从微生物细胞培养物中纯化抗真菌化合物和胞外多糖的方法与流程

本申请要求于2016年3月3日提交的第62/303,171号美国临时专利申请的优先权，所述临时专利申请全文以引用的方式纳入本说明书。本发明涉及处理微生物细胞培养物以浓缩或纯化由微生物细胞产生的脂肽和胞外多糖的方法。
背景技术：
：杀真菌剂具有众多用途，包括用于作物保护；作为食品、饲料和化妆品防腐剂；以及作为用于人和兽医应用的治疗剂。在发达国家和发展中国家均存在作物减产、食源性疾病以及人和动物的真菌感染的问题。合成杀虫剂或杀真菌剂通常是非特异性的，因此可以作用于除靶生物体之外的生物体，包括其他天然存在的有益的生物体。由于它们的化学性质，它们也可能是有毒的和不可生物降解的。全世界的消费者越来越意识到与化学品残留相关的潜在环境和健康问题，特别是在食品中。这已经导致消费者在减少化学(即，合成)农药的使用或至少减少其用量方面的压力在不断增加。因此，需要管理食物链需求，同时仍允许有效的害虫防治。另一个随着合成杀虫剂或杀真菌剂的使用而出现的问题是，重复和单独施用杀虫剂或杀真菌剂通常导致对抗性病原微生物的选择。通常，这样的菌株还对其他具有相同作用方式的活性成分具有交叉抗性。这消除了活性化合物对病原体的有效防治。然而，开发具有新作用机制的活性成分困难且昂贵。病原体种群中抗性发展的风险以及环境和人类健康的担忧促进了对鉴定用于管理植物病害的合成杀虫剂和杀真菌剂的替代方案的兴趣。生物防治剂的使用是一种替代方案。非核糖体肽(如杀镰孢菌素(fusaricidins))的抗微生物特性是公认的，并已用于作物保护领域。由于它们的作用方式，它们还在生物医药和其他生物技术应用中具有潜在的用途。杀镰孢菌素可从类芽孢杆菌属(paenibacillussp.)分离，并且具有环结构，该结构由6个氨基酸残基及15-胍基-3-羟基十五烷酸组成。分离自多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)的杀镰孢菌素包括li-f03、li-f04、li-f05、li-f07和li-f08(kurusuk,ohbak,araitandfukushimak.,j.antibiotics,40:1506-1514,1987)，并且已报道其他的杀镰孢菌素a、b、c和d(kajimurayandkanedam.,j.antibiotics,49:129-135,1996；kajimurayandkanedam.,j.antibiotics,50:220-228,1997)。已知某些杀镰孢菌素具有对抗植物致病真菌如尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、黑曲霉(aspergillusniger)、米曲霉(aspergillusoryzae)和托姆青霉(penicilliumthomii)的杀菌活性。一些杀镰孢菌素还具有对抗包括金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)在内的革兰氏阳性细菌的杀菌活性(kajimurayandkanedam.,j.antibiotics,49:129-135,1996；kajimurayandkanedam.,j.antibiotics,50:220-228,1997)。此外，已发现特定的杀镰孢菌素具有对抗引起加拿大油菜(canola)的黑根腐病的斑点小球腔菌(leptosphaeriamaculans)的抗真菌活性(beattyphandjensense.,can.j.microbiol.,48:159-169,2002)。需要鉴定在发酵培养液中富集活性化合物如杀镰孢菌素的有效方法。这可能是特别困难的，因为这样的发酵培养液通常含有增加发酵培养液粘度的高水平的胞外多糖(eps)和其他生物聚合物，从而使富集过程更具挑战性。eps为高分子量聚合物，其由糖残基组成并且由多种微生物将其分泌到周围环境中。微生物合成广谱的多功能多糖，包括细胞内多糖、荚膜多糖和胞外多糖(eps)。胞外多糖通常由改性的单糖和推测为一些非糖取代物(如乙酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐和磷酸盐)组成。多种eps(如葡聚糖和果聚糖)分别在糖基转移酶或果糖基转移酶的活性下于细胞外产生，其使用二糖蔗糖作为主要底物并且由微生物将其分泌到培养基中。这些酶在第一步中使蔗糖裂解，然后将葡萄糖或果糖转移到形成葡聚糖或果聚糖的增长的糖聚合物中。随后代谢剩余的游离糖单体。出于商业目的，eps目前通过下游处理(例如酒精沉淀)从分离生物质后的发酵培养液中分离(donot,f.,fontana,a.,baccou,j.c.,&schorr-galindo,s.,carbohydratepolymers,87:951-962,2012)。目前用于将发酵培养液中的eps与活性化合物分离的下游处理可能是昂贵的并且降解活性化合物。粘性生物聚合物的合成阻碍了发酵过程(即，搅拌和氧合作用)以及高度纯化分子的回收。需要一种将发酵培养液中的粘性生物聚合物与活性化合物分离同时保持这些化合物的活性的价格低廉、高效的方法。技术实现要素：本发明涉及在微生物细胞培养物中富集脂肽的方法，所述方法包括：a)将两亲性磺酸盐和/或两亲性硫酸盐与细胞培养物混合以诱导含有脂肽的聚集体的形成；b)离心细胞培养物以产生上清液级分和沉淀级分；c)将沉淀级分与上清液级分分离；d)将沉淀级分与聚氧乙烯二醇烷基醚(polyoxyethyleneglycolalkylether)混合以从聚集体中释放出脂肽。在某些方面，脂肽选自伊枯草菌素型(iturin-type)化合物、芬荠素型(fengycin-type)化合物、枯草菌表面活性素(surfactin-type)型化合物、杀镰孢菌素型(fusaricidin-type)化合物及其组合。在一方面，脂肽为杀镰孢菌素型化合物。在一些实施方案中，所述杀镰孢菌素型化合物选自杀镰孢菌素a、杀镰孢菌素b、杀镰孢菌素c、杀镰孢菌素d、li-f03、li-f04、li-f05、li-f06、li-f07、li-f08、paeniserinea1、paeniserinea2、paeniserinea3、paeniserinea4、paeniserineb1、paeniserineb2、paeniserineb3、paeniserineb4、paeniserinec1、paeniserinec2、paeniserinec3、paeniserinec4、paeniprolixina1、paeniprolixina2、paeniprolixinb1、paeniprolixinb2、paeniprolixinc1、paeniprolixinc2、paeniprolixind1、paeniprolixind2、paeniprolixine1、paeniprolixine2、paeniprolixinf1、paeniprolixinf2及其组合。在其他实施方案中，将两亲性磺酸盐与细胞培养物混合，并且所述两亲性磺酸盐为式(i)的化合物：其中r1和r2独立地为直链或支链c1-20烷基或直链或支链c2-20烯基；m为h+、li+、na+、k+或(c1-8烷基)4n+。在一方面，r1和r2独立地为直链或支链c8烷基。在另一方面，磺酸盐为磺基琥珀酸二辛基酯；1,4-双(2-乙基己氧基)-1,4-二氧代丁烷-2-磺酸盐；或其li+、na+、k+或(c1-8烷基)4n+盐。在其他实施方案中，两亲性硫酸盐与细胞培养物混合，并且所述两亲性硫酸盐为烷基硫酸盐。在一个实施方案中，所述烷基硫酸盐为式(ii)的化合物：其中r1和r2独立地为h、直链或支链c1-20烷基或直链或支链c2-20烯基；m为h+、li+、na+、k+或(c1-8烷基)4n+；条件是r1和r2不都为h。在一方面，r1和r2独立地为支链c3-20烷基。在另一方面，烷基硫酸盐为7-乙基-2-甲基-4-十一烷基硫酸盐或其li+、na+、k+或(c1-8烷基)4n+盐。在另一方面，r1为h且r2为支链c3-20烷基。在一个实施方案中，烷基硫酸盐为2-乙基己基硫酸盐或其li+、na+、k+或(c1-8烷基)4n+盐。在其他实施方案中，将两亲性磺酸盐与细胞培养物混合，并且所述两亲性磺酸盐为直链烷基苯磺酸盐或支链烷基苯磺酸盐。在某些实施方案中，两亲性磺酸盐为式(iii)的直链烷基苯磺酸盐：其中r1和r2独立地为h或直链c1-20烷基；且m为h+、li+、na+、k+或(c1-8烷基)4n+；条件是r1和r2不都为h。在一个实施方案中，r1和r2形成c10-16烷基链。在另一个实施方案中，直链烷基苯磺酸盐为十二烷基苯磺酸盐或其li+、na+、k+或(c1-8烷基)4n+盐。在某些方面，聚氧乙烯二醇烷基醚为具有cnh2n+1(och2ch2)moh的分子式的化合物，其中m为1-120的整数；且n为1-20的整数。在一些方面，n为8、10、12、14、16、18或20。在一方面，n为12或18。在其他方面，m为5-100的整数。在一个实施方案中，m为25。在另一个实施方案中，m为100。在其他实施方案中，本发明涉及从微生物细胞培养物中纯化胞外多糖(eps)的方法，所述方法包括：a)将两亲性磺酸盐和/或两亲性硫酸盐与细胞培养物混合以诱导聚集体的形成；b)离心细胞培养物以产生上清液级分和沉淀级分；c)将上清液级分与沉淀级分分离；d)向上清液级分中加入醇以沉淀eps；e)从上清液级分中移出沉淀的eps。在某些方面，eps选自葡聚糖、果聚糖、凝胶多糖、胶凝糖(gellan)、黄原胶、乳胶(emulsan)、葡聚糖(dextran)、纤维素及其组合。在其他实施方案中，本发明涉及从微生物细胞培养物中纯化水溶性生物聚合物的方法，所述方法包括：a)将两亲性磺酸盐和/或两亲性硫酸盐与细胞培养物混合诱导聚集体的形成；b)离心细胞培养物以产生上清液级分和沉淀级分；c)将上清液级分与沉淀级分分离；d)向上清液级分中加入醇以沉淀生物聚合物；e)从上清液级分中移出沉淀的生物聚合物。在其他方面，在将微生物细胞培养物的ph调节到约4至约7，然后将其与两亲性磺酸盐和/或两亲性硫酸盐混合。在一个方面，将微生物细胞培养物的ph调节至约6。在其他实施方案中，在离心之前，将盐以约0.5％至约5％的浓度添加到微生物细胞培养物中。在一个实施方案中，将氯化钠或氯化钾以约2％的浓度添加到微生物细胞培养物中。在另一方面，微生物细胞培养物包含类芽孢杆菌属、芽孢杆菌属(bacillussp.)和/或假单胞菌属(pseudomonassp.)的菌株。在一个实施方案中，微生物细胞培养物包含类芽孢杆菌属菌株nrrlb-50972、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)菌株nrrlb-21661和/或具有各自菌株的所有鉴定特征的杀真菌突变菌株。附图说明图1描绘了利用经灰葡萄孢(botrytiscinerea)(botrci)接种的幼苗所测得的抗真菌活性。将类芽孢杆菌属nrrlb-50972的全培养液(“wb”)、以及将全培养液以24,790×g的rcf离心后形成的沉淀级分(“沉淀”)和上清液级分(“sup”)的抗真菌活性与未处理的对照物(“水”)进行比较。图2描绘了来自不使用任何离心助剂对类芽孢杆菌属nrrlb-50972的全培养液进行离心而得到的沉淀物的照片，标记为“wb-sdos”，以及经离心的混有(sdos)的全培养液，标记为“wb+sdos”。图3描绘了来自另一种已知能产生相对高水平eps的类芽孢杆菌菌株的全培养液在使用或不使用(sdos)下，以17,000×g的rcf离心5分钟后所形成得沉淀物。图4描绘了含有(sdos)或纯化sdos的沉淀级分和上清液级分中杀镰孢菌素a的相对量。图5a-5e描绘了类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液在使用或不使用(sdos)的情况下进行离心，所产生的培养液浓缩物和上清液的粒度分析。图6描绘了由ph调节至3、6或10并使用了(sdos)进行离心的类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液所形成的沉淀物的照片。图7a描绘了在除(sdos)之外还使用其他化合物的条件下，由类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液形成的沉淀物的照片。图7b描绘了沉淀级分和上清液级分的照片，其为证实4(7-乙基-2-甲基-4-十一烷基硫酸钠)具有与(sdos)相似效果的更大规模的实验。图8描绘了在单独含有(sdos)或含有其与聚氧乙烯(25)十二烷基醚(也称为c12eo25)或l23(聚氧乙烯(23)十二烷基醚；也称为c12eo23)的组合物的上清液级分和沉淀级分中，杀镰孢菌素a的相对量。图9描绘了在单独含有(sdos)或含有其与作为释放助剂的几种化合物之一的组合物的沉淀级分中，杀镰孢菌素a的相对量。图10描绘了添加释放助剂c12eo25后，沉淀级分的可悬浮性增加。图11描绘了在使用(sdos)作为离心助剂和s100(聚氧乙烯(100)十八烷基醚)作为释放助剂的条件下，五批类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液及相应的培养液浓缩物中杀镰孢菌素a的相对量。图12描绘了在使用或不使用(sdos)的情况下，将枯草芽孢杆菌菌株nrrlb-21661的粘性全培养液(wb)以1,500×grcf离心5分钟后，所形成的沉淀物。图13描绘了在使用(sdos)作为离心助剂和s100(聚氧乙烯(100)十八烷基醚)作为释放助剂的情况下，类芽孢杆菌属nrrlb-50972和另外两种类芽孢杆菌菌株所产生的全培养液(“wb”)及相应的上清液(“sup”)及培养液浓缩物(“bc”)中，杀镰孢菌素a的相对量。具体实施方式如本文所使用的，在本说明书和权利要求中使用的动词“包含”及其变形以其非限制性意义使用，用于意指包括该词之后的项目，但不排除未明确提及的项目。另外，由不定冠词“一”或“一个”提及的要素不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个该要素。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。如本文所使用的，术语“两亲性”描述了具有亲水和亲脂性质的化合物。在某些方面，与细胞培养物混合的两亲性磺酸盐和/或两亲性硫酸盐的浓度(％重量/体积)为约0.01％至约1.0％；例如，约0.01％至约1.0％之间的任何范围，如约0.01％至约0.5％、约0.05％至约0.2％、约0.1％至约0.2％等。在其他方面，与细胞培养物混合的两亲性磺酸盐和/或两亲性硫酸盐的浓度(％重量/体积)为至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.04％、至少0.05％、至少0.06％、至少0.07％、至少0.08％、至少0.09％、至少0.10％、至少0.12％、至少0.14％、至少0.16％、至少0.18％或至少0.20％。在某些方面，与沉淀级分或上清液级分混合的聚氧乙烯二醇烷基醚浓度(％重量/体积)为约0.01％至约1.0％；例如，约0.01％至约1.0％之间的任何范围，如约0.01％至约0.5％、约0.05％至约0.2％、约0.1％至约0.2％等。在其他方面，与沉淀级分或上清液级分混合的聚氧乙烯二醇烷基醚浓度(％重量/体积)为至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.04％、至少0.05％、至少0.06％、至少0.07％、至少0.08％、至少0.09％、至少0.10％、至少0.12％、至少0.14％，至少0.16％、至少0.18％或至少0.20％。在其他方面，与细胞培养物或由其产生的级分混合的两亲性磺酸盐和/或两亲性硫酸盐与聚氧乙烯二醇烷基醚之比(重量/重量)为约50:1至约1:50；例如，约50:1至约1:50范围内的任何范围，如约40:1至约1:40、约30:1至约1:30、约25:1至约1:25、约20:1至约1:20、约15:1至约1:15、约10:1至约1:10、约5:1至约1:5或约2:1至约1:2。在一些方面，与细胞培养物或由其产生的级分混合的两亲性磺酸盐和/或两亲性硫酸盐与聚氧乙烯二醇烷基醚之比(重量/重量)为约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。在一些实施方案中，细胞培养物以至少5,000rcf、至少10,000rcf、至少15,000rcf、至少20,000rcf、至少25,000rcf、至少30,000rcf、至少35,000rcf或至少40,000rcf的速度进行离心。在某些方面，将沉淀级分与羧酸的脱水山梨醇酯的聚氧乙烯衍生物混合以从聚集体中释放脂肽。在一个实施方案中，羧酸的脱水山梨醇酯的聚氧乙烯衍生物为式(iv)化合物：其中r1为c6-18烷基或c6-18烯基且w+x+y+z＝20。在一个实施方案中，式(iv)化合物为80(2-[2-[3,4-双(2-羟基乙氧基)氧杂环戊烷-2-基]-2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙基(e)-十八碳-9-烯酸酯，也称为聚氧乙烯脱水山梨醇油酸酯)。磺基琥珀酸二辛基酯钠以几种商业名称销售，包括geroponot、3667、3665、kph70和w10。脂肽包括但不限于可从各种细菌(包括芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、假单胞菌属和链霉菌属(streptomycessp.))中获得的两亲性环肽。在一方面，微生物细胞培养物包含类芽孢杆菌属的菌株。在另一方面，微生物细胞培养物包含来自以下任何一种类芽孢杆菌属的菌株：p.agarexedens、p.agaridevorans、解藻阮酸类芽孢杆菌(p.alginolyticus)、p.alkaliterrae、蜂房类芽孢杆菌(p.alvei)、p.amylolyticus、p.anaericanus、南极类芽孢杆菌(p.antarcticus)、p.assamensis、氮还原类芽胞杆菌(p.azoreducens)、固氮类芽胞杆菌(p.azotofixans)、巴塞罗那类芽孢杆菌(p.barcinonensis)、北方贝属类芽孢杆菌(p.borealis)、巴西曲霉类芽孢杆菌(p.brasiliensis)、芸苔属类芽孢杆菌(p.brassicae)、坎皮纳斯类芽孢杆菌(p.campinasensis)、p.chinjuensis、嗜几丁质类芽孢杆菌(p.chitinolyticus)、软骨素类芽孢杆菌(p.chondroitinus)、p.cineris、p.cookie、解凝乳类芽胞杆菌(p.curdlanolyticus)、大田类芽孢杆菌(p.daejeonensis)、树形类芽孢杆菌(p.dendritiformis)、杜伦麦类芽孢杆菌(p.durum)、爱媛类芽孢杆菌(p.ehimensis)、p.elgii、p.favisporus、p.glucanolyticus、解聚糖类芽孢杆菌(p.glycanilyticus)、戈氏类芽孢杆菌(p.gordonae)、小麦类芽孢杆菌(p.graminis)、p.granivorans、p.hodogayensis、依利诺斯类芽孢杆菌(p.illinoisensis)、加米那类芽孢杆菌(p.jamilae)、神户类芽孢杆菌(p.kobensis)、p.koleovorans、韩国类芽孢杆菌(p.koreensis)、克里布所类芽孢杆菌(p.kribbensis)、乳酸类芽孢杆菌(p.lactis)、幼虫类芽孢杆菌(p.larvae)、灿烂类芽孢杆菌(p.lautus)、缓病类芽孢杆菌(p.lentimorbus)、浸麻类芽孢杆菌(p.macerans)、马阔里类芽孢杆菌(p.macquariensis)、马赛类芽孢杆菌(p.massiliensis)、p.mendelii、p.motobuensis、p.naphthalenovorans、嗜线虫类芽孢杆菌(p.nematophilus)、土味类芽孢杆菌(p.odorifer)、饲料类芽孢杆菌(p.pabuli)、皮奥利亚类芽孢杆菌(p.peoriae)、海枣类芽孢杆菌(p.phoenicis)、叶球形类芽孢杆菌(p.phyllosphaerae)、多粘类芽孢杆菌(p.polymyxa)、日本类芽孢杆菌(p.popilliae)、尘埃类芽孢杆菌(p.pulvifaciens)、p.rhizosphaerae、血红类芽孢杆菌(p.sanguinis)、星孢类芽孢杆菌(p.stellifer)、土地类芽孢杆菌(p.terrae)、解硫胺素类芽孢杆菌(p.thiaminolyticus)、p.timonensis、p.tylopili、p.turicensis、强壮类芽孢杆菌(p.validus)、p.vortex、伤口类芽孢杆菌(p.vulneris)、p.wynnii、解木聚糖类芽孢杆菌(p.xylanilyticus)及其组合。在另一方面，微生物细胞培养物包含芽孢杆菌属的菌株。在某些方面，微生物细胞培养物包含来自以下任何一种芽孢杆菌属的菌株：酸快生芽孢杆菌(b.acidiceler)、酸居芽孢杆菌(b.acidicola)、产酸芽孢杆菌(b.acidiproducens)、b.aeolius、空气芽孢杆菌(b.aerius)、嗜气芽孢杆菌(b.aerophilus)、黏琼脂芽孢杆菌(b.agaradhaerens)、艾丁湖芽孢杆菌(b.aidingensis)、秋叶氏芽孢杆菌(b.akibai)、嗜碱芽孢杆菌(b.alcalophilus)、居藻芽孢杆菌(b.algicola)、b.alkalinitrilicus、b.alkalisediminis、碱土芽孢杆菌(b.alkalitelluris)、高地芽胞杆菌(b.altitudinis)、香鱼海槽芽孢杆菌(b.alveayuensis)、解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)、炭疽芽孢杆菌(b.anthracis)、海水芽孢杆菌(b.aquimaris)、砷芽孢杆菌(b.arsenicus)、阿氏芽孢杆菌(b.aryabhattai)、丰井氏芽胞杆菌(b.asahii)、萎缩芽孢杆菌(b.atrophaeus)、橙黄色芽孢杆菌(b.aurantiacus)、产氮假单胞菌(b.azotoformans)、栗褐芽孢杆菌(b.badius)、罕见芽孢杆菌(b.barbaricus)、巴达维亚芽孢杆菌(b.bataviensis)、北京芽孢杆菌(b.beijingensis)、食苯芽胞杆菌(b.benzoevorans)、b.beveridgei、博戈里亚芽孢杆菌(b.bogoriensis)、嗜硼芽孢杆菌(b.boroniphilus)、食丁酸芽孢杆菌(b.butanolivorans)、b.canaveralius、嗜碳芽孢杆菌(b.carboniphilus)、b.cecembensis、解纤维芽孢杆菌(b.cellulosilyticus)、蜡样芽孢杆菌(b.cereus)、恰甘诺湖芽孢杆菌(b.chagannorensis)、长安芽孢杆菌(b.chungangensis)、食物芽孢杆菌(b.cibi)、环状芽孢杆菌(b.circulans)、克氏芽孢杆菌(b.clarkii)、克劳氏芽孢杆菌(b.clausii)、凝结芽孢杆菌(b.coagulans)、b.coahuilensis、寇氏芽胞杆菌(b.cohnii)、腐叶芽孢杆菌(b.decisifrondis)、脱色芽孢杆菌(b.decolorationis)、钻特省芽孢杆菌(b.drentensis)、混料芽孢杆菌(b.farraginis)、苛求芽孢杆菌(b.fastidiosus)、坚固芽孢杆菌(b.firmus)、弯曲芽孢杆菌(b.flexus)、小孔芽孢杆菌(b.foraminis)、油桐芽孢杆菌(b.fordii)、强壮芽孢杆菌(b.foris)、b.fumarioli、绳索状芽孢杆菌(b.funiculus)、解半乳糖芽孢杆菌(b.galactosidilyticus)、b.galliciensis、明胶芽孢杆菌(b.gelatini)、吉氏芽孢杆菌(b.gibsonii)、人参芽孢杆菌(b.ginsengi)、人参土芽孢杆菌(b.ginsengihumi)、小麦芽孢杆菌(b.graminis)、盐敏芽孢杆菌(b.halmapalus)、b.halochares、耐盐芽孢杆菌(b.halodurans)、解半纤维素芽孢杆菌(b.hemicellulosilyticus)、b.herbertsteinensis、堀越氏芽孢杆菌(b.horikoshi)、b.horneckiae、花园芽孢杆菌(b.horti)、土地芽孢杆菌(b.humi)、花津滩芽孢杆菌(b.hwajinpoensis)、病研所芽孢杆菌(b.idriensis)、印度芽胞杆菌(b.indicus)、婴儿芽胞杆菌(b.infantis)、下层芽孢杆菌(b.infernus)、伊氏芽孢杆菌(b.isabeliae)、b.isronensis、咸海鲜芽孢杆菌(b.jeotgali)、韩国芽孢杆菌(b.koreensis)、库尔勒芽孢杆菌(b.korlensis)、胶冻样芽孢杆菌(b.kribbensis)、克鲁氏芽孢杆菌b.krulwichiae、列城芽孢杆菌b.lehensis、迟缓芽胞杆菌(b.lentus)、地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)、岸滨芽胞杆菌(b.litoralis)、盐地芽孢杆菌(b.locisalis)、路西法芽孢杆菌(b.luciferensis)、浅黄芽孢杆菌(b.luteolus)、澳门芽孢杆菌(b.macauensis)、马氏芽孢杆菌(b.macyae)、解甘露醇糖芽孢杆菌(b.mannanilyticus)、黄海芽孢杆菌(b.mariflavi)、b.marmarensis、马赛芽孢杆菌(b.massiliensis)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、甲醇芽孢杆菌(b.methanolicus)、甲基营养型芽胞杆菌(b.methylotrophicus)、莫哈维芽孢杆菌(b.mojavensis)、壁芽孢杆菌(b.muralis)、马丁教堂芽孢杆菌(b.murimartini)、蕈状芽孢杆菌(b.mycoides)、南海芽孢杆菌(b.nanhaiensis)、南海沉积物芽孢杆菌(b.nanhaiisediminis)、尼氏芽孢杆菌(b.nealsonii)、雷州芽孢杆菌(b.neizhouensis)、农研所芽孢杆菌(b.niabensis)、烟酸芽孢杆菌(b.niacini)、休闲地芽孢杆菌(b.novalis)、海泥芽孢杆菌(b.oceanisediminis)、奥德赛芽孢杆菌(b.odysseyi)、奥哈芽孢杆菌(b.okhensis)、奥飞騨芽孢杆菌(b.okuhidensis)、蔬菜芽孢杆菌(b.oleronius)、大岛芽孢杆菌(b.oshimensis)、b.panaciterrae、巴塔哥尼亚芽孢杆菌(b.patagoniensis)、b.persepolensis、海绵芽孢杆菌(b.plakortidis)、抱川芽孢杆菌(b.pocheonensis)、b.polygoni、假嗜碱芽孢杆菌(b.pseudoalcaliphilus)、假坚强芽孢杆菌(b.pseudofirmus)、假真菌芽孢杆菌(b.pseudomycoides)、忍冷芽孢杆菌(b.psychrosaccharolyticus)、短小芽孢杆菌(b.pumilus)、青岛芽孢杆菌(b.qingdaonensis)、井水芽孢杆菌(b.rigui)、农庄芽孢杆菌(b.ruris)、沙福芽孢杆菌(b.safensis)、盐芽孢杆菌(b.salarius)、喜盐芽孢杆菌(b.saliphilus)、施氏芽孢杆菌(b.schlegelii)、硒砷芽孢杆菌(b.selenatarsenatis)、还原硒酸盐芽孢杆菌(b.selenitireducens)、西岸芽孢杆菌(b.seohaeanensis)、沙氏芽孢杆菌(b.shackletonii)、暹罗芽孢杆菌(b.siamensis)、简单芽孢杆菌(b.simplex)、青贮窖芽孢杆菌(b.siralis)、史氏芽孢杆菌(b.smithii)、土壤芽孢杆菌(b.soli)、盐土芽孢杆菌(b.solisalsi)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(b.sonorensis)、耐热芽孢杆菌(b.sporothermodurans)、同温层芽孢杆菌(b.stratosphericus)、地下芽孢杆菌(b.subterraneus)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、b.taeansis、特基拉芽孢杆菌(b.tequilensis)、热南极芽孢杆菌(b.thermantarcticus)、热嗜淀粉芽孢杆菌(b.thermoamylovorans)、b.thermocloacae、b.thermolactis、产硫芽孢杆菌(b.thioparans)、苏云金芽孢杆菌(b.thuringiensis)、b.tripoxylicola、b.tusciae、死谷芽孢杆菌(b.vallismortis)、威氏芽孢杆菌(b.vedderi)、越南芽孢杆菌(b.vietnamensis)、原野芽孢杆菌(b.vireti)、和光芽孢杆菌(b.wakoensis)、威恩施蒂芽孢杆菌(b.weihenstephanensis)、小溪芽孢杆菌(b.xiaoxiensis)及其组合。在另一方面，微生物细胞培养物包含假单胞菌属的菌株。在某些方面，微生物细胞培养物包含来自以下任何一种假单胞菌属物种的菌株：南极假单胞菌(p.antarctica)、产氮假单胞菌(p.azotoformans)、p.blatchfordae、油菜假单胞菌(p.brassicacearum)、布氏假单胞菌(p.brenneri)、p.cedrina、p.corrugate、荧光假单胞菌(p.fluorescens)、盖氏假单胞菌(p.gessardii)、p.libanensis、孟氏假单胞菌(p.mandelii)、边缘假单胞菌(p.marginalis)、p.mediterranea、p.meridian、米氏假单胞菌(p.migulae)、霉味假单胞菌(p.mucidolens)、p.orientalis、p.panacis、p.protegens、解朊假单胞菌(p.proteolytica)、罗氏假单胞菌(p.rhodesiae)、类黄假单胞菌(p.synxantha)、赛维瓦尔假单胞菌(p.thivervalensis)、托拉假单胞菌(p.tolaasii)、韦龙氏假单胞菌(p.veronii)及其组合。如本文所使用的，术语“脂肽”可以指两亲性环肽和抗微生物肽。两亲性环肽通常由与β-氨基或β-羟基脂肪酸连接的几种α-氨基酸组成，包括但不限于芬荠素型化合物、伊枯草菌素型化合物、枯草菌表面活性素型化合物、杀镰孢菌素类、粘液菌素(viscosin)类、amphisin类、托拉氏毒素(tolaasin)类、丁香霉素(syringomycin)类和putisolvin类。伊枯草菌素型化合物由七个氨基酸组成，并与β-氨基脂肪酸连接。某些脂肽的脂肪酸链的长度为c14至c17不等。这些化合物可从不同的芽孢杆菌属(包括枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌)获得。伊枯草菌素及其变体记载在ongena等人，“bacilluslipopeptides：versatileweaponsforplantdiseasebiocontrol”，trendsinmicrobiology，16(3):115-125，(2007)中。本发明的伊枯草菌素型化合物包括一种或多种下列化合物：杆菌抗霉素d(bacillomycind)、杆菌抗霉素f、杆菌抗霉素l、杆菌抗霉素lc(也称为bacillopeptin)、mycosubtilin、伊枯草菌素a、伊枯草菌素al和伊枯草菌素c(这里提及的后三种化合物统称为伊枯草菌素)。芬荠素型化合物由与具有链长为c14到c18不等的链的β-羟基脂肪酸连接的十个氨基酸组成。这些化合物可从不同的芽孢杆菌属(包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌)和链霉菌属获得。芬荠素型化合物记载于ongena，参见上文。适用于本文所述组合物的芬荠素型化合物包括芬荠素a、芬荠素b、大侧柏酸a(plipastatina)、大侧柏酸b、来自链霉菌属的大侧柏酸(记载在kimura等人的“sna60-367-newpeptideenzymeinhibitorsagainstaromatase”，journalofantibiotics，50(6)：529-531，(1997))和agrastatin类(如第6,291,426号美国专利中记载的(这里提及的后四个列表项统称为大侧柏酸))。枯草菌表面活性素型化合物由与具有链长为c13至c16不等的链的β-羟基脂肪酸连接的七个氨基酸组成。这些化合物可从不同的芽孢杆菌属(包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)获得。枯草菌表面活性素家族的化合物记载于ongena，参见上文。本发明的枯草菌表面活性素化合物包括一种或多种下列化合物：望菌素(esperin)、地衣素(lichenysin)、pumilacidin和表面活性素(surfactin)。杀镰孢菌素型化合物由与15-胍基-3-羟基十五烷酸连接的六个氨基酸组成。这些化合物可从类芽孢杆菌属(包括多粘菌)获得。杀镰孢菌素家族的化合物记载于choi，s-k等人，“identificationandfunctionalanalysisofthefusaricidinbiosyntheticgeneofpaenibacilluspolymyxae681”，biochemicalandbiophysicalresearchcommunications，365：89-95，(2008)。本发明的杀镰孢菌素型化合物包括一种或多种下列化合物：杀镰孢菌素a、b、c和d以及杀镰孢菌素li-f03、li-f04、li-f05、li-f06、li-f07和li-f08。其他杀镰孢菌素型化合物包括paeniserine和paeniprolixin，记载在于2015年9月24日提交的第62/232,205号的美国专利中，其通过引用纳入本说明。paeniserine类和paeniprolixin类的实例包括paeniserinea1、paeniserinea2、paeniserinea3、paeniserinea4、paeniserineb1、paeniserineb2、paeniserineb3、paeniserineb4、paeniserinec1、paeniserinec2、paeniserinec3、paeniserinec4、paeniprolixina1、paeniprolixina2、paeniprolixinb1、paeniprolixinb2、paeniprolixinc1、paeniprolixinc2、paeniprolixind1、paeniprolixind2、paeniprolixine1、paeniprolixine2、paeniprolixinf1和paeniprolixinf2。粘液菌素类、amphisin类、托拉氏毒素类、丁香霉素类和putisolvin类由植物伴生假单胞菌属产生，如raaijmakers等人，(2006)molecularplant-microbeinteractions19(7)：699-710中所记载的。粘液菌素类包括粘液菌素、粘液菌素酰胺、massetolidea、massetolided、wlip、pseudophomina和pseudophominb。amphisin类包括amphisin、紧张素(tensin)、pholipeptina、lokisin和arthrofactin。托拉氏毒素类包括托拉氏毒素、fp-b、corpeptina、sp22和sp25a。丁香霉素类包括丁香霉素、syringostatin、syringotoxin、假霉素a(pseudomycina)和cormycina。putisolvin类包括putisolvini和putisolvinii。抗微生物肽记载在wang&wang(2004)nucleicacidsresearch32：d590-d592中。抗微生物肽可以为非核糖体合成的肽或核糖体合成的肽(ramp)。非核糖体合成的肽存在于细菌和真菌中。与核糖体支持的合成相反，这些抗微生物肽由肽合成酶组装。短杆菌肽(例如，短杆菌肽s、短杆菌肽d)、杆菌肽，多粘菌素b、蜂毒肽、杀菌肽和万古霉素为非核糖体合成的抗微生物肽的实例。zeitler等人，(2013)plosone8(8)：e71687。其他pantocina、pantocinb、多氧霉素(polyoxin)类、日光霉素(nikkomycin)类、rhizocitin、杆菌溶素(bacilysin)、灭瘟素(blasticidin)和灭粉霉素(mildiomycin)都是可用于要求保护的组合物或方法中的对植物病原体有活性的抗微生物肽。pep6、paf26、bpc194、pep3、pep11、bp76、camel、iseganan、d4e1、typ、esf12、esf1、pexiganan、msi-99、mb-39、pen4-1和d32r都是可用于要求保护的组合物或方法中的具有抗植物病原体活性的合成抗微生物肽。此外，杀菌肽a、b.tachyplesin、heliomicin/drosomycin、sacrotoxinia、贻贝防卫素(musseldefensin)、爪蟾抗菌肽(magainin)、esculentin-1、rs-afp2、alf-afp、spi1、drr230-a、bsd1、wt1、dm-amp1、mj-amp1、pn-amp、hordonthionin、α硫堇、afp、sb-37、shiva-1、sb37、mb-39、msra1、msi-99、myp30、rev4和d4e1都在转基因植物中表达，这些物质赋予针对病原体的至少局部性抗性，并且可用于本文所述的组合物和方法中。montesinos(2007)femsmicrobiollett270:1-11。可用本文公开的方法纯化的eps的非限制性列表包括：乙酰(木醋杆菌(acetobacterxylinum))；藻阮酸盐(棕色固氮菌(azotobactervinelandii))；纤维素(木醋杆菌(acetobacterxylinum))；壳聚糖(毛霉菌属(mucoralesspp.))；凝胶多糖(粪产碱菌腈水解酶(alcaligenesfaecalisvar.myxogenes))；环孢素(土壤杆菌属(agrobacteriumspp.)、根瘤菌属(rhizobiumspp.)和黄单胞杆菌属(xanthomonasspp.))；葡聚糖(肠膜状明串珠菌(leuconostocmesenteroides)、葡聚糖明串珠菌(leuconostocdextranicum)和希氏乳杆菌(lactobacillushilgardii))；乳胶(醋酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus))；半乳葡多糖(无色细菌属(achromobacterspp.)、放射形土壤杆菌(agrobacteriumradiobacter)、pseudomonasmandelii、根瘤菌属和菌胶团属(zoogleaspp.))；半乳糖氨基半乳聚糖(曲霉属(aspergillusspp.))；胶凝糖(aureomonaselodea和少动鞘氨醇单胞菌(sphingomonaspaucimobilis))；葡糖醛(苜蓿根瘤菌(sinorhizobiummeliloti))；n-乙酰葡糖胺(表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis))；n-乙酰基肝素样物质(大肠杆菌(escherichiacoli))；透明质酸(马链球菌(streptococcusequi))；尿蓝母(拜叶林克氏菌属(beijerinckiaindica))；kefiran(希氏乳杆菌)；香菇多糖(埃杜香菇(lentinuselodes))；果聚糖(粘性产碱杆菌(alcaligenesviscosus)、运动发酵单孢菌(zymomonasmobilis)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis))；支链淀粉(出芽短梗霉(aureobasidiumpullulans))；硬葡聚糖(齐整小核菌(sclerotiumrolfsii)、sclerotiumdelfinii和葡糖酸小核菌(sclerotiumglucanicum))；裂裥菌素(群交裂褶菌(schizophylumcommune))；stewartan(斯氏泛菌亚属斯氏(pantoeastewartiisubsp.stewartii))；琥珀酰葡聚糖(粪产碱菌腈水解酶(alcaligenesfaecalisvar.myxogenes)，苜蓿根瘤菌(sinorhizobiummeliloti))；黄原胶(野油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris))；和韦兰糖胶(粪产碱菌属(alcaligenesspp.))。所公开的方法可以与通过本领域公知的方法培养的微生物菌株(例如，类芽孢杆菌菌株nrrlb-50972、枯草芽孢杆菌菌株nrrlb-21661、或由其衍生的杀真菌突变体(菌株))获得的组合物一起使用。常规的大规模微生物培养方法包括深层发酵、固态发酵或液体表面培养。在发酵将结束时，随着营养物质耗尽，细胞开始从生长阶段过渡到孢子形成阶段，使得发酵的最终产物主要是孢子、代谢物和残留的发酵培养基。孢子形成是类芽孢杆菌的自然生命周期的一部分，并且通常由细胞响应营养限制而引起。发酵用于获得高水平的菌落形成单位并促进孢子形成。发酵产生的培养基中的细菌细胞、孢子和代谢物可以直接使用或通过工业方法(如离心、切向流过滤、深度过滤和蒸发)浓缩。这些组合物包括发酵产物。在一些实施方案中，例如通过渗滤方法洗涤浓缩的发酵培养液，以除去残留的发酵培养液和代谢物。本文所使用的术语“培养液浓缩物”指的是通过如本文所述的工业方法浓缩但保持液体形式的全培养液(发酵培养液)。本文所使用的术语“发酵固体”指的是在将发酵培养液干燥后剩余的固体材料。本文所使用的术语“发酵产物”指的是全培养液、培养液浓缩物和/或发酵固体。本发明的方法可用于制备包括发酵产物的组合物。使用常规干燥工艺或方法(如喷雾干燥、冷冻干燥、盘式干燥、流化床干燥、鼓式干燥或蒸发)，在添加或不添加载体的条件下，可将发酵培养液或培养液浓缩物干燥。可以进一步处理所得的干燥产物，如通过研磨或造粒，以获得特定的粒度或物理形式。下面描述的载体也可以在干燥后加入。本发明菌株的发酵培养液的无细胞制剂可通过本领域已知的任何方法(例如发酵培养液的萃取、离心和/或过滤)获得。本领域技术人员将理解，所谓的无细胞制剂不可能不含有细胞，而是在很大程度上无细胞或基本上无细胞，这取决于所使用的除去细胞的技术(例如，离心速度)。得到的无细胞制剂可以与有助于其应用于植物或植物生长培养基的组分一起干燥和/或配制。上述用于发酵培养液的浓缩方法和干燥技术也适用于无细胞制剂。在一些实施方案中，所公开的方法用于生产液体制剂组合物。液体制剂的非限制性实例包括悬浮液浓缩剂和油分散剂。在其他实施方案中，本发明的组合物为固体制剂。固体制剂的非限制性实例包括冷冻干燥粉末和喷雾干燥粉末。用本发明的方法制备的组合物可包括制剂惰性物质，所述制剂惰性物质添加到包含细胞、无细胞制剂或代谢物的组合物中以改善功效、稳定性和可用性和/或便于加工、包装和最终用途应用。这些制剂惰性物质和成分可包括载体、稳定剂、营养素或物理性质改良剂，其可单独或组合添加。在一些实施方案中，载体可包括液体材料(如水、油和其他有机或无机溶剂)和固体材料(如矿物质、聚合物，或通过生物学或通过化学合成获得的聚合物复合物)。在一些实施方案中，载体为粘合剂或胶黏剂，其有助于将组合物粘附于植物部分，如种子或根。例如，参见taylor,a.g.等人,“conceptsandtechnologiesofselectedseedtreatments”，annu.rev.phytopathol.28:321-339(1990)。稳定剂可包括抗结块剂、抗氧化剂、干燥剂、保护剂或防腐剂。营养素可包括碳、氮和磷源，如糖、多糖、油、蛋白质、氨基酸、脂肪酸和磷酸盐。物理性质改良剂可包括增量剂、润湿剂、增稠剂、ph调节剂、流变改性剂、分散剂、辅助剂、表面活性剂、防冻剂或着色剂。在一些实施方案中，包含细胞、无细胞制剂或通过发酵产生的代谢物的组合物可在有或没有水作为稀释剂的情况下直接使用而无需任何其他制剂制备过程。在一些实施方案中，在浓缩发酵培养液之后和干燥期间和/或干燥之后添加制剂惰性物质。保藏信息本发明的类芽孢杆菌属菌株的样品于2014年8月28日根据布达佩斯条约保藏在农业研究机构培养物保藏中心(agriculturalresearchserviceculturecollection)，其位于美国伊利诺伊州peoria市北部大学街(northuniversitystreet)1815号，美国农业部农业研究局，农业应用研究国家中心(nrrl)，邮编61604，并且指定其以下登记号：nrrlb-50972。本发明的枯草芽孢杆菌菌株样品于1997年3月7日根据布达佩斯条约保藏在nrrl，并指定了以下登记号：nrrlb-21661。类芽孢杆菌属种菌株和枯草芽孢杆菌菌株被保藏在这样的条件下，即确保在该专利申请的在审期间，由专利和商标专员根据37c.f.r.§1.14和35u.s.c.§122确定的有资格的人能够获得培养物。所述保藏为经保藏的类芽孢杆菌属菌株的基本上纯的培养物。在提交本申请的对应申请或子申请的国家中，可根据外国专利法的需要提供该保藏。然而，应当理解，可获得保藏物并非许可在违背政府授予的专利权的情况下实施本发明。以下给出的实施例仅用于本发明的说明性和非限制性目的。实施例实施例1.来自类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液的沉淀和上清液级分的杀镰孢菌素a水平和抗真菌活性类芽孢杆菌属nrrlb-50972在基于大豆的培养基中生长以产生全培养液培养物。然后将一部分全培养液培养物在24,790×g的相对离心力(rcf)下离心10分钟以产生沉淀级分(即培养液浓缩物)和上清液。以此速度离心仅可用于小体积(～30ml)并且产生软沉淀级分和相对混浊的上清液。沉淀级分占原始体积的四分之一至三分之一，并且上清液级分组成剩余体积。在这些容器中分析沉淀级分和上清液级分，而无需进一步的稀释或浓缩。对于较大体积(～1,000ml)，其中最大离心速度限制为17,000×g的rcf，不可在粘性的类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液培养物中将上清液级分与沉淀级分分离。显然，大规模离心类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液培养物需要对全培养液培养物进行改性，以允许在较低的离心速度下分离沉淀级分和上清液级分。使用超高效液相色谱/三重飞行时间质谱(uplc/mstripletof)的色谱方法评价级分中已知的抗真菌化合物杀镰孢菌素a的相对量：柱：zorbaxtmeclipseplus，2.1x100mm，1.8μm；水(0.1％fa)和乙腈(0.1％fa)；梯度(％b)：0-5min，10-95％；洗涤。杀镰孢菌素a的鉴定由其特有的保留时间和质量确定。光谱中的杀镰孢菌素峰的相对信号强度示于表1中，其中每个强度归一化为全培养液光谱中存在的强度。杀镰孢菌素a在沉淀级分中浓缩，少量残留在上清液级分中。还通过对全培养液培养物、上清液级分和沉淀级分进行系列稀释，并将稀释液铺在固体培养基上，来量化每个级分中存在的菌落形成单位。对得到的菌落进行计数并记录(参见表1)。如所预期的，大多数细胞通过离心移入沉淀级分中。表1.类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液培养物中杀镰孢菌素a的菌落形成单位(cfu)和相对量。样品杀镰孢菌素a的相对量cfu/g全培养液1.002.0×107上清液0.111.3×105沉淀(培养液浓缩物)2.169.4×107来自独立发酵的全培养液0.93未测量还在用灰葡萄孢(botrytiscinerea(botrci))的体内试验中测量了级分的抗真菌活性。将类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液以及相应的上清液和沉淀级分在水中各自稀释至相等的最终体积。将稀释的全培养液、上清液级分和沉淀级分施用于幼苗，随后将其暴露于灰葡萄孢(botrci)的接种物。在暴露于植物病原体的接种物之后的几天，针对每株植物相对于未处理的对照植物而言，进行病原体防治百分比的评分。对每种处理重复评价若干次。示于图1的结果表明，与未处理的对照(“水”)相比，最大的抗真菌活性出现在全培养液(“wb”)和沉淀级分(“沉淀”)中，而上清液级分(“上清液”)提供很小的可观察到的抗真菌活性。这些实验数据表明，类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液中的抗真菌化合物可通过离心全培养液并从所得的沉淀中除去上清液而富集或浓缩。实施例2.用于类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液的离心加工助剂的鉴定类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液含有使其难以通过离心而产生致密的沉淀级分的粘性生物聚合物，例如胞外多糖(eps)。这可以在图2标记为“wb-sdos”的照片中看出，所述照片为在不使用任何加工助剂的情况下，从全培养液离心出沉淀的照片。在测试各种化学试剂在离心过程中诱导致密沉淀级分形成的能力后，鉴定出(磺基琥珀酸二辛基酯钠；也称为sdos)。当将(sdos)以0.1％至0.5％(重量/体积)的浓度添加到类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液(“wb”)时，由混合物的离心得到致密的沉淀级分和相对不含颗粒物质的上清液。这可以在图2中标记为“wb+sdos”的照片中看到，所述照片为经离心的混有(sdos)的全培养液的照片。实施例3.离心加工助剂对来自另一种类芽孢杆菌菌株的全培养液的作用为了研究对于其他产生eps的菌株，(sdos)是否可以在离心过程中诱导致密沉淀级分的形成，将另一种已知产生相对高水平eps的类芽孢杆菌菌株放置在基于大豆的培养基中生长。在17,000×g的rcf下使用和不使用浓度为0.1％至0.5％(重量/体积)的(sdos)的情况下，将全培养液的若干制剂离心5分钟。如图3所示，将(sdos)添加到来自产生eps的类芽孢杆菌菌株的全培养液中一致性地得到致密的沉淀级分和澄清的上清液级分。相反，在没有(sdos)的情况下，离心相同的全培养液通常产生扩散的沉淀级分和混浊的上清液级分。实施例4.确认sdos诱导致密沉淀级分的形成以及沉淀和上清液级分中杀镰孢菌素a的测量(sdos)是可从solvay(brussels，belgium)获得的商业产品。为了确认对于离心效果起作用的是中的sdos，而不是该商业产品中的另一种化学成分，我们从sigma-aldrich(st.louis，missouri)购买纯的sdos制剂。重复实施例2中记载的实验，将(sdos)添加到全培养液中至终浓度为0.1％，或添加纯的sdos至终浓度为0.1％或0.5％。在使用(sdos)或纯的sdos的情况下，均产生致密的沉淀级分。然后使用实施例1中记载的分析方法测定在含有(sdos)或纯的sdos的全培养液以及沉淀和上清液级分中杀镰孢菌素a的相对水平。分析等体积的全培养液、沉淀级分和上清液级分中杀镰孢菌素a的水平，其中镰孢菌素a的水平被归一化为全培养液中杀镰孢菌素a产生的信号。大部分的杀镰孢菌素a被分离进入沉淀级分中，仅非常小的量残留在上清液级分中(参见图4)。这些实验中的沉淀级分占原始体积的四分之一至三分之一，并且上清液级分占剩余体积，如在实施例1中所观察到的。由于沉淀级分为全培养液的浓缩形式，因此可以预期沉淀级分中杀镰孢菌素a的相对量显著高于在全培养液中检测到的(参见例如表1中的全培养液和沉淀级分中杀镰孢菌素a的水平)。然而，在使用(sdos)形成的沉淀级分中，情况并非如此(比较图4中的全培养液和沉淀级分中杀镰孢菌素a的水平)。这些结果表明，虽然(sdos)在相对较低的离心速度下促进了致密沉淀级分从全培养液中形成，但它也使得在采用实施例1记载的色谱方法情况下，可检测到的杀镰孢菌素a的量减少。这种分析方法依赖于色谱柱对于杀镰孢菌素a与其他化合物的分离能力，并且不能检测到结合在大的不溶性聚集体中的杀镰孢菌素a。实施例5.使用和不使用(sdos)的类芽孢杆菌属nrrlb-50972培养液的粒度分析实验结果表明(sdos)诱导了类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液中孢子、杀镰孢菌素a和其他物质形成大聚集体，且这些聚集体在以相对低的速度的离心过程中产生致密的沉淀级分。为了研究使用(sdos)时是否发生聚集，进行了粒度分析(psa)。psa测量了在悬浮液样品中的粒度分布。激光穿过颗粒悬浮液。记录在激光束穿过样品时的散射光强度的角度变化。然后使用该角度强度依赖性来产生粒度分布。得到的数据曲线表示粒度随该粒度的颗粒群的变化。对于类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液、在使用和不使用(sdos)情况下的培养液浓缩物以及来自使用和不使用情况下的(sdos)类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液的上清液级分，进行psa。培养液浓缩物由类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液在不使用(sdos)的情况下高速离心或使用(sdos)的情况下低速离心(含少量难以从沉淀中除去的上清液)后的沉淀级分组成。得到的数据曲线如5a-5e所示。每个图中的两条曲线表示对每个样品进行的两次测量。在使用(sdos)情况下的培养液浓缩物的psa数据曲线标示出其颗粒群的直径比在不使用(sdos)情况下的培养液浓缩物中观察到的更大。来自在使用(sdos)情况下的培养液浓缩物的大部分颗粒具有6μm或更大的直径。相反，来自在不使用(sdos)情况下的培养液浓缩物的大多数颗粒具有小于6μm的直径(比较图5b和图5c)。这些结果证实了这一假设：(sdos)诱导大聚集体的形成。对于在使用和不使用(sdos)情况下的上清液级分的分析也进一步证实了这一假设。来自在使用(sdos)情况下的全培养液的上清液级分中，大部分颗粒具有小于0.4μm的直径，而来自在不使用(sdos)情况下的全培养液的上清液级分中，大多数颗粒具有大于0.4μm的直径(比较图5d和图5e)。这些数据表明将(sdos)添加到类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液中，将会在离心过程中诱导大聚集体的形成和与沉淀级分一起沉淀，所述大聚集体能够有效地从上清液级分中除去。实施例6.ph和盐浓度对沉淀形成和杀镰孢菌素a水平的影响抗真菌化合物如杀镰孢菌素a通常带有可电离基团，该基团受到使所述抗真菌化合物溶解的溶液的ph影响。这些可电离基团的电荷会影响抗真菌化合物与其他化合物在溶液中将如何相互作用。为了确定ph值能够改善在类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液中(sdos)诱导聚集体形成的能力，在离心之前通过添加盐酸和氢氧化钠将全培养液的ph调节到3至10。观察ph为3、6或10的含有(sdos)的全培养液在低速离心后的沉淀级分，表明在ph为6时产生了澄清上清液和致密沉淀级分(参见图6)。采用调节至ph为3、4、5、6、7、8、9或10的含有(sdos)的类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液重复该实验。离心后，将沉淀级分与上清液级分分离，并且如实施例1中所述测定沉淀级分中杀镰孢菌素a的相对水平。在来自ph为4至7的全培养液的沉淀级分中，检测到最高的杀镰孢菌素a水平。盐浓度影响溶液的离子强度。高盐浓度可以屏蔽偶极相互作用并降低极性化合物的水合作用，从而使这些化合物从溶液中“盐析”出来。将各种浓度的盐(例如，氯化钠或氯化钾)添加到类芽孢杆菌属nrrlb-50972中以测定它们对于在使用(sdos)下的低速离心后致密沉淀级分形成的影响。约2％至约10％的盐浓度有助于致密沉淀级分的形成。实施例7.使用类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液的其他离心加工助剂的鉴定在鉴定出(sdos)后，评价了其他化学试剂对于类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液产生相似效果的能力。在50ml圆锥形小管中，将每种化学试剂与全培养液以0.1％至0.5％(重量/体积)的浓度混合，并以产生3,000×grcf的相对低的离心速度离心5分钟。然后将与各种化学试剂混合的经离心的全培养液与在不使用任何化学试剂下的离心的全培养液(即，图7a中最左边的圆锥形小管)进行比较。几种化学试剂在低速离心(即，rcf为3,000×g)后产生澄清的上清液并作进一步研究。如实施例1中所证实的，在不存在这些化学试剂的情况下，需要在24,790×g的rcf下进行离心以形成可识别的沉淀级分。对于能够改善全培养液的沉淀级分紧实程度的化学试剂，以更大的体积进行测试来证实该效果。将(sdos)包含在这些验证实验中作为阳性对照。图7b示出来自这样一个实验的沉淀和上清液级分的照片，所述实验证实4(7-乙基-2-甲基-4-十一烷基硫酸钠)产生的效果与在使用(sdos)下观察到的相似。4(7-乙基-2-甲基-4-十一烷基硫酸钠)；8(2-乙基己基硫酸钠)；以及直链烷基苯磺酸盐、十二烷基苯磺酸钠，能够使类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液在低速离心后形成致密的沉淀级分。实施例8.用于类芽孢杆菌属nrrlb-50972沉淀级分中抗真菌化合物的释放助剂的鉴定对于在使用和不使用(sdos)下的培养液浓缩物和上清液级分的psa分析表明，添加离心助剂(例如，(sdos))将诱导聚集体的形成，所述聚集体在离心时更容易形成致密的沉淀级分(参见图5a-5e)。因此，在离心和分离沉淀级分之后，添加释放助剂可破坏聚集体，并且增加抗真菌化合物的生物利用度以及所得发酵产物的功效。测试了几种化合物对于沉淀级分而言，它们作为释放助剂的能力。为了评价这些化合物作为释放助剂的功效，如实施例2所述，在使用(sdos)情况下由全培养液中产生沉淀级分。然后将沉淀级分的一部分与各种化合物混合，并且用实施例1中记载的分析方法测定每个样品中存在的杀镰孢菌素a的量。将杀镰孢菌素a的所有测量值归一化为起始材料全培养液中存在的量。将在仅使用(sdos)情况下的沉淀级分作为对照。已发现，几种聚氧乙烯二醇烷基醚化合物可以增加沉淀级分中存在的杀镰孢菌素a的相对量。这些化合物包括聚氧乙烯(25)十二烷基醚(也称为c12eo25)和l23(聚氧乙烯(23)十二烷基醚；也称为c12eo23)(参见图8)。另外的实验证明，聚氧乙烯二醇烷基醚化合物c12eo6(聚氧乙烯(6)十二烷基醚)和s100(聚氧乙烯(100)十八烷基醚)也增加了沉淀级分中存在的杀镰孢菌素a的相对量(参见图9)。还发现80(2-[2-[3,4-双(2-羟基乙氧基)氧杂环戊烷-2-基]-2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙基(e)-十八碳-9-烯酸酯；也称为聚氧乙烯脱水山梨醇油酸酯)也起到释放助剂的作用(参见图9)。实施例9.添加释放助剂后沉淀级分的增加的可悬浮性对在单独使用(sdos)情况下或在使用(sdos)和c12eo25情况下的沉淀级分的物理性质进行研究。研究的物理性质之一为浓缩的沉淀级分的可悬浮性。将类芽孢杆菌属nrrlb-50972在基于大豆的培养基中培养，并在使用(sdos)情况下进行低速离心以产生沉淀级分。将沉淀级分分成两份，c12eo25与其中一份混合。在15ml圆锥形小管中，将这两份的等分试样与水混合以进行10倍稀释。使稀释的沉淀级分在室温下平衡几分钟。平衡后，不使用c12eo25的沉淀级分分为两层，其中上层为透明层，底层为混浊层(参见图10中左侧的圆锥形小管)。相反，含有c12eo25的沉淀级分在平衡后仍然为单一的悬浮液(参见图8右侧的圆锥形小管)。这些结果证明c12eo25增加了类芽孢杆菌属nrrlb-50972培养液浓缩物在水中稀释时的可悬浮性。实施例10.添加离心助剂和释放助剂时，类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液的增加的抗真菌活性将类芽孢杆菌属nrrlb-50972在基于大豆的培养基中培养以产生全培养液。将0.1％(sdos)和2％kcl添加到一部分全培养液中，并且调节ph到6。将该部分全培养液离心以产生沉淀级分(即，培养液浓缩物)，并且除去上清液部分。然后将一部分沉淀级分与释放助剂c12eo25混合。将全培养液、在仅使用(sdos)情况下的沉淀级分和在使用(sdos)和c12eo25情况下的沉淀级分在水中稀释至浓度为10％、5％、2.5％和1.25％。将稀释的全培养液施用于幼苗，随后将其暴露于茄链格孢(alternariasolani)(alteso)或灰葡萄孢(botrci)的接种物中。在暴露于植物病原体的接种物之后的几天，针对每株植物相对于未处理的对照(utc)植物而言，进行病原体防治百分比的评分。每种处理将重复进行三次评价，并记录平均防治百分比(参见表2-3)。在每次试验中，在仅使用(sdos)情况下的沉淀级分具有比全培养液更高的抗真菌活性，并且在使用(sdos)和c12eo25情况下的沉淀级分具有最高的抗真菌活性。这些实验数据表明，将(sdos)添加到类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液中使得在低速离心期间，抗真菌化合物在沉淀级分中富集或浓缩，并且添加的c12eo25增强了该沉淀级分的抗真菌活性。还将(sdos)和c12eo25各自以与沉淀级分中类似的最终比率施用于幼苗。随后使幼苗接种真菌病原体，并对每株植物相对于utc植物而言的病原体防治百分比进行评分。这些防治处理表明(sdos)和c12eo25并不具备固有的抗真菌活性，这可在与utc植物比较后鉴定出。表2.通过稀释率为10％、5％、2.5％和1.25％的类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液、在使用(sdos)情况下的再悬浮沉淀级分、以及在使用(sdos)和c12eo25情况下的再悬浮沉淀级分所实现的对于茄链格孢(alteso)的防治。表3.通过稀释率为10％、5％、2.5％和1.25％的类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液、在使用(sdos)情况下的再悬浮沉淀级分、以及在使用(sdos)和c12eo25情况下的再悬沉淀级分所实现的对灰葡萄孢(botrci)的防治。实施例11.在使用离心助剂和释放助剂情况下的类芽孢杆菌属nrrlb-50972培养液浓缩物的大规模制剂中，杀镰孢菌素a的水平如实施例10中所述，使用(sdos)作为离心助剂和s100(聚氧乙烯(100)十八烷基醚)作为释放助剂，制备了五批单独的来自类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液的大批量培养液浓缩物。每批均有几升材料。如实施例1中所述，对全培养液和每批所得的培养液浓缩物中的杀镰孢菌素的水平进行定量。将所有结果归一化为在-80摄氏度(即“wb标准”)下储存的类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液中杀镰孢菌素a的水平。图11示出结果，图中的误差条表示在杀镰孢菌素a测量中的95％置信区间。培养液浓缩物中的杀镰孢菌素a水平比相应的全培养液中检测到的水平高3.5倍。实施例12.离心加工助剂对枯草芽孢杆菌nrrlb-21661全培养液的影响枯草芽孢杆菌菌株nrrlb-21661在基于大豆的培养基中生长。在使用和不使用浓度为0.1％至0.5％(重量/体积)的(sdos)的情况下，将得到的粘性全培养液以1,500×g的rcf离心5分钟。将(sdos)添加到枯草芽孢杆菌菌株nrrlb-21661全培养液中，这产生更致密的沉淀级分和更澄清的上清液级分(参见图12)。相反，在不使用(sdos)的情况下，对相同的全培养液进行离心产生相对扩散的沉淀级分和混浊的上清液级分。实施例13.在使用离心助剂和释放助剂的情况下，类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液的增加的抗真菌活性和剂量反应的确定如实施例10中所述，制备和处理类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液。将所得的全培养液、在仅使用(sdos)情况下的沉淀级分、以及在使用(sdos)和c12eo25情况下的沉淀级分进行系列稀释以制备具有1x、0.5x、0.25x和0.125x起始材料浓度的样品。然后将系列稀释的样品以0.625％的比率施用于幼苗。用真菌病原体茄链格孢对植物进行接种，并随后评估相对于utc植物的病害防治。报告的病害防治值为三次独立重复实验的平均值。如表4中所示，在仅使用(sdos)情况下的沉淀级分具有比全培养液更高的抗真菌活性，并且在使用(sdos)和c12eo25情况下的沉淀级分具有最高的抗真菌活性。此外，在每个样品中均可观察到明显的剂量响应，其中观察到1x样品的活性最高，并且观察到0.125x样品的活性最低。表4.类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液、在使用(sdos)情况下的再悬浮沉淀级分、以及在使用(sdos)和c12eo25情况下的再悬浮沉淀级分以1x、0.5x、0.25x和0.125x系列稀释的各样品所实现的对于茄链格孢(alteso)的防治。所有样品制剂以0.625％的比率施用于植物。实施例14.三种不同类芽孢杆菌菌株的全培养液、培养液浓缩物和上清液中杀镰孢菌素a的水平如实施例10中所述，使用(sdos)作为离心助剂和s100(聚氧乙烯(100)十八烷基醚)作为释放助剂，制备类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液和另外两种类芽孢杆菌菌株的全培养液的培养液浓缩物。保存每种全培养液和在培养液浓缩物生产过程中除去的上清液的样品用于分析。如实施例1中所述，对于全培养液以及所得的每种菌株的培养液浓缩物和上清液中的杀镰孢菌素水平进行定量。将所有结果归一化为在-80摄氏度下储存的类芽孢杆菌属nrrlb-50972全培养液中杀镰孢菌素a的水平。图13示出结果，图中的误差条表示杀镰孢菌素a测量结果的95％置信区间。在所有三种菌株中，从全培养液到培养液浓缩物，均可观察到杀镰孢菌素a的有效浓度，其中培养液浓缩物中的水平比相应的全培养液中检测到的水平增加到多达7倍。在各上清液中均未发现可检测到的杀镰孢菌素a。如实施例10中所述，分析了全培养液、培养液浓缩物和上清液对抗茄链格孢的抗真菌活性。包括了采用(百菌清)进行的处理作为阳性对照。表5中示出的结果表明，全培养液和培养液浓缩物存在抗真菌活性，而在上清液中几乎观察不到或观察不到可检测的抗真菌活性。除非另外定义，本文中的所有技术和科学术语具有的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管类似或等同于本文所记载的那些任何方法和材料均可用于本发明的实践或测试，但本文所记载的是优选的方法和材料。出于所有的目的，引用的全部出版物、专利和专利出版物均通过引用以全文纳入本说明书。提供本文讨论的出版物仅仅是因为它们先于本申请的提交日公开。本文中的任何内容均不应被解释为承认由于先前发明的存在而使本发明不能被授权。应理解，所公开的发明不限于所述特定的方法、方案和材料，因为它们能够发生变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定的实施方案，而不意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅通过所附权利要求来限定。本领域技术人员仅使用常规实验方法，就将了解或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等价物。这样的等价物意欲被以下权利要求所涵盖。表5.稀释率为5％、2.5％和1.25％的类芽孢杆菌属nrrlb-50972、类芽孢杆菌菌株a和类芽孢杆菌菌株b的全培养液、培养液浓缩物和上清液所实现的对于茄链格孢(alteso)的防治。当前第1页12