagcaag 21960

ctacgctaca aaaaaaaggg gagtcattgc ttggaggtga ctgtgcagtg aggagggggc 22020

accatgcaga gatggcagtt gcttcctcct gaaccagcac taatccccct ctgccctcct 22080

gtgtgggagg atctctaacc cctctgatcg tggcgcatgg cttggggatt aaactaccct 22140

tgaagaggac ccttgtccca aacccttctt gttctctcct ccaaaagtag cttcctccaa 22200

cccgcagcct ctctgcacac taataaaaca tgtggcttgg aaaggttca 22249

<210> 2

<211> 1043

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Pro Leu Leu Glu Gly Ser Val Gly Val Glu Asp Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Glu Pro Leu Val Glu Glu Ser Leu Leu Lys Asn Leu Gln Leu Arg Tyr

20 25 30

Glu Asn Lys Glu Ile Tyr Thr Tyr Ile Gly Asn Val Val Ile Ser Val

35 40 45

Asn Pro Tyr Gln Gln Leu Pro Ile Tyr Gly Pro Glu Phe Ile Ala Lys

50 55 60

Tyr Gln Asp Tyr Thr Phe Tyr Glu Leu Lys Pro His Ile Tyr Ala Leu

65 70 75 80

Ala Asn Val Ala Tyr Gln Ser Leu Arg Asp Arg Asp Arg Asp Gln Cys

85 90 95

Ile Leu Ile Thr Gly Glu Ser Gly Ser Gly Lys Thr Glu Ala Ser Lys

100 105 110

Leu Val Met Ser Tyr Val Ala Ala Val Cys Gly Lys Gly Glu Gln Val

115 120 125

Asn Ser Val Lys Glu Gln Leu Leu Gln Ser Asn Pro Val Leu Glu Ala

130 135 140

Phe Gly Asn Ala Lys Thr Ile Arg Asn Asn Asn Ser Ser Arg Phe Gly

145 150 155 160

Lys Tyr Met Asp Ile Glu Phe Asp Phe Lys Gly Ser Pro Leu Gly Gly

165 170 175

Val Ile Thr Asn Tyr Leu Leu Glu Lys Ser Arg Leu Val Lys Gln Leu

180 185 190

Lys Gly Glu Arg Asn Phe His Ile Phe Tyr Gln Leu Leu Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Glu Gln Leu Leu Lys Ala Leu Lys Leu Glu Arg Asp Thr Thr Gly

210 215 220

Tyr Ala Tyr Leu Asn His Glu Val Ser Arg Val Asp Gly Met Asp Asp

225 230 235 240

Ala Ser Ser Phe Arg Ala Val Gln Ser Ala Met Ala Val Ile Gly Phe

245 250 255

Ser Glu Glu Glu Ile Arg Gln Val Leu Glu Val Thr Ser Met Val Leu

260 265 270

Lys Leu Gly Asn Val Leu Val Ala Asp Glu Phe Gln Ala Ser Gly Ile

275 280 285

Pro Ala Ser Gly Ile Arg Asp Gly Arg Gly Val Arg Glu Ile Gly Glu

290 295 300

Met Val Gly Leu Asn Ser Glu Glu Val Glu Arg Ala Leu Cys Ser Arg

305 310 315 320

Thr Met Glu Thr Ala Lys Glu Lys Val Val Thr Ala Leu Asn Val Met

325 330 335

Gln Ala Gln Tyr Ala Arg Asp Ala Leu Ala Lys Asn Ile Tyr Ser Arg

340 345 350

Leu Phe Asp Trp Ile Val Asn Arg Ile Asn Glu Ser Ile Lys Val Gly

355 360 365

Ile Gly Glu Lys Lys Lys Val Met Gly Val Leu Asp Ile Tyr Gly Phe

370 375 380

Glu Ile Leu Glu Asp Asn Ser Phe Glu Gln Phe Val Ile Asn Tyr Cys

385 390 395 400

Asn Glu Lys Leu Gln Gln Val Phe Ile Glu Met Thr Leu Lys Glu Glu

405 410 415

Gln Glu Glu Tyr Lys Arg Glu Gly Ile Pro Trp Thr Lys Val Asp Tyr

420 425 430

Phe Asp Asn Gly Ile Ile Cys Lys Leu Ile Glu His Asn Gln Arg Gly

435 440 445

Ile Leu Ala Met Leu Asp Glu Glu Cys Leu Arg Pro Gly Val Val Ser

450 455 460

Asp Ser Thr Phe Leu Ala Lys Leu Asn Gln Leu Phe Ser Lys His Gly

465 470 475 480

His Tyr Glu Ser Lys Val Thr Gln Asn Ala Gln Arg Gln Tyr Asp His

485 490 495

Thr Met Gly Leu Ser Cys Phe Arg Ile Cys His Tyr Ala Gly Lys Val

500 505 510

Thr Tyr Asn Val Thr Ser Phe Ile Asp Lys Asn Asn Asp Leu Leu Phe

515 520 525

Arg Asp Leu Leu Gln Ala Met Trp Lys Ala Gln His Pro Leu Leu Arg

530 535 540

Ser Leu Phe Pro Glu Gly Asn Pro Lys Gln Ala Ser Leu Lys Arg Pro

545 550 555 560

Pro Thr Ala Gly Ala Gln Phe Lys Ser Ser Val Ala Ile Leu Met Lys

565 570 575

Asn Leu Tyr Ser Lys Ser Pro Asn Tyr Ile Arg Cys Ile Lys Pro Asn

580 585 590

Glu His Gln Gln Arg Gly Gln Phe Ser Ser Asp Leu Val Ala Thr Gln

595 600 605

Ala Arg Tyr Leu Gly Leu Leu Glu Asn Val Arg Val Arg Arg Ala Gly

610 615 620

Tyr Ala His Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Phe Leu Glu Arg Tyr Arg Leu

625 630 635 640

Leu Ser Arg Ser Thr Trp Pro His Trp Asn Gly Gly Asp Arg Glu Gly

645 650 655

Val Glu Lys Val Leu Gly Glu Leu Ser Met Ser Ser Gly Glu Leu Ala

660 665 670

Phe Gly Lys Thr Lys Ile Phe Ile Arg Ser Pro Lys Thr Leu Phe Tyr

675 680 685

Leu Glu Glu Gln Arg Arg Leu Arg Leu Gln Gln Leu Ala Thr Leu Ile

690 695 700

Gln Lys Ile Tyr Arg Gly Trp Arg Cys Arg Thr His Tyr Gln Leu Met

705 710 715 720

Arg Lys Ser Gln Ile Leu Ile Ser Ser Trp Phe Arg Gly Asn Met Gln

725 730 735

Lys Lys Cys Tyr Gly Lys Ile Lys Ala Ser Val Leu Leu Ile Gln Ala

740 745 750

Phe Val Arg Gly Trp Lys Ala Arg Lys Asn Tyr Arg Lys Tyr Phe Arg

755 760 765

Ser Glu Ala Ala Leu Thr Leu Ala Asp Phe Ile Tyr Lys Ser Met Val

770 775 780

Gln Lys Phe Leu Leu Gly Leu Lys Asn Asn Leu Pro Ser Thr Asn Val

785 790 795 800

Leu Asp Lys Thr Trp Pro Ala Ala Pro Tyr Lys Cys Leu Ser Thr Ala

805 810 815

Asn Gln Glu Leu Gln Gln Leu Phe Tyr Gln Trp Lys Cys Lys Arg Phe

820 825 830

Arg Asp Gln Leu Ser Pro Lys Gln Val Glu Ile Leu Arg Glu Lys Leu

835 840 845

Cys Ala Ser Glu Leu Phe Lys Gly Lys Lys Ala Ser Tyr Pro Gln Ser

850 855 860

Val Pro Ile Pro Phe Cys Gly Asp Tyr Ile Gly Leu Gln Gly Asn Pro

865 870 875 880

Lys Leu Gln Lys Leu Lys Gly Gly Glu Glu Gly Pro Val Leu Met Ala

885 890 895

Glu Ala Val Lys Lys Val Asn Arg Gly Asn Gly Lys Thr Ser Ser Arg

900 905 910

Ile Leu Leu Leu Thr Lys Gly His Val Ile Leu Thr Asp Thr Lys Lys

915 920 925

Ser Gln Ala Lys Ile Val Ile Gly Leu Asp Asn Val Ala Gly Val Ser

930 935 940

Val Thr Ser Leu Lys Asp Gly Leu Phe Ser Leu His Leu Ser Glu Met

945 950 955 960

Ser Ser Val Gly Ser Lys Gly Asp Phe Leu Leu Val Ser Glu His Val

965 970 975

Ile Glu Leu Leu Thr Lys Met Tyr Arg Ala Val Leu Asp Ala Thr Gln

980 985 990

Arg Gln Leu Thr Val Thr Val Thr Glu Lys Phe Ser Val Arg Phe Lys

995 1000 1005

Glu Asn Ser Val Ala Val Lys Val Val Gln Gly Pro Ala Gly Gly

1010 1015 1020

Asp Asn Ser Lys Leu Arg Tyr Lys Lys Lys Gly Ser His Cys Leu

1025 1030 1035

Glu Val Thr Val Gln

1040

<210> 3

<211> 23212

<212> DNA

<213> 犬（Canis lupus）

<400> 3

gcggattccg ggcctggaga acaggagacc tgggttctgg ttccagctcc gccaggttgg 60

cagtggtgtg atcctgggaa aggggcttct caccctaggt ctgttttctc cctgtgaaac 120

agaggatctg tagtcctttt tgcctctgac acagaggctg cttccactta cacctgggat 180

tatgtgctga tggcacttcc actggcttcc tcctcacttt ctctttccct tgcctttttt 240

ctcccttcag atatatatag gagatcaata aatcatgtaa gggcaggttg ataatggaac 300

tgctgatggg ccagtcatct gcagagtgct tctatgagag cagtaaagtt tggaccttga 360

accaagcagc tgtggctggg agttggagga tccagtctct ttgcagctaa gtgtgtgtaa 420

tgacccattt gctctttgtg catgcctggg agagagtacg gtaggcagag ggagcctgtt 480

taggaatttt cctgggtgga tgagggggta ccctggtgaa taggattgta taagctcctt 540

atctattgga ggcagctatt tccagctggg ttagtacccg ggaagcagca tatcagggtc 600

tcattcaggt tcctcataca gaaggattaa aattaggaat accaagattt gggctcaaag 660

ctgtggccaa ctgagggtca ggaagctgca ttctgttcct gccacatact gtctgtggaa 720

cctctctgag cctcagtctc tgccgctaat tttcattttc aatggagtga gtagctgcac 780

tgcctagctc acagggtggt gtgattcagt gagatgatac aggtgggaat cggtgagctg 840

acatcgatac aaatgctggg tggtattact aactatagtg tttgggtctg tttgtggggg 900

ctgactcgtg gggggggagg ggaatttggg gattttatct gcttggttcc cccaagtaat 960

ggtaatgtca ttaataccct ctgacttggg atccctgggt ggcgcagcgg tttggcacct 1020

gcctttggcc cagggcgcga tcctggagac ccgggatcga atcccacatc gggctcctgg 1080

tgcatggagc ctgcttctcc ctctgcctgt gtctctgcct ctctctctct ctctctgtga 1140

ctatcataaa aacaaacaaa caaacaaaaa aaccctctga ctcccaatga gataggaagg 1200

tttgaggcaa gtactgtttc tttgctagga agacacccca gcctaccttc ctctgacaac 1260

atttctgact ttttggaaaa gctttccctt ggctataaat cccactcttg ctcttatttc 1320

caaatttggg gggcagtgga gcaagatgtc tacctgagcc cagccaaata ccctttccta 1380

cctagaaggg gttttctcat gtcaccgagc atctccctct ggggcttcag gcctgggaag 1440

ggttaatcga gccacaccct cagcaggaac agcctcggac tttgtgctga gcagccatct 1500

ctggcctctc ctggcttgat tggcacaggg agccttggtt ggaggaggca gcacagtgga 1560

aggtcagaag cgtggacact ggcgagagga gggaaacccc tttcctggcc tcttggacac 1620

catggacagc tcccattaac gaggatacct ctccattctc cgggccttga gactcctatg 1680

cccccttcct gtcaaattgg gatttcattc accattctcc aagggacacc ctagctccgg 1740

tgttgggtga gtcttaccct aacctgtcac tgctctgcac atcttggggt gccctattct 1800

ggggactgct tctttttccc cttccctccc tccaaccaat cacattccca ctcccctcaa 1860

atccaaatcc aaatccaagg aagatggctt cttccagccc tgcttctact gctcaccatt 1920

gcctgccccg ttacttaaga acttaacttt tattttttaa tctgaaaaat gtgggatgat 1980

aataataact acttcaaggg aatattgttt gtaagcatca aatgaattca tatatgtagt 2040

gtttagagcc ttgcctggcc catggtacct gattgtcaga gattgctatt gtcactattc 2100

tttttttttt ttttttaaag attttattta ttcatgagag acacacacac agagaggcag 2160

agacgcaggc agagggagaa gcaggccccg tgcagggagc ctgatgcggg actcgatccg 2220

gggactccag gaccatgccc tgaaccagaa gcagacgcct aaccactgag ccacccgggc 2280

gtccctattg tcactattct tattgctctt agttttgtcc ttccaagaag tgacaagtgc 2340

tctcattttc tggaacttgg ggaaagcaga gtgaaggctg aaagtagcca gtgttcccct 2400

cttgccccac cttccatttc ttcttccctc ccctcccccg ccaggtttag cattgctgga 2460

gactggaagg atgtggcttt tttatttctc ttagggagta gccctgacca ttgtactaat 2520

gattctgttc tgcaccaggc caccccacct actcagtccc acaggaaaga ctgagggggg 2580

ctgggcttcc tctagaggtt acaactgcca tgtgcccact gcatggggac tgagcctcac 2640

aatgactctg ctcctcctag cccactccca ccagctacta aaaagctagg tgtgtccctg 2700

tggggcaaag tccatgccgg aaggttacag caatgggtgt aaaagctgga gatggaaaaa 2760

cagggacaga catataggca tatacagaga tcgtgacagc tacttgatgt tggagaaacc 2820

aacctaatgt ttgtttagga tattctaatc ttttttaaaa aatatatttt attatttatt 2880

tgagagagaa tgtacgtgag cagggaggag gggcagaggg agagggacaa gtaaactcct 2940

tgctaagcag ggggctggac atggggctcg tcccaggacc ctgggactca tagacctgag 3000

ctgcaggcag atgctccatt taattatttt ttaagattta cttatttatt catgagagac 3060

agagagaggc agagacacag gcagagggag aagtaggctc cctgcaggag cctgatgtga 3120

cacttgatcc caggaccccg ggatcatgag ctgagccaaa ggcagacgct caaccaccga 3180

gccacccagg caccccaagg agcaggagat tctcctcact ggaggagagt ttccacaact 3240

tcccacagct agcttgggct agtccagagt ccaccttggg ttgaggactc tctagggcta 3300

agagttggag aggaaggctc ttaggtcctt ctgcccactt ccccccacac agctactggc 3360

ccctaaagct gaggagactt cagcaaactg attcctctat tctcaggatc ctctggccat 3420

gaatctcctg gaaggctctg tgggggtgga ggaccttgtg ctcctggaac ccctagaaca 3480

ggagcctctg ctcaagaacc tccagctgcg ctatgaaagc aaggagattt atgtgagtgc 3540

atctgggtgc ccctggctgg gggtgtgtgg ccagagagtt catgggctcc tatcccttcc 3600

tccccctcca aacaccccct acccccccac ccctgctcat tctctttacc tttttttggc 3660

tctagaccta cattgggaat gtgttgatct cagtgaatcc ctaccaacaa ctgcccatct 3720

atggcccgga gttcattgcc aaataccagg actatacctt ctatgagctg aagccccata 3780

tgtatgtaaa gtggccaagg gaaggctgac cgggccccag cttcctgaca gcgacacacc 3840

ctagtttcct tcatcctttc tcctgagggg gggctctcca gcctccccct tcccccctgg 3900

ccccaggaag cccctttcct agacctacca ctgcctcagt ctagtccaag tgaggaggga 3960

ggatgactct gggggctgga gatggagtga aagctggtgt cttagattaa ccccaccttg 4020

gtcatcacct gcttcctcca cccaagctac gctttggcaa atgtggcata ccagtcgctg 4080

agggaccgag accgagacca gtgcatcctc atcacaggcg aaagcggagc tggcaagacc 4140

ggtgaggcgc ctggctaggg gaggctgtgc aatccctgct agaactactc cctcttctct 4200

ttctctttcc aagccaggcc tggtcctgcc ccaccccaga aattccttct cggcttgtct 4260

gatcctgagg gctgtgaggt gcgggactta aggggcatta aggagggtgg tggggatcca 4320

tgtgaaggtt tctctttcac agaggctagt aagctggtga tgtcttacgt ggcggctgtc 4380

tgtgggaaag gggagcaggt gaactccgtg aaggaacagc tgcttcagtc aaacccggtg 4440

ctggagggtg aggattccag tctctcttgt gcaccccagc cctaccctac tggccccaga 4500

gacactcagc cctgttctca ttctgcctgg aaaatctgag actggcatga tggctagaag 4560

accttcctcc ttccccttct ccagagcccc cctctcccct ccgatctcct cacctcccct 4620

ctctccatct ctgcagcttt tggcaatgcc aagaccattc gcaacaacaa ctcctctcga 4680

tttgtgagtg atcatctccc tggcctgaga ggagagggtg tgggggcttg agaaggaggg 4740

atgtggcaca gaccctgccg gacagggtgg tgagcagagg aagaagcaag gtctctctct 4800

ctttctctct ctctctctct ctcacctctg aagggaaaat acatggatgt tgagtttgac 4860

ttcaagggat cccccctcgg tggtgtcatc acaaactgta tgtgtctccc catgctgcca 4920

accacctctc tcgcctccct ggcccacagt tccctctttg cccatttgct atcgtgggaa 4980

ggaacagtag gctggcagga gactgcccag gcacggggga tgccagcgcc gagggcagac 5040

ttggagggaa gcggtggcgt ccccccgttc ctcaggatgc tattttctaa ccccttctgc 5100

cagatctgct tgagaaatcc cgagtggtga agcagctcaa aggagaaagg aacttccaca 5160

tcttctatca gctactggcc ggagcggatg cacacctgct gagtatgtgc ctgtcccaga 5220

cacacaacag aagagcccca acctccgttc agtccctaga gccttgggcc cctctgggtc 5280

cctgcagccc tcattcctct tcctgcgctc ctcactcagc atctcatctg ctcattgttg 5340

ggaacaatcc cctgacctct gtgttctctt ctttttcggg gattgtattg ctaggaagaa 5400

gccttcttgc ctcttgacct cctcttactc ctctctcctg cttgggttcc tctttcccca 5460

ggctggcttt aaaagcagaa cacttatttc catttttcat tctttcctac cttcaattta 5520

agggactttt ttgatagctc agcagaaaat catgcaggat attataagtg gtcaggaact 5580

tttgatgagc tggagttgaa gttgttctgg gtctacctcc acctcatcca ggccctggcc 5640

ctggtttact cttcttagat ggttttatgg gggttccatt tattcattca tcaaacatct 5700

cttgaacact tactgtgatg gaacattgtg ctagtctcta gcgattcaga agtgaatatg 5760

acatggaccg tgtcctcgag aacttgtggt cttccaggga tggcagatgt gtgagcagaa 5820

acactgcaaa atacagtgtg atcgagtgcc aacaggtctg tgcaggtggc tatgggaggg 5880

gaagtcacgg aacactctgc ttgtcccagg gagccctgga tcctcgatgg gcccaaggtg 5940

gctctgggtg ggcatcactg cagagtctgg tgggacttca ggccttgcca gagtttgcct 6000

cccaatcctg cctctagctg tgagcactgt gggtatctgg ccccaaggac ctgtcgattt 6060

ggcttctggt tgttttctgc tggacttgta tctatctcct ttcccttcct ggggatttcc 6120

gtggtttgag agcccctgca ggtctcatta ttccttcctg gctcagtggt cttggttgtg 6180

ttcagtgtgt ctgaatcata ggcactagta ccttgttctg gttgattctg ttacccattg 6240

atgtaagcta agtctggctg ggacctccct tgtgtcatca tccctttctg actcattctt 6300

tgtccagata cctctcttta gtaggttcct gtttcaaaat ttgtgtttct ggggaagctg 6360

ccattaaact gtagtttgag ggatattccc tgattctcag atcatttgaa taacagataa 6420

ttgatatcct tcaagctcca tgcttaacct attccttccc atctcaggtg aacagctttg 6480

actgttccct tgattaaaaa gaaagaagtt tgtacatgcc aggcaggcac acagagtatg 6540

aagattaaaa tgtcccaatg ctcaagttgt tcatttgtgg gagagacgga aaaaaacaaa 6600

aacctagccc atgtgttatg ggttgggata gagatccacc atggggatca caagagaacg 6660

gctcagcccc acaacgtcag agaaaatctt ccagaagagg ggtcaggatt ggggaacata 6720

gcatctgcct tttgttggcg cttagtgaac aaataatgaa tgagctaact ctggccaacg 6780

gtaagatgtt gaggctggat aggagatatg cgcccgccct tctttcctca cctttgtcct 6840

ctcagagcct ctgagaactg agcagggtgg agagtttgct tatttatttt tattgtttag 6900

aaactgaagg tgggaagaag agtggaatga gtcttttctt tcataaaagt cggaagaaaa 6960

ccccaacaat taagaacatg caaaccctaa atactgctta aaaatttagt ctattattgt 7020

ggaaactaat gatccccaca caaaggaggc tggggcagag cctaaaacga aaatggttcc 7080

tttgaatgag caagtaaacc aagccagggc aggggctgtg agcgtcaagg ccagaggact 7140

cctgagagct ccgagtacta accttctcct cacactggcc ctcccagcgg ctctaaagct 7200

cgagcgagac acaagtggct atgcctacct aaaccagaaa gtgtccagag ttgacggcat 7260

ggacgacgct gccaacttca aggctgtaca ggtgggtgcc tggggtgggc ccttaggctg 7320

tccccggagc ccaggatttg gctttgagaa gggaggcgtt gagctggcac cgcacagttc 7380

agcttctgat ttctgctctg tcctcaagag tgcgatgatg gtgattgggt tctcggagga 7440

ggagattcag cgggtgctag aggtgacggc cctggtgctg aagctcggga atgtggagct 7500

ggcagacgag ttccaggcca atggcgtgtc agccagtagc atccgggatg ggaaaggtct 7560

gtaccgccct gctggtacct gtctcctgca acaccaggtg gctccttgaa gctcctacta 7620

caatttctat tttttcacca tctcctgtgt aactgacttc actcccattc ggtgtcactc 7680

agcctgttcc tgagttcttc cccaaacaca ctcatggaga atccccaggg aggcatttgg 7740

gaatgaggtt atgaagtttg atagacctac attctgggac ctctctgagt ctccctggag 7800

tctttgcaaa gaacctcagg agattctcct cgtaaagcag ataatgcact cagtgtccag 7860

agctccctct ctcttctcct cctcagagat ttctcctggg ccatgctctg gatgggctgt 7920

aaggacattc tcagcaagac ccaggggcac ttgtctccca gcagtgtcat gtctcagccc 7980

ccctccctct ctgggaggga atcccttttc caggccatgc tgtatttcct ccccacccca 8040

ggtattcagg agattgggga aatggtgggt ttgaattcag aggaactaga gaaagctttg 8100

tgctcaagga ccatgaaaac agccaaagag aaggtagtca ctgccctgaa tgtcatccag 8160

gtaaggtccc tatgggagga gggtgatttg gggacccttc tgtggctgcc atcctaatga 8220

gctggctctg ccctgcaggc tcagtacgct cgcgatgctc tggctaagaa catctacagc 8280

cgccttttca attggatagt gaatcgaatt aatgagagta tcaaggtaag agattactct 8340

cctccctcct gtctgcctca cctttcttgc cctggtcacc actcccatac tttgggttct 8400

gagatgaaca gagtaagaag gatgaatggt aggatacagt tcctcccaat agtgcattgt 8460

tgtggaaaca tctctggttt tttgagtttg actctctgga tcccctactt accagctgtg 8520

tggcctttca gtttcacaga gattctgagc ctcagtttcc tgatttggaa aattggacac 8580

taatgcctac ctgtttcaca gggcttagtg aggatcagat gaggatcaga tatcagaaat 8640

tccacaccca gatatatatt taagatatat atctaagaga tttgaaaaca ggtgtccact 8700

taaaaaccgt acccatgggg atccctgggt ggctcagcgg tttagcacct gcctttggcc 8760

cagggcacga tcctggagtc ccaggattga gtcccacgtc gggttcctgg catggagcct 8820

gcttctccct cctcctgtgt ctctgcctct ctctctctct ctctcatcaa tcaatcaatc 8880

aatcttaaaa aaaaaaaaaa aaacagggat ccctgggtgg cgcagcggtt tggcacctgc 8940

ctttggccca gggcgcgatc ctggagaccc gggatcgaat cccacatcgg gctcctggtg 9000

catggagcct gcttctccct ctgcctatgt ctctgcctct ctctctctct ctctctctct 9060

gtgtgactat cataaataaa aaaaaaaaaa aacagtaccc aaaagttcat agaggcatta 9120

ttcatactag ccaaaaagtg gaaatgactc aaatgtccat ccgttgatga tagataaaca 9180

aaatgtggta tattcatata atgggatatt atctggccat aaaaaggaaa gaagtactaa 9240

ttcatcctca acatggataa accttgaaaa catacaagga ggagaagcca gacacagggc 9300

acatattgga tgattccatt tatataaaat gtccgaatag acaaatccat ggagattagg 9360

aatagattta tggttagcag ggacttaggg gatgggaagt tggagtgact actaatgggt 9420

atgggtataa gatttctttt tctttttttg gggggggtat aagatttttt ggggggatga 9480

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aaggcagcag gagaaaatag gatttgaatc taggtttggg taaacgctta gccctcttga 9720

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gtggcctgcg gcacgctgtg agccagattt agcagggaca tttctcttgg ccttgtcacc 11160

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ctggctgatg tcagcgtccc ctcttgtagc accctgatcc cagacttcct cctcagacgt 11280

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tcttttaatt ttaaaaattt aaacgatcag atacagaata cattcctata cttccaaatt 11580

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cattcttttt tttttttttt ttaatacatc tgaggttagg ctgctaggat tttttttaaa 12120

ttttatttat ttattcatag agacacacac agagagagag gcagagacac aggtagaggg 12180

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aactggagat agatggtggg tgaggaagtc tgttctcggc aggggctttg tccctgggac 14940

ctgaatcctc gggctaccac cctgccctga gccctggcag ttaggtgctt gcacggttca 15000

ccctgagtgc ctctagctga actaggactc ttgaggctcc gggggatgtg ccactcctgt 15060

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agctgttctt cctggaagag cagcggcgcc tgcgcctgca gcagctggcc acgctcatac 15300

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tcctcatctc ctcctggttt cggggcacca tggtattggt caccccccag tctgatcccc 15420

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gctttaagcg ccctcctctt ggccaacgtg tctgcctgta cactctccct ccagcaccag 15900

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gaagccagga catcaaacta tgggcagttt ccagtgagag gaaagcagac agaggaggct 16860

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gctgttgggt ttagactaat atctcattga atcacaaccc ctgcagaagc atgcatacag 17460

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tggtaagtgc aagagagctg ggatacaaac tctttgactc cagagtttta acgcctgcct 17760

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agatacatgc ttaagtttta gggaaaaaaa tgtcatgatt tctataacct actttaggat 18780

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tgggttgtct cctttcccac ccccagtaga gtgtaagtaa gctcaatggg aatagagacc 19560

ctgctctgtt cattgctgtg tctccatacc tagaacagtg tcaagcatag agcagacact 19620

caataaatgt ggaatggtga gggaaaaaaa actcagctgg ggatccagac ccccaaggac 19680

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ctgaagcaca ctccgtcagg gcaaggctcg gaggtgcttc ttagtctccc cacccaagtt 22560

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ttcctcccac cctcaacctc cttgctcact aataaaacaa gtgacttccc aaacatttga 23100

ttaatgtggg tgggtccctg ttcccccacc tttgcagggc ttgtattttg tctgccttca 23160

cccccttccc ctccttgggc tccttggagc tagcaaatac agataataag aa 23212

<210> 4

<211> 1041

<212> PRT

<213> 犬（Canis lupus）

<400> 4

Met Asn Leu Leu Glu Gly Ser Val Gly Val Glu Asp Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Glu Pro Leu Glu Gln Glu Pro Leu Leu Lys Asn Leu Gln Leu Arg Tyr

20 25 30

Glu Ser Lys Glu Ile Tyr Thr Tyr Ile Gly Asn Val Leu Ile Ser Val

35 40 45

Asn Pro Tyr Gln Gln Leu Pro Ile Tyr Gly Pro Glu Phe Ile Ala Lys

50 55 60

Tyr Gln Asp Tyr Thr Phe Tyr Glu Leu Lys Pro His Ile Tyr Ala Leu

65 70 75 80

Ala Asn Val Ala Tyr Gln Ser Leu Arg Asp Arg Asp Arg Asp Gln Cys

85 90 95

Ile Leu Ile Thr Gly Glu Ser Gly Ala Gly Lys Thr Glu Ala Ser Lys

100 105 110

Leu Val Met Ser Tyr Val Ala Ala Val Cys Gly Lys Gly Glu Gln Val

115 120 125

Asn Ser Val Lys Glu Gln Leu Leu Gln Ser Asn Pro Val Leu Glu Ala

130 135 140

Phe Gly Asn Ala Lys Thr Ile Arg Asn Asn Asn Ser Ser Arg Phe Gly

145 150 155 160

Lys Tyr Met Asp Val Glu Phe Asp Phe Lys Gly Ser Pro Leu Gly Gly

165 170 175

Val Ile Thr Asn Tyr Leu Leu Glu Lys Ser Arg Val Val Lys Gln Leu

180 185 190

Lys Gly Glu Arg Asn Phe His Ile Phe Tyr Gln Leu Leu Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Ala His Leu Leu Thr Ala Leu Lys Leu Glu Arg Asp Thr Ser Gly

210 215 220

Tyr Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Val Ser Arg Val Asp Gly Met Asp Asp

225 230 235 240

Ala Ala Asn Phe Lys Ala Val Gln Ser Ala Met Met Val Ile Gly Phe

245 250 255

Ser Glu Glu Glu Ile Gln Arg Val Leu Glu Val Thr Ala Leu Val Leu

260 265 270

Lys Leu Gly Asn Val Glu Leu Ala Asp Glu Phe Gln Ala Asn Gly Val

275 280 285

Ser Ala Ser Ser Ile Arg Asp Gly Lys Gly Ile Gln Glu Ile Gly Glu

290 295 300

Met Val Gly Leu Asn Ser Glu Glu Leu Glu Lys Ala Leu Cys Ser Arg

305 310 315 320

Thr Met Lys Thr Ala Lys Glu Lys Val Val Thr Ala Leu Asn Val Ile

325 330 335

Gln Ala Gln Tyr Ala Arg Asp Ala Leu Ala Lys Asn Ile Tyr Ser Arg

340 345 350

Leu Phe Asn Trp Ile Val Asn Arg Ile Asn Glu Ser Ile Lys Val Gly

355 360 365

Val Gly Glu Lys Lys Lys Val Met Gly Val Leu Asp Ile Tyr Gly Phe

370 375 380

Glu Ile Leu Glu Asp Asn Ser Phe Glu Gln Phe Val Ile Asn Tyr Cys

385 390 395 400

Asn Glu Lys Leu Gln Gln Val Phe Ile Glu Met Thr Leu Lys Glu Glu

405 410 415

Gln Glu Glu Tyr Glu Arg Glu Gly Ile Pro Trp Thr Lys Val Asp Tyr

420 425 430

Phe Asp Asn Gly Ile Ile Cys Asn Leu Ile Glu His Asn Gln Arg Gly

435 440 445

Ile Leu Ala Met Leu Asp Glu Glu Cys Leu Arg Pro Gly Val Val Ser

450 455 460

Asp Ser Thr Phe Leu Ala Lys Leu Asn Gln Leu Phe Ser Lys His Asp

465 470 475 480

His Tyr Glu Ser Lys Val Thr Gln Asn Ala Gln Arg Gln Tyr Asp His

485 490 495

Thr Met Gly Leu Ser Cys Phe Arg Ile Cys His Tyr Ala Gly Lys Val

500 505 510

Thr Tyr Asn Val Asn Ser Phe Ile Asp Lys Asn Asn Asp Leu Leu Phe

515 520 525

Arg Asp Leu Ser Gln Ala Met Trp Lys Ala Gln His Pro Leu Leu Arg

530 535 540

Ser Leu Phe Pro Glu Gly Asp Pro Lys Gln Ala Ser Leu Lys Arg Pro

545 550 555 560

Pro Thr Ala Gly Ala Gln Phe Lys Ser Ser Val Ala Ile Leu Met Lys

565 570 575

Asn Leu Tyr Ser Lys Asn Pro Asn Tyr Ile Arg Cys Ile Lys Pro Asn

580 585 590

Glu His Gln Gln Arg Gly Gln Phe Ser Trp Asp Leu Val Ala Ile Gln

595 600 605

Thr Gln Tyr Leu Gly Leu Leu Glu Asn Val Arg Val Arg Arg Ala Gly

610 615 620

Tyr Ala Tyr Arg Gln Arg Tyr Glu Pro Phe Leu Glu Arg Tyr Arg Leu

625 630 635 640

Leu Ser Arg Ser Thr Trp Pro Arg Trp Asn Gly Gly Asp Arg Glu Gly

645 650 655

Val Glu Lys Val Leu Gly Asp Leu Asn Leu Ser Ser Glu Val Ala Phe

660 665 670

Gly Lys Thr Lys Ile Phe Ile Arg Ser Pro Arg Thr Leu Phe Phe Leu

675 680 685

Glu Glu Gln Arg Arg Leu Arg Leu Gln Gln Leu Ala Thr Leu Ile Gln

690 695 700

Lys Val Tyr Arg Gly Trp Arg Cys Arg Thr His Tyr Gln Leu Met Arg

705 710 715 720

Lys Ser Gln Ile Leu Ile Ser Ser Trp Phe Arg Gly Thr Met Gln Lys

725 730 735

Gln Arg Tyr Glu Lys Met Lys Ala Ser Ala Val Leu Ile Gln Ala Phe

740 745 750

Val Arg Gly Trp Lys Ala Arg Lys Asn Tyr Arg Lys Tyr Phe Arg Ser

755 760 765

Gly Ala Ala Leu Thr Leu Ala Asn Phe Ile Tyr Met Ser Met Thr Gln

770 775 780

Lys Phe Leu Leu Gly Leu Lys Asn Asn Leu Pro Ser Thr Asn Ile Leu

785 790 795 800

Asp Arg Thr Trp Pro Ala Ala Pro Tyr Arg Tyr Phe His Thr Ala Asn

805 810 815

Gln Glu Leu Gln Lys Leu Phe Tyr His Trp Lys Cys Lys Arg Phe Arg

820 825 830

Asp Arg Leu Ser Leu Lys Gln Val Glu Ile Leu Lys Glu Lys Leu Cys

835 840 845

Ala Ser Glu Leu Phe Lys Asp Lys Lys Ala Ser Tyr Pro Gln Ser Val

850 855 860

Pro Ile Pro Phe His Gly Asp Tyr Ile Gly Leu Gln Gly Asn Pro Lys

865 870 875 880

Leu Gln Lys Leu Lys Gly Gly Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ala Glu

885 890 895

Thr Val Lys Lys Val Asn Arg Gly Asn Gly Lys Thr Ser Ser Arg Thr

900 905 910

Leu Leu Leu Thr Lys Gly His Val Ile Leu Ile Asp Thr Lys Ser Ser

915 920 925

Gln Ala Arg Thr Val Ile Ala Leu Asp Asn Val Ala Gly Val Ser Val

930 935 940

Thr Ser Phe Lys Asp Gly Leu Phe Ser Leu His Leu Ser Glu Ile Ser

945 950 955 960

Ser Val Gly Ser Lys Gly Asp Phe Leu Leu Val Ser Glu His Leu Ile

965 970 975

Glu Leu Leu Thr Lys Met Tyr Gln Ala Val Leu Asp Ala Thr Gln Lys

980 985 990

Gln Leu Pro Val Thr Val Thr Glu Lys Phe Ser Leu Lys Phe Lys Glu

995 1000 1005

Asn Arg Val Asp Val Lys Val Ile Gln Gly Pro Glu Gly Gly Lys

1010 1015 1020

Asn Gly Lys Leu Ser Cys Lys Lys Lys Gly Ser Arg Cys Leu Glu

1025 1030 1035

Val Thr Val

1040

<210> 5

<211> 20110

<212> DNA

<213> 猫（Felis catus）

<400> 5

tgaagttaca ccctagtttg ttccagtgtt gggtgagtct tgccttgacc tgtccctgct 60

ctgcatcttt tggggtgccc tatctgggag ctgctttgtt tttccctttc ccacctccaa 120

ccaatcacat tcccactccc ctcaaatcca aatccaaaga agatggcttc ttccagccct 180

atttctgttt ctcacccttg tctgccaagt tacttaaaag tttaacttct gttttttaat 240

ctggagcatg tggaatagta atagtttcta ctttgtgagg atactgtttg taagcatcaa 300

atgaattagt atatgtagtg tttagagctc tgcctggccc atggcacctg attgtttgcg 360

attgctactg tcagtattct tattgctttc tcagttgtgt ccttccagga agtgacaagt 420

gctctcattt tctggaactt gggggaggca tagtgaaggc tgaaggcagc ctgtgttccc 480

ctcttgcccc accttcagtt cctgcttccc tcccctcccc cgcccaggtt cagcattgct 540

ggagactagg aggatgtggc tcttttattc ctgttaggga gtagccctga ccattgtact 600

aataattctg tcctgctcca gaccacccca cctactcagt cccacaggca agactgagga 660

gggctgggct tcctccttcg gttacacctg ccatgtgccc actgcgcagg ggatgagccc 720

cacaataact ctgttcctcc ttgcccactc ccaccagctg ctaaaaagct gggtgtgtcc 780

ctatggggca aagtccatgc cggaaggtta cagcaatggg tataaaaact ggagatagaa 840

aaatagatac atccagagat cctgacagct acttgatgtt ggagaaacca aacttttatt 900

ctcttcaggg tattctaatc ttttatggag gaacttctgc ctctgttcct ctaactcatc 960

aacttatccc atttaaaaga tgaatcttga tgtggcaatg taagggatct ttggaagagc 1020

ttttgcaatg gttctgggtg gactgggtga ctgaaataga agctgtgagg gatagagagt 1080

tgagaaggag aactgggggc agagggtcag ggagtctgga ccctggccag ggcctcagcg 1140

caggacagag caagttttca gagttaacct ttcctcccca gccctctctc ctgcaagcac 1200

aactgtgctt ccccaggtgc tacctgctgg gtgccttcct taccctggtc aaaggcagat 1260

ggtcctgtcc cacccctgcc cctccctgct ggggagagtt tctgcagcct cccacagtta 1320

gctttgacta gtccagagga cccctaggtt gaggattgtc tctagggccc agagttggag 1380

aaggctcttt aagtccttct gccctcctca cacacccctt ccccccccct cacccccccc 1440

cccacacaca gttactggcc cctaaagcag agcagacttc agcaaactga cctccttact 1500

cccaggatca gcagaacctc tggacatgac tctcatggaa gactctgtgg gggtggggga 1560

ccttgtgctc ctggaacccc tggaggagga gcctctgctc aagaacctcc agctgcgcta 1620

tgaaaacaag gagatttatg tgagtgcata tgcgtgcccc cggctctggg tatgtggtca 1680

gagagttcat gtgctcccac tcccttctcc cctctcagcc tcccctaacc ccaccgctgc 1740

tcattctctt tacttttttt ggctccagac ctacattggg aatgtgttga tctccatgaa 1800

tccctaccag cagctgccca tctatggtcc agagttcatt gccaaatacc gggactatac 1860

cttctatgag ctgaagcccc atatgtaagt aaaggaactg agggaaggct gacagggccc 1920

taacttctga cagtgagaca ccctaatttc ctcgatcctt tctcctgaag gaagttctcc 1980

ggcttcccct tccccactgg ccccaggaag acccttccta ggcctatcac ttacctcagt 2040

ctagtccaag tgaggagggt ggatgactct ggaggctgga gattgagtgg aaggtagtgt 2100

cttggattag ctccacatca gtcttcacct gcttcctcct cccaagctat gctttggcaa 2160

atgtggcata ccagtcactg agggaccggg accgagacca gtgtatcctc ataacgggcg 2220

agagcggagc cggcaagact ggtgaggtgc ctggcttggg gaggctgtgc agtcactgct 2280

ggaaccaccc cctcatctct ttccgagcca gacctggtct tgccccaccc cagaaattcc 2340

ttcccacttt ttctgattct gaggggtatg gtgctggaat gacaggagtt aaggagagtg 2400

gtggggatcc atgtgaaggt ttctcttgca cagaggccag taagctggtg atgtcttatg 2460

tggcggctgt ctgtgggaaa ggggagcagg tgaactctgt gaaggagcaa ctgcttcagt 2520

caaacccggt gctggagggt gagtatccca gtctctgccc tctccaccct ccaccctgct 2580

ggcccagaga cactcagccc tacaccctct taccctgttc ttgttcagct tgaaaactct 2640

gagattggcc tgatgactag aagacgtcct tccttcccct tctctcgagc ccctcttctt 2700

ccctcagtta cctcaccttc tctctcatct ctgcagcttt tggcaatgcc aagaccattc 2760

gcaacaacaa ctcctctcgc tttgtgagtg accatctccc tggcctggga ggagagggtg 2820

tgggggcttt agaaggagga atgcagcaca gaccccctcc tgagtggggt ggtgagaaga 2880

agaggaagca aaacctcttt ctctctctgg tctctgtagg gaaaatacat ggatattgag 2940

tttgacttca aaggatcgcc ccttggtgga gtcatcacaa actgtacgtg tctccccatt 3000

ctgcttacca gctctctctt ctccccatcc cacagtgtcc ctttctggtg atttgaaacc 3060

gtaggaagga atagtaggct accaggaggc ttccctacta gtaggaacac cagcggagag 3120

ggcaggctta gagggaagcc gtggaatctc cctgagctct aggacattat tttctaattc 3180

cctgccagac ctgcttgaga aatcccgagt ggtgaagcag ctcgaaggag aaaggaactt 3240

ccacatcttc tatcagctac tggccggagc agatgcacac ctgctgggta cgtgcctgcc 3300

cagacacatg gaagaaggtc cccaacgtcc atttaatccc tagaaccttt gggcccctct 3360

gcacccctgc agccctcttt ccctgagccc tcagcctcct tcttcctgca ttcctcacac 3420

tgaatttcgt ccactcattg ttggaaacaa tcccctgacc tctgtgttct cctctttttt 3480

ctaggattgt attgctagga ataaaccttc ttgtctcttg acctgctctt attcctctgt 3540

cctgcttggg ttcctctttt ctcaggctgg cttcagaaat gggacactta tttccaccta 3600

ccgttcttcc ctatcttcaa tttaagggac ttaatcacta gctcagcaga aaatcagaca 3660

ggatatttaa gtgttaaaga aattttgata agcagtagtt gaagttgttc tgggtctaca 3720

tctgcctcac ccagcccctg tccttgattt cttcttctta gatggcttga tggaggtttc 3780

atgtattcat tcatcaaata tctcttgaac acctactatt atcgaacatt gtgctagcct 3840

ctagcaatgc agagttgaat aagataacat ggctcttgtc ctcgaagaac ttaaggtctt 3900

ctagggatga cagatatgtt caataggcct gtgtgggtgg ctgtaggagc agaaggcatg 3960

gagacctctg ccttgtcctg gagagccctg ggtgctggat gggcctgagg tggttctggg 4020

tgggcatcac tgcagagtct ggtgggactt cgggccctgc cagagtttgc ctcccaatgc 4080

cccctctagc tgtgagcagt gtgggtgtat ggcccccaag gacctgtcct tttggttcct 4140

ggttattctc tgctggactt gtgcctatct cttttcccct cctagggatc tccatggttc 4200

aagagccccc acaggtctca ttattccttc ctagctcagt agtcttggtt gtgctcaatt 4260

tgttcgaatc ataggcacca gtatcttatt ctgtctgact gttacctatt ggcttaagct 4320

aagtctggac agggcctccc tggtgtcatt atcccagggc ctttctgact cattctttat 4380

ccagacacct ttctttagca ggttcctctt tcaaaatctg tgtctcaggg gaagctgtca 4440

ttaaactcta gtttgaggga ctttccctga ttctcagatc atttgaataa cagatcattg 4500

atatccctca agctccatgc ttaacctact tcttcccatc tcaggtgaac agcttggatc 4560

ataaccttga ctcatttatt aaaaagaaaa aagtttatgt atgccaagca ggcacacaga 4620

aaacaaagat gaaaaacaca gtcccaatgt gtcgttcatt tgtgggagag acagaaaaaa 4680

caaaacctag cccatgtgtt atggactggg atagagatcc accatggggg aacacaagag 4740

agccttttgg ctcagcccca caatgtccaa ggagagtttc caggagaggg gtcaggatta 4800

gggaacatag tacctgcaac tttgttggtg cttactgaac aaataatgaa tgagccaacc 4860

caggcctagg gtgagatgtt gaggctctgg gtgggtggga gatatgtgct caccggtctt 4920

tcctctctga gccactgaga actgagtagg atggagggtt ggcttgtttg tttttattgt 4980

tgagaaccct gaggatggga agaagagcag aatgagtctt ttctttcatc aaagttagga 5040

aaacccccac aattaagaat acccaaactc taaatactgc ttgaaagttt agtctattat 5100

aatgggaatt aatgatccca aaacaaagga ggcaggggac gaaccgaaaa caaaaatggc 5160

tccttcgaat aaatgagtaa accaagctag ggcaagggct gtgagagtca aggccggagg 5220

actcctgaga gcctgggtac taaccctcct cccaagcact ttaacgtttt ctagttgcca 5280

aaggatataa agtacatgat taaatgctaa ctccccatga aatcattgcc ttccacattc 5340

agcacaggga tccaagcctg ctttgtttga tgggaaaggc cactacaatt tactggtcat 5400

ttaaaagtag aatttctgtt gcctataaga attagaggga ggtttatacc ctatgatgca 5460

tatagacaaa aaacctatca aaattcatta taactagttt gtgaatataa aatgaaagca 5520

catagttaga gttggtgact ttaaaaagat tgaatgttga atcagattct catactgacc 5580

cttgcagagg ccctgaagct cgagcgggac acaagtcatt atgcctatct gaaccagaaa 5640

gtgtctagag ttgatggcat ggacgatgcc tccaacttca agtctgtaca ggtgggtgcc 5700

cagggtgggc cttaggctat cccctgagcc caggctttgg ctttgagaag ggaggcattg 5760

agctggcacc acagttcaac ttctcatttc tgctatctcc tccagaatgc aatgactgtg 5820

attgggttct cggaggtaga gattcagcag gtgctagagg tgacggccct ggtgctgaag 5880

ctggggaacg tggagctagc agatgagtcc caggccaatg ggacatcagc aagtggcatc 5940

cgtgatggga gaggtctgca ccgccctgct ggtaccctct aagccgctcc ctgaatctcc 6000

tactacaatt tctgttcgtc caccatctgc tgagtaactg acttcattcc gattcagtcc 6060

cactcagcca ttcctgagtt ctaccccaaa cacactcatt aagaattcct agtgaggcat 6120

tttggagtga ggttatgaag ttagaccttg gttctggcac gtctctgagt ctaagtggag 6180

tctttgcaaa gaatttcagg agattctcct attgaagtag ataatgcagg ggcacttggg 6240

tgggtcagtc agttaagtgt ctgactcttg atttcagctc aggtcttgat gtcagggttg 6300

tgagttcaag ccccacgttg ggctccactt tgggtgtgaa gactactcaa aaataaaata 6360

aagtagataa tgcatttaaa gtgtccgcag ctccctctcc tctccccaga gtttcctctt 6420

gggccatgtt atggatgggc tgcaagaata tccccaagac cttgggagac cagtctccta 6480

gcagtgtcac ttctcagccc tccctcccta ggagatagct ctctttcagg ccatgttgta 6540

tttcctcatc actccaggag tccaggagat tggggaaatg ataggtttga attcagagga 6600

actagagaaa gctttgtgct caaggaccat gaaaacagcc aaagaggagg tggtcactac 6660

actgaacttc acccaggtaa gggccctatg ggagggggct gattttgaga ctattctgtg 6720

gctgccatcc taaccagctg gctctgccca acaggctcag tatgctcggg atgctctggc 6780

taagaacatc tacagccgcc ttttcaactg gatagtgaat cgaatcaatg agagtatcaa 6840

ggtgagagat tgctctcctc cctcaacact ctcctgtctg cctcactttt cttgtcccgg 6900

tcaccatccc tatacttcgg gttctgagat gaagagagta agaaggatga agggtaaggt 6960

acagttgctt ccaatagtgt gttgttgtgg aagcatctct ggtttttgag tttgactgtc 7020

tggatcccct gcttaccagc tgtgtggcct tttagtttca cagagattct gagcctcagt 7080

ttcctgattt ggaaaattgg atgctaatgc ctacctcctt catagtgagg atcagataaa 7140

attatggaca tggttaccat ataacccaga aattccactc cagatataga tccaagagaa 7200

ttgaaaacag atgttcacgt aaaaacctgt acccaaatgt tcatagaggc attacccata 7260

atagccaaaa agtggaaaca actcaaatgt ccatcagttg atgaatgggt aaataaaagt 7320

ggtatatcca tacaatggga tataaataaa taaacaggcc ataaaaagga atgaagtact 7380

gatacatgct caacacagac aaatcgtgaa aacattcaag tggaagcagc cagacacaaa 7440

aggtgattcc atttatatga aatgtaatag gcaaatctat ggagagggtg gtagattaat 7500

ggttagcagg ggcttggagt ggagggagag gggaaggtgg aatgacagct aatgggtatg 7560

agtacaagat ttctttgggg gatcatgaaa atgctctgga attaggtagt ggtgatggtc 7620

atacactttt ttttttttaa gtttattttg agagagtggg ggaggagcag agagaaagag 7680

gaagagagag agagaatctt aagcagggcc tgtgctgtcg gcgtagagcc tagtgcaggg 7740

cttgaactca tgaactgtga gatcatgacc tgagctaaaa ccaagagttg gacacttacc 7800

cgattgagcc acctaggcac ccccatatgc attttgaata tactgaaaaa tcactgaatt 7860

gtataccttt aaagggcaaa ttttatagaa tgtgaattag ataaaaatag agctattatt 7920

taaaaaattt tgtgcatgag aggtgcctgg gtggctcagt cggttaagca tccgacttag 7980

gctcagctca tgatctcacg gtttgtgggt tcgagtccca cgtcaggctc tgtgctgtca 8040

gctcggagcc tggaacctgc ttccgattct gtcactccct ctttctctgc ccctccccca 8100

cttgcagtct gcctctctct ctcaaaaaat aaataaacat taaaaaaaat tttttttaat 8160

cttgtacatg aaaatgcctt caattcagaa gctactatgg aaaggcaaca ggggaaaatg 8220

ggatttaaaa acgcttagtc cctttgaaat ttgatctgtc catctgtaaa atgagaatta 8280

tcacaccata tagggttatc atgagattta atgaagtaag aacatagaat tttttctaaa 8340

ttgctctaca aatgtacgag atggttattt tcctcagaag attttaaagt ctttctacct 8400

cgtcccctgg gagcaccatc ctggaatctg cttacatctc cctccccctc tcctccctct 8460

gcttggcccc tagtgtgtag aggaggaagg agaataaaat cacaactggt caagctcacc 8520

cgagttctgt ttgccctctg ctccaatcac atccgcccca gaagggcctg gcctggtgtg 8580

cagagggggc ccgtcctcag atttatcttt ccctcctctt caggtgggca gcggggagaa 8640

aaagaaggta atgggggtcc tggatatcta cggctttgaa attttaaagg tgagagagct 8700

tcccccaacc gcagccaccc tgcatcccta gggttggggt gcggaggctc aaagggaggg 8760

gcttgcgaga ggggaggcgt ggggctgaga gggaggaagg gtcttggact gagctgctct 8820

ctctctaacc tgggtcccct ccttcaggac aatagctttg agcagtttgt gatcaactac 8880

tgcaatgaga agctgcagca ggtgttcatc gagatgacgc tgaaagagga gcaggaggaa 8940

tataagagag aggtgcgcgg agccttcccc cacagcccct ctccaaagtg acgctggtgt 9000

gcgcgccacg tctgtctttc tcctcaatcc cggtttcctc tcactcgtgc ccagatggga 9060

acacaaagga caaaaagttc ccctttcact gctcaacagt gcagcattac caagaagccc 9120

tagtttttgc tctccacccc ccagtcccct gctcccaccc caggccgtgc cagcaagggg 9180

cagactgatg gaaggctgtg tggggggagt cctcacaagg gtgaagtgac agctgtgcgt 9240

ggcctgcagc acactgtgag cctgatttag aagggacatt tctcccaggc ttgtcacccc 9300

accacatcca ttttggtgct cttctctgac acctcacaat tctttgtctc ctcgggccct 9360

ggctgatgtc accatctcct cgtgtagcac cctgatccca gacttcctcc ccagaagttc 9420

cccatggctc aacatttcca cactccttcc cctgttcagc aagaaggctt gctttctatg 9480

gctaggtgtt agaaaagcta tctgattgag ctaattcccc ccaaagtgtg aatggctgag 9540

agtctcactc atcaaaacgc tgccagggat gctgcctgtg agcccttggg aatctgctgc 9600

agcagaattt cagacaatgt ggtcacaatg tgtgggaaag gtttttttta agttgttttt 9660

catgttttta tcttaaaatt ttaaatgatc aactagagaa tacattccca tgcctcaaaa 9720

ttcaaaaagc ttaaaaaggc atataaagaa agggctctct cccagcctat ccccagcctc 9780

ttagttctcc aaccatctag aggcaactaa agtggccctc ttttcagagg tcttttatgt 9840

gtaatcaggc aaatgtagaa gtttattttc ccacagaatt tttttcaaat ggcagtgaat 9900

atgctctgct ctaccccttg ctttcatcaa ttaatgagat ctttccatat cgtatataaa 9960

gatgcatctt tacagctaca cagggttgta aggatatcat acttcattta actagttggg 10020

gaaagtattt tggggatgaa atgggaaggc aactacttaa ttccactcta cattccctga 10080

agatctgtga gggggtggga gagtgttccc cagccacacc cccacacctg ggaatggtct 10140

gagtctggga gggctggccc ttgggtggga tcagaagcta tcctgtctgc ggctacccct 10200

aagtggggaa cgattgtctt tgggtctcct tctgtaccat tcttgcttaa aacaaaaaca 10260

aaaacaaaaa caaaaactat acagtcccag agtatcaggt agattagtag ttcttaaagt 10320

gtggtcctgg accagcagca tccctggaaa ggtgttagaa agacagattc ctaggctcta 10380

tcccagacat gctgaatcag aaaccctggg gatggggcct agcagtctgt ttttacaagc 10440

cctctagctg actgccatgc aagtttgaaa agcactgatg taggtctttg aagatgtatc 10500

aagttaggtt tgttgcttga tgaaattcac tcatgtgctt tggttttatt ggtcgttgcc 10560

agaacagtgt ggcctttgct cttgcacacg ctcaaggatc cttcctcact ccacagtggg 10620

gcaatcccta ccccgatctt caccccacac cacctacagg gctctcttca gcatctcccc 10680

ctctctcaca gctgctctgg gtcctttcac gtgtctccca ccccacaaat tctccatcaa 10740

cctggaggga tgggaaccta aacagaagcc acaccaagga cccctcttaa ttatagggct 10800

ttctgagtcc ttcttgggtt gggtgagagg gagcctgagt ctggtgaggt ctttggagac 10860

ttgtcctgga cctgctcttg taacctgtca tgcctcttct tgccagggca taccgtggac 10920

aaaggtggac tactttgata atggcattat ctgtaacctc attgagcacg tgagttatct 10980

ttatgttatc tctgagacct cttgcagact gactgaatat ccttgtcctt ccccctcccc 11040

ttgccccact tggtaaggat ggtgaagtgg gcaaaggatg aaggggcaga gggacagcag 11100

tgaggatgtg gacatcttgg aggatcaggt ctaagttggg ctgatcttgt tcccctgacc 11160

agaatcagca aggcatcctg gccatgctgg atgaggagtg cctacggcct ggggtggtca 11220

gtgactccac cttcctagcg aagctgaacc aggtcttctc caagcatggt ttctatgaga 11280

gcaaagtcac ccagaatgcc cagcgccagt atgaccacac catgggcctc agctgctttc 11340

gcatctgcca ctatgcgggc aaggtgacat gcagggctgg agggtagaaa tgggcctggg 11400

catgggtgga aggcaatggg ggaggacctg cggggagatg agatctggga atacttcaca 11460

atgagattgg gagtgccaag tgctgggaca aggtcatgga ccctccagac ccatagctat 11520

tcctctacag gtgacttaca acgtgaacgg cttcattgat aagaacaatg acctactctt 11580

ccgggacttg tcccaggcca tgtggaaggc ccagcacccc ctccttcagt ccttgttccc 11640

tgaaggagtt cccacacaga catctctcaa gcgcccccca actgctggag cccaattcaa 11700

gagttctgtg gccatactca tgaagaactt atattccaaa aaccccaact acatcaggtg 11760

acatgctggg tacatgggga aatgcagcat atgtgatggc agatgcaggg tccagcacta 11820

tagaacctgt ccattgttgg gggggagggt gtctctggaa taagagtatc agaaggccct 11880

tccctcataa aaaatgagga actgagaatc ctgtggcagg gagagcatca gactttagta 11940

ggaaccacgc tatagtgagt gaagctggga aggccagtgt gttcacttcc tctgaaaata 12000

accctccaga atagggttat agagaccagg atgggtcaca cttgcaaagg tgaagctcct 12060

catgcctgtg ccttgcacct ctccccccac cccaaggtgt ataaagccca atgagcatca 12120

gcagcgaggt cagttctcgt cagagctggt ggccgtccag actcggtacc tgggactgct 12180

agagaacgtg cgggtgcgtc gggcgggcta tgcctaccgc cagaggtatg ggcccttcct 12240

ggaaaggtac cgattgttgg ggcggagcac gtggcctcgc tggaatgggg gagacaggta 12300

agactcctgg gggagatggg ggagcaggga agggcagtgc agggaacatc tgggtggtgg 12360

gaagaacaga cagtgccatg taaattgcca aaactccatg aatggatact tggggaaatg 12420

aactgatcac tttgcagagg ctctgaagtc tgttcaagcc ctgaactcct ctccctgggt 12480

ataagaggtt ggggaaaggt gaaagaggat ccttctctgg gatgcccctt ggtagctttc 12540

cccatctgct cctgtaggga gggagttgag aaggtcctgg gggagctgag cttgtcctca 12600

gaggagctgg cctttgggaa gacaaagatc ttcatcagaa gccctaagac tgtgagttgg 12660

agggtgcact tgtgtttggt tggggtagga ggcagaagag ttggagggtc catgagtgag 12720

aggctggggc ggaggggagc atctataact tgggatggat ggtgggtgag gaagtctgct 12780

ttctgcaggg actttgtccc tggaaactga atccttgggc tcctacccca ccctgcttgc 12840

atggcccact ctgagtgcct ctacctgtag cagaactcct gaagatcaag gtgatgtgcc 12900

actcatgtct aaatttccag acctcgcacg tgcctctgac agagttagaa ttcagtaggt 12960

ttctgttaag gtgaataaca cttaacagaa taataatgag tgagcgaata aacgaatgca 13020

ctaagaagtc aatggaatga ataaaacact ggctgggaag cccctggcac ctgggctccg 13080

ggaggagaga gtgctattcc cctaggccag cctttccgcc ccaccttcca cctctccaca 13140

gctgttctac ctggaagaga agcggcgcct gagactgcag cagctggcca cgctcattca 13200

gaagatctac cggggctggc gctgccgcat ccactaccag ctgatgcgca agagtcagat 13260

cctcatttcc tcctggtttc gaggcaacat ggtatcagtt gctccctaaa gtcccatccc 13320

tttcactcca ataaaagagt cgggggcacc tgggtggcac agtcggttaa gcatccaact 13380

cttgatttca gctcaagtca tgatctcctg gtttgtgaga tcaagcccta cgttgggctc 13440

tgtgctaaca gtgtggagtc tgcttgggat tctctctctc tgtctccgtc tctgtctctc 13500

aaaataaata aacatttaaa aaagagagag ggagagagtg ggaagtagga gaggtggttc 13560

aggggatgga gtttttctaa caggcctatt gtttttctgc agcaaaggaa gcgctatgcg 13620

aagataaagg catcagtggt gctgatccag gcttttgtga gagggtggaa ggtaatgcgg 13680

aaggggagag gggtttcctc cgcacacatg gggtcttccc ccacatggtt tctcctggat 13740

tgtgccagct gctgggagga aagagtagca gaaagcaagt cctgcccaca cccagggcat 13800

acctctgtgt gatggcatgc ctgcatctgg gtgtgtgtct gggagtgtgg gtgcgtactg 13860

gggagatgtg tgtagacacc tgggtgtgtc cctgacttgg ctttgagtgc cttcctcatt 13920

gccagcttgt ctgcctttac tttctccctc cagtagagtc tcggcacttt atctaactgt 13980

gctctttgta tggttggaaa acagtagaac ctctgtctcc ttatcttcta ggtctgtcta 14040

tctttacttt ggctcctttc tcatgtatcc cttctaggcc cgcaaggatt atcgaaaata 14100

cttccggtcg ggggctgccc tcaccttggc agatttcatc tataagagca tggtaagtgg 14160

tcttacttac tatgggggtt gagggtggaa ggtggagggg aggttgtgga gggagggtca 14220

ggtttggaaa aggaagatga ggggtttgag aagaggtgat caaagttttc cctggaaggg 14280

tttctttgat ctgcatgtac ttaattatta agtcctaggg taagaaggaa tggggctttg 14340

gtgcctcagg gcccaggggc agaatcagag tgcactctgg aaggagtgga cactgtgggc 14400

aaccttgggg caggaagggg tcccagcaca cccactgact ggcccatgat gaataggccc 14460

gagaagagac gggctggatg gctaacaaca gtttaaagag actgagcctc atgaaagagc 14520

agagtgagga catagggtta cctaacttaa ccttccgaga tccattttat ggtaggggtg 14580

aaagtggagg gattgtatct ttctttcggc tcttctgaag ctatagcaag caagtccaca 14640

atgaaatctc aggaaatatc ttaattctgg aggacttggg actttttttt tttttttgaa 14700

cttttattta tcattttcga gagacagaaa gagacagagc acaagcaggg aaggggcaga 14760

gagggagaca cagaatcgga agcaggctcc aggctctatc agcacagagc ccaacgcaga 14820

gctcaaaccc atggaatgtg agaccatgac ctgagctgaa gtcagacact taactgactg 14880

agccacccag gtgatctgac cccagagttt taatgcctgc cgaagactgc ttccccacac 14940

tgtcccccca ctccccctag agacctactg gggcaggagg gctatatagg gaaaggaaag 15000

actttctaga tctagaaaaa acaaacaatt aagaaaacct tcagagtttc gacatcagtt 15060

agcacatgag ggattggagg aaatgcttag gaatgtttat tgaattaaat caaactagac 15120

ctgaccaagt ccccttgggg acttaaacca aggtgtgagg tgattagacc aagcctgcaa 15180

gatctttgta gcagaggaat caaagagctt ggatagttcc tggagaatta tagcaatata 15240

ctgcataccc tcccttttcc cattttaatt tttttaacct aatgtgttag taagaagttt 15300

tcataaaaat tccaaaaact tgggggcgca tgggtggctc agtcagttaa gtgtctgact 15360

cttgattttg gcttaggtca cgatctcaca gtttgtgagt tcgagcccca catcaggctc 15420

catgctgaca gtgctaagcc tgcttggaat tctctctctc tccctctctt tctgctcctc 15480

ccccacttgc tccctctctc tctctctctc aaaaataaat aaacttaaaa aaaaaaatcc 15540

aaaacttgga agtactcaag atcaagctat tttctatacc ttcaataatt ctaccccaca 15600

aacaaacagg gtgctgggtg ttccctggga tataaagact ggagagtcct tattctagat 15660

tgggggagac taaacagatg ccatgggtga tacttgatct gatcctggaa caggaagaat 15720

aagaacaaag ctacaaaggg catttttaga agtttataaa ggacattagg agaaatttga 15780

gcatgcattg ctgttggatg agtgtatcca attaatgttt gtcttcttag gtatggaggt 15840

ggaattatga tttgtgtagg agaatgtcct ggttcttggg agatgtgtgc ttaagttttg 15900

ggggaaaatg ccatgatttc tctaacctac tttaggatga tatggtagca aagatttata 15960

tatgtgtgag tgtgtgtatg tatttattta tgcccatttg tatacatgtg tgcatgtgtt 16020

agaaagcctg caaatatggc caattgttaa cattatcagt tggtggattt aggtaaggaa 16080

tatgtggcat gcagatattc actgtaatgt ttcttcaact tttatgtaag tttaaaaact 16140

ttcaatataa gacagtaagt tatatgaaat aaaaaagaac gtaaggcaga ttatgtcact 16200

cttcccctta aaatcctcta atggcattcc atttgactcc caataaaagc cagtgttctt 16260

acctcagcct acaaggccct tcacgaatgt acttgaccaa ccagtcctct gatcttcttt 16320

cttcttgctc gatttaatcc agtctcactt tcttttcatt tctgggatat gctactgctc 16380

atttctggtc tcagggccag cttttttgca tcatagcata tataattatc tgcaattatt 16440

tgcatcatag catatataat taacatatat tatatatgtt tgtttgctgt ggggttcttc 16500

cctcccccgg tagaatataa gctcagtgag aatagagatt ttgtttgttc tgttcactgc 16560

tgtgtatcca tacctagaac agtgccaggc acagagcaga cactcaataa atgttgttga 16620

atggcagggg aaaaaaaaca acaacaacaa gaactcagct tgggatccag actcccaagg 16680

actcattgtc tagaagaggg aaaagatttc cacacagata atagtagtac aaacacagaa 16740

gtatagacaa agtgctgtgg ggcttcaaag aaaggagagg cagccctggc ccagggaatc 16800

agggagggct tcgagctgtg tctgaaagga taggtagaat ctagatgggc acagctgagt 16860

tgagagcagg atgggctgag gcaccgagtg atcacgcctg ggctaggcag agggcttgat 16920

gaggaacact acctgagagg tgtgctggga tcatgcaggg gatcctgggg catgagattg 16980

ggccctaaat agaagacttt gaatgccagg ttgaggcatt gggcttgacc gatcagggaa 17040

ggggggaggt ttggtacctg tcctatagcc aatgcagaca gtggcagcca gctgtaggca 17100

gctatgaact gagacaatag gaagtcacag gagcaaaata ctgaggccag ttttcatctt 17160

ggttgctttc acctcactac cctgggcagc aggtctctgc ttggaactaa cccttccttc 17220

cctccctccc agtctcctgt tcacgctctc actgcccagc ctccagtgaa cactggaccc 17280

acaagagatc caggaggtga ctcccttctg actcctcgct ctacttgttg cttcttactc 17340

tgggtggcct ccctcctttc aggtggcagg tcctggatga gagtttgcct gttgggaggt 17400

ctgtcttctc atccgtccac tcccaatccc cctgcttcca atctagacgc agaagttcct 17460

gctggggctg aggaacaatt tgccgtctac caacatcctg gacagaacgt ggccagcggc 17520

cccttacaga tgcttcaaca cagcaaacca ggagctacag cagctcttct accgctggaa 17580

ggtgagtggg gcccagcacg actcctctca tttgtctttt tttcctcctc cctctgattt 17640

tcatcttctg cctccttctt ccactttttt tcttcatggt gaaaacaaca tagatcacaa 17700

aattggccat cttaaccatt tgtaagtccg gtgtcataaa gcacgttcac actattgtgc 17760

agccgtcacc accatccgtc tctgtatttc ttttttatca gcccaaactg caatcctgta 17820

cacattaagc agtaactccc cattccccac tcttgtagcc cctgggactt ataatcgact 17880

ttctctgtga atttgactgt tctcggtacc tcatggaagt agaatcatac atttgtcctt 17940

ttctatctgg cttatttcac tcagcacagt gtgcttccat tcaggaaata tgtaccgagc 18000

acctgtctag agtaggcctt gtgctgtgtg ctggcatata gccctcctcc tgggtctgac 18060

acatttgatt gtttccatcc ccctctccca gagtcccttt gagggggggc agtgctcctc 18120

cagcagctgc cctctctgaa gtgcctagag cctattctat tccctgtctc tcctcttttc 18180

cagcccctgc cctccttcca cctctcagtg ttctcccaaa cccccacccc aggcctgcct 18240

tctgcctcca cgagcttagc ccctgcccct ccctctcaca gtgcaagaga ttccgggatc 18300

gactgtcccc aaagcaggta gagatcctga aggagaagct ctgtgccagt gaactgttca 18360

agggcaagaa ggcttcctac ccccagaggt gagggccccg cagaccctgc acagtcagtt 18420

tcatccagag caaagacagg atcccccagg tgggataggg cagtggtccc caaactagtg 18480

tgcatcagca ccacttggca ggcttgatga cacccagatg gctgcaccac cccccgccca 18540

gagtttctga ttcagcagat ctggggctgg ggcccaataa tttgcctttc taacaagttc 18600

tcaggggatg ctgatgttgg tcctggacca tgctgagata gaggatatgg tggagcatgg 18660

gggaagggac atgggaactc actgtgggga ggctcagggc cttgggggtc agtggtgagg 18720

aacttgtctc caccacatac ctcctgtgtg tcttcagtgt ccccattcca ttctgcggtg 18780

actaccttgg gctgcaaggg aaccccaagc tgcagaagct gaagggcggg gaggaagggc 18840

ctgttctgat ggcagacact gtgaagaagg tcaatcgtgg caatggcaag gtgaatgcct 18900

gcaccctgga cttctgccca cggccggatc cagagccttg ggactggtag ctggaagggt 18960

ggggttaatc ttcacctttc ctcacatttt cctcttctgt ccttagactt cctctcgaat 19020

tcttctcttg accaaggggc atgtgattct catagacacc aagaagtccc aggccaaaac 19080

cgtcattgga ctagatagtg tggccgaggt gtcagtcacc agcttcaagg atgggctttt 19140

cagcttgcat ctgaatgagg tatcagagct ctgtgggtgc agtacctcac gctggagaag 19200

gtggtgggca tcacggggct ggggtgggct ggaggtgatg aggaccagac ctctcactct 19260

gggccttcag tgcctctcag gctgctcctg cagagggaaa aatgaatccc ttccccactt 19320

tttccccctt cctaagatat catcagtggg ctccaggggg gacttcctgc tggtcagcga 19380

acatgtgatt gaactgctaa ccaaaatgta ccaggctgtg ctggatgcca cacagaggca 19440

gcttctaatc tccgtgactg agaagtaagg ccatgagctg ggggtgaggg ccagcctggg 19500

ggcagatgac caagctgttg gtcattgtga ccgggaaaat tcatgtagtc agaaagtgaa 19560

gcatattctg tcaaggcaag gtttggaggt gtttcttagt ctccccactc aggttctctg 19620

gggccctgaa tcttctgaca cgaggggagg agagatgtac ttcctttaag aaggagaatg 19680

gaaaccatca tgaaagtatg ggagtagaga tgagaggatg agggtaccag ctttacccct 19740

ctgtctgttt cccctccagg ttctcagtga ggttcaagga gagtagtgtg gctgtcaagg 19800

tcatccaggg ccctgagggt gataggaacg gcaagctaaa atgcaagaag aaagggagcc 19860

gttgcctgga agtgactgta tagtgaagag gtgggggcct gatgcagaga cagcagcttc 19920

tctggacccg tgccaacccc acccacccat gtttgcagga ggatctgatc gtggtgtggg 19980

gctcagagat tgaggaaccc ttgaagagga cctttcttct cccaaactct tctgggcccc 20040

tctcccttag aacttatcct cccaccctca gctgctttgc ccactaataa aacaagtgac 20100

ttcccaaata 20110

<210> 6

<211> 1042

<212> PRT

<213> 猫（Felis catus）

<400> 6

Met Thr Leu Met Glu Asp Ser Val Gly Val Gly Asp Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Glu Pro Leu Glu Glu Glu Pro Leu Leu Lys Asn Leu Gln Leu Arg Tyr

20 25 30

Glu Asn Lys Glu Ile Tyr Thr Tyr Ile Gly Asn Val Leu Ile Ser Met

35 40 45

Asn Pro Tyr Gln Gln Leu Pro Ile Tyr Gly Pro Glu Phe Ile Ala Lys

50 55 60

Tyr Arg Asp Tyr Thr Phe Tyr Glu Leu Lys Pro His Ile Tyr Ala Leu

65 70 75 80

Ala Asn Val Ala Tyr Gln Ser Leu Arg Asp Arg Asp Arg Asp Gln Cys

85 90 95

Ile Leu Ile Thr Gly Glu Ser Gly Ala Gly Lys Thr Glu Ala Ser Lys

100 105 110

Leu Val Met Ser Tyr Val Ala Ala Val Cys Gly Lys Gly Glu Gln Val

115 120 125

Asn Ser Val Lys Glu Gln Leu Leu Gln Ser Asn Pro Val Leu Glu Ala

130 135 140

Phe Gly Asn Ala Lys Thr Ile Arg Asn Asn Asn Ser Ser Arg Phe Gly

145 150 155 160

Lys Tyr Met Asp Ile Glu Phe Asp Phe Lys Gly Ser Pro Leu Gly Gly

165 170 175

Val Ile Thr Asn Tyr Leu Leu Glu Lys Ser Arg Val Val Lys Gln Leu

180 185 190

Glu Gly Glu Arg Asn Phe His Ile Phe Tyr Gln Leu Leu Ala Gly Ala

195 200 205

Asp Ala His Leu Leu Glu Ala Leu Lys Leu Glu Arg Asp Thr Ser His

210 215 220

Tyr Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Val Ser Arg Val Asp Gly Met Asp Asp

225 230 235 240

Ala Ser Asn Phe Lys Ser Val Gln Asn Ala Met Thr Val Ile Gly Phe

245 250 255

Ser Glu Val Glu Ile Gln Gln Val Leu Glu Val Thr Ala Leu Val Leu

260 265 270

Lys Leu Gly Asn Val Glu Leu Ala Asp Glu Ser Gln Ala Asn Gly Thr

275 280 285

Ser Ala Ser Gly Ile Arg Asp Gly Arg Gly Val Gln Glu Ile Gly Glu

290 295 300

Met Ile Gly Leu Asn Ser Glu Glu Leu Glu Lys Ala Leu Cys Ser Arg

305 310 315 320

Thr Met Lys Thr Ala Lys Glu Glu Val Val Thr Thr Leu Asn Phe Thr

325 330 335

Gln Ala Gln Tyr Ala Arg Asp Ala Leu Ala Lys Asn Ile Tyr Ser Arg

340 345 350

Leu Phe Asn Trp Ile Val Asn Arg Ile Asn Glu Ser Ile Lys Val Gly

355 360 365

Ser Gly Glu Lys Lys Lys Val Met Gly Val Leu Asp Ile Tyr Gly Phe

370 375 380

Glu Ile Leu Lys Asp Asn Ser Phe Glu Gln Phe Val Ile Asn Tyr Cys

385 390 395 400

Asn Glu Lys Leu Gln Gln Val Phe Ile Glu Met Thr Leu Lys Glu Glu

405 410 415

Gln Glu Glu Tyr Lys Arg Glu Gly Ile Pro Trp Thr Lys Val Asp Tyr

420 425 430

Phe Asp Asn Gly Ile Ile Cys Asn Leu Ile Glu His Asn Gln Gln Gly

435 440 445

Ile Leu Ala Met Leu Asp Glu Glu Cys Leu Arg Pro Gly Val Val Ser

450 455 460

Asp Ser Thr Phe Leu Ala Lys Leu Asn Gln Val Phe Ser Lys His Gly

465 470 475 480

Phe Tyr Glu Ser Lys Val Thr Gln Asn Ala Gln Arg Gln Tyr Asp His

485 490 495

Thr Met Gly Leu Ser Cys Phe Arg Ile Cys His Tyr Ala Gly Lys Val

500 505 510

Thr Tyr Asn Val Asn Gly Phe Ile Asp Lys Asn Asn Asp Leu Leu Phe

515 520 525

Arg Asp Leu Ser Gln Ala Met Trp Lys Ala Gln His Pro Leu Leu Gln

530 535 540

Ser Leu Phe Pro Glu Gly Val Pro Thr Gln Thr Ser Leu Lys Arg Pro

545 550 555 560

Pro Thr Ala Gly Ala Gln Phe Lys Ser Ser Val Ala Ile Leu Met Lys

565 570 575

Asn Leu Tyr Ser Lys Asn Pro Asn Tyr Ile Arg Cys Ile Lys Pro Asn

580 585 590

Glu His Gln Gln Arg Gly Gln Phe Ser Ser Glu Leu Val Ala Val Gln

595 600 605

Thr Arg Tyr Leu Gly Leu Leu Glu Asn Val Arg Val Arg Arg Ala Gly

610 615 620

Tyr Ala Tyr Arg Gln Arg Tyr Gly Pro Phe Leu Glu Arg Tyr Arg Leu

625 630 635 640

Leu Gly Arg Ser Thr Trp Pro Arg Trp Asn Gly Gly Asp Arg Glu Gly

645 650 655

Val Glu Lys Val Leu Gly Glu Leu Ser Leu Ser Ser Glu Glu Leu Ala

660 665 670

Phe Gly Lys Thr Lys Ile Phe Ile Arg Ser Pro Lys Thr Leu Phe Tyr

675 680 685

Leu Glu Glu Lys Arg Arg Leu Arg Leu Gln Gln Leu Ala Thr Leu Ile

690 695 700

Gln Lys Ile Tyr Arg Gly Trp Arg Cys Arg Ile His Tyr Gln Leu Met

705 710 715 720

Arg Lys Ser Gln Ile Leu Ile Ser Ser Trp Phe Arg Gly Asn Met Gln

725 730 735

Arg Lys Arg Tyr Ala Lys Ile Lys Ala Ser Val Val Leu Ile Gln Ala

740 745 750

Phe Val Arg Gly Trp Lys Ala Arg Lys Asp Tyr Arg Lys Tyr Phe Arg

755 760 765

Ser Gly Ala Ala Leu Thr Leu Ala Asp Phe Ile Tyr Lys Ser Met Thr

770 775 780

Gln Lys Phe Leu Leu Gly Leu Arg Asn Asn Leu Pro Ser Thr Asn Ile

785 790 795 800

Leu Asp Arg Thr Trp Pro Ala Ala Pro Tyr Arg Cys Phe Asn Thr Ala

805 810 815

Asn Gln Glu Leu Gln Gln Leu Phe Tyr Arg Trp Lys Cys Lys Arg Phe

820 825 830

Arg Asp Arg Leu Ser Pro Lys Gln Val Glu Ile Leu Lys Glu Lys Leu

835 840 845

Cys Ala Ser Glu Leu Phe Lys Gly Lys Lys Ala Ser Tyr Pro Gln Ser

850 855 860

Val Pro Ile Pro Phe Cys Gly Asp Tyr Leu Gly Leu Gln Gly Asn Pro

865 870 875 880

Lys Leu Gln Lys Leu Lys Gly Gly Glu Glu Gly Pro Val Leu Met Ala

885 890 895

Asp Thr Val Lys Lys Val Asn Arg Gly Asn Gly Lys Thr Ser Ser Arg

900 905 910

Ile Leu Leu Leu Thr Lys Gly His Val Ile Leu Ile Asp Thr Lys Lys

915 920 925

Ser Gln Ala Lys Thr Val Ile Gly Leu Asp Ser Val Ala Glu Val Ser

930 935 940

Val Thr Ser Phe Lys Asp Gly Leu Phe Ser Leu His Leu Asn Glu Ile

945 950 955 960

Ser Ser Val Gly Ser Arg Gly Asp Phe Leu Leu Val Ser Glu His Val

965 970 975

Ile Glu Leu Leu Thr Lys Met Tyr Gln Ala Val Leu Asp Ala Thr Gln

980 985 990

Arg Gln Leu Leu Ile Ser Val Thr Glu Lys Phe Ser Val Arg Phe Lys

995 1000 1005

Glu Ser Ser Val Ala Val Lys Val Ile Gln Gly Pro Glu Gly Asp

1010 1015 1020

Arg Asn Gly Lys Leu Lys Cys Lys Lys Lys Gly Ser Arg Cys Leu

1025 1030 1035

Glu Val Thr Val

1040

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Myo1a F1引物

<400> 7

gaaaatactt ccggtcaggt g 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Myo1a R1引物

<400> 8

caagggttct tcatctctga gt 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Myo1a F2引物

<400> 9

taccagtgga agtgcaagaa gt 22

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Myo1a R2+T7引物

<400> 10

taatacgact cactataggg acactacgaa gttctgctcc ag 42

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gabra2 F1/F2引物

<400> 11

acttggttac ttttgggctg t 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gabra2 R1引物

<400> 12

tgattgaagt gagctgaaag gt 22

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gabra2 R2+T7引物

<400> 13

taatacgact cactataggg aacatccttt catggtgact ca 42

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TrkB-F1引物

<400> 14

ctgagagggc cagtcacttc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TrkB-R1引物

<400> 15

catggcaggt caacaagcta 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TrkB-F2引物

<400> 16

cagtgggtct cagcacagaa 20

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TrkB-R2+T7引物

<400> 17

taatacgact cactataggg ctaggaccag gatggctctg 40

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Myo1a F引物

<400> 18

ctacgagcag cttcccatct 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Myo1a R引物

<400> 19

ccacatttgc caaagcatag 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gabra2 F引物

<400> 20

acaaaaagag gatgggcttg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gabra2 R引物

<400> 21

tcatgacgga gcctttctct 20

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Wfdy1 F引物

<400> 22

aaaggccgga cactcctc 18

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Wdfy1 R引物

<400> 23

tgagctgcag gtagcacagt 20

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nnt F引物

<400> 24

cctggtggca ccttcgta 18

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nnt R引物

<400> 25

ctgagcccag gtacatgatt t 21