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本公开一般涉及适用于酶替代疗法(enzymereplacementtherapy,ert)的甲基丙二酰辅酶a变位酶(methylmalonylcoamutase,mcm)融合蛋白构建体。
背景技术
甲基丙二酸血症(methylmalonicacidemia,mma)是一种常染色体隐性遗传性疾病,每50,000到100,000人中发病率约为1,其长期存活预后较差。
大约60%的mma病例是由于mut基因中的突变引起的,其导致线粒体酶甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)中的缺陷,该酶催化甲基丙二酰辅酶a异构化为琥珀酰辅酶a并需要钴胺素(b-12)作为辅因子。琥珀酰辅酶a是各种氨基酸和脂肪进入三羧酸循环(或“krebs循环”)的关键。
如本领域所知,用于通过丙酰辅酶a(coa)进入krebs循环的支链氨基酸异亮氨酸和缬氨酸以及甲硫氨酸、苏氨酸、奇链脂肪酸和胆固醇的分解代谢,需要1-甲基丙二酰基辅酶a异构化为琥珀酰辅酶a。如上所述,该转化涉及甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)(一种位于线粒体基质中的核编码的同源二聚体酶(无活性酶)(1))和腺苷钴胺素(一种来源于钴胺素的mcm的辅因子(维生素b-12))。
通常出现在婴儿早期的mma的影响从轻微到危及生命。受影响的婴儿可能会出现呕吐、脱水、肌肉张力减弱(肌张力减退)、发育迟缓、过度疲倦(嗜睡)、肝脏肿大(肝肿大)、以及体重增加及以预期的速度增长不能(发育停滞)。长期并发症可以包括喂养问题、智力残疾、慢性肾病、以及胰腺的炎症(胰腺炎)。若不进行治疗,这种疾病有可能导致昏迷和死亡。
目前对维生素b-12(羟钴胺素)无反应性mma患者的管理方法包括对营养源氨基酸的饮食限制、营养补充剂给药和警惕性监控。肝脏或联合肝/肾移植已被用于治疗临床表现最严重的患者(2)。
患有mma的患者,即使是那些接受过肝脏移植的患者,也可能发展为进行性肾功能障碍(3),病理特征为肾小管间质性肾炎(4,5),并最终需要肾移植。在患者群体(即使是那些接受过深度治疗的患者)中看到的疾病表现,也表明需要新的疗法,理想的疗法是能够同时针对肝脏和肾脏,以增加稳定性并防止肾功能不全。
最近有报道称raav9基因治疗在24小时内引导mutcdna的肝转基因表达并有效地挽救了mut-/-小鼠免于致命伤,使长期存活显著改善代谢并导致肾功能和组织学的显著保留。以与人类临床试验中使用的剂量相似的剂量(每克2.5x109gc的raav9),对较老的经处理的mut-/-小鼠进行系统性再给药,降低了循环代谢物,增加了体内丙酸的氧化能力并在肾脏和肝脏中产生转基因表达(6)。
在蛋白易位结构域(ptd)-融合蛋白在体外和体内将不同的大分子递送到细胞中的使用中,已经取得了很大进展。ptd是指一组短肽,其用作大分子的递送载体。通常,ptd定义为短的、水溶性的和部分疏水的、和/或多元的肽(至少30-35个氨基酸残基),其在生理ph下有净正电荷。ptd能够在体内和体外以低的微摩尔浓度穿透细胞膜,而不使用任何手性受体并且不会引起显著的膜损伤。此外,这些肽能够以高效率和低毒性内化静电或共价结合的生物活性货物,例如药物。这种新的肽类在20世纪80年代末被引入,并在几年后发现人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)编码的tat肽和两亲性果蝇触角同源域衍生的16氨基酸穿透肽(pantp)。
ptd可以通过血脑屏障将货物递送进大脑或靶向特定的细胞内亚定位,如细胞核、线粒体和溶酶体。将活性酶递送至细胞中的能力有助于开发酶替代疗法(ert),借此根据ptd递送系统,人工制造、纯化并定期给予患者缺乏或缺失的酶。
最近,报道了用于将酶或蛋白质递送至线粒体中的融合蛋白(7,8)。该先前报道的递送系统是基于包含蛋白转导结构域(ptd)的融合蛋白,它促进了通过细胞质膜和线粒体膜与线粒体酶融合的运输。该融合蛋白可进一步包含存在于蛋白转导域和线粒体酶或蛋白质之间的线粒体靶向序列(mts)。这些构建体通常被描述为适于治疗或减轻线粒体病症(8)。
此外,wo2014/170896公开了包含ptd、mts和人类线粒体蛋白的融合蛋白,其中mts与存在于融合蛋白构建体中的人类线粒体蛋白异源。此类构建体也被描述为适于治疗或减轻线粒体病症(9)。
附图说明
为了更好地理解本文公开的主题并举例说明如何在实践中实施,现在通过仅非限制性示例和参考附图描述实施例,其中:
图1是各种基于甲基丙二酰辅酶a变位酶(tat-mts-mcm)的融合蛋白的示意图。缩写:tat,转录的反式激活因子;mts,线粒体易位序列;mcm,mut甲基丙二酰辅酶a变位酶;cs,柠檬酸合成酶;lad,硫辛酰胺脱氢酶(lipoamidedeydrogenase);δ,无mts;箭头表示tev位点;mbp,麦芽糖结合蛋白。
图2显示了在各种所示的细菌宿主中融合蛋白tat-mtsmcm-mcm(图2a)、tat-mtscs-mcm(图2b)、tat-mtslad-mcm(图2c)和tat-δmts-mcm(图2d)的未诱导的(un)、iptg诱导的(in)、全细胞提取物(wce)和可溶的组分(sol)中的表达的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sdspage)分析。
图3显示了在codon+和rosseta细菌宿主中融合蛋白构建体tat-mtsmcm-mcm(图3a)、tat-mtscs-mcm(图3b)、tat-mtslad-mcm(图3c)和tat-δmts-mcm(图3d)在未诱导的(un)、iptg诱导的(in)、全细胞提取物(wce)和可溶的(sol)组分中的表达的sdspage分析。构建体tat-mtsmcm-mcm(如图3a所示)的抗his抗体的western印迹分析如图3e所示,构建体tat-mtscs-mcm(如图3b所示)的western印迹分析则如图3f所示。
图4显示了使用ni-鳌合柱亲和层析进行的融合蛋白构建体tat-mtsmcm-mcm(图4a)、tat-mtscs-mcm(图4b)、tat-mtslad-mcm(图4c)和tat-δmts-mcm(图4d)的纯化的sdspage分析。缩写:m,标记物;wce,全细胞提取物;pre-run,在装载至纯化柱之前;fl,流过。
图5显示了用于表征所示的tat-mts-mcm融合蛋白构建体的使用抗mcm抗体的sdspage分析(图5a)和western印迹分析(图5b)。缩写:htallmut,his-tat-mtsmcm-mcm;htcsmut,his-tat-mtscs-mcm;htladmut,his-tat-mtslad-mcm;ht△mut,his-tat-△mts-mcm;以及mbpmut,his-mbp-tat-mtsmcm-mcm。
图6显示了tat-mts-mcm融合蛋白构建体内化进入细胞及其线粒体的western印迹分析。图6a显示了673成纤维细胞的全细胞提取物的western印迹分析,该细胞使用抗mcm抗体用所示量的tat-mtscs-mcm融合蛋白孵育24小时。使用抗his抗体的用tat-mtscs-mcm或tat-mtsmcm-mcm孵育3小时的673成纤维细胞中分离的线粒体的western印迹分析如图6b所示,而使用抗mcm抗体的则如图6c所示。图6d是使用抗mcm抗体的用各种融合蛋白构建体孵育3小时的673成纤维细胞中分离的线粒体的western印迹分析。融合蛋白构建体his-tat-mtscs-mcm显示在右侧泳道作为对照。缩写:mito,线粒体;mito对照,在没有融合蛋白构建体的情况下孵育的线粒体;htallmut,his-tat-mtsmcm-mcm;htcsmut,his-tat-mtscs-mcm;htladmut,his-tat-mtslad-mcm;ht△mut,his-tat-△mts-mcm;以及m,标记物。
图7显示了在用tat-mts-mcm融合蛋白构建体孵育的患者细胞中的相对atp水平的条形图。图7a-图7c显示了用每一种融合蛋白构建体孵育的346(图7a)、gm01673(图7b)和gm00050(图7c)成纤维细胞的atp水平。成纤维细胞在无糖培养基中生长48小时(15x103个细胞)并用1μg的每种融合蛋白构建体孵育6小时,然后分析总细胞atp。结果代表平均值±sem,n=3,*p<0.05。缩写:tat-mtsmbp-mcm,his-mbp-tat-mtsmcm-mcm。
图8是显示了在用tat-mts-mcm融合蛋白构建体孵育的患者细胞中的相对膜电位(tmre/mtg)的条形图。在无糖培养基中生长48小时(15x103个细胞)并用1.5μg的所示的融合蛋白构建体孵育6小时的gm01673成纤维细胞的线粒体膜电位。在孵育期结束前(1小时),加入200nmmitotrackergreenfm。另外,在孵育期结束前30分钟,加入20μmfccp作为对照,并且在孵育期结束前20分钟,加入200nmtmre。结果代表平均值n=2。缩写:对照,在不存在融合蛋白构建体的情况下孵育细胞;tmre,四甲基罗丹明乙酯;mtg,mitotrackergreen;以及fccp,羰基氰-4-(三氟甲氧基)苯腙。
图9显示了在用tat-mts-mcm融合蛋白构建体孵育的患者细胞中的相对耗氧量的条形图。在无糖培养基中生长48小时(15x103个细胞)并用1μg的各种融合蛋白孵育6小时的gm01673成纤维细胞的耗氧量。耗氧量是通过海马胞外通量(xf)分析仪确定的。结果代表平均值±sem,n=3,*p<0.05。缩写:tat-mtsmbp-mcm,his-mbp-tat-mtsmcm-mcm;对照,在不存在蛋白构建体的情况下孵育细胞。
图10显示了tat-mts-mcm融合蛋白增加mma患者细胞中的细胞活性。在无糖培养基中生长24小时的gm01673(a)、gm00050(b)和346(c)患者成纤维细胞的细胞活性水平。15x103个细胞用1.5μg的各种融合蛋白孵育72小时并随后分析细胞活性。结果代表平均值±sem,n=3,*p<0.05。
图11显示了tat-mts-mcm融合蛋白减少mma患者细胞中的mma水平。在无糖培养基中生长24小时的2x106个gm01673成纤维细胞的mmaelisa分析。之后,细胞用0.75或1.5μg的tat-mtscs-mcm孵育48小时并随后分析总细胞mma水平。结果代表平均值±sem,n=4,*p<0.05。
图12显示了tat-mts-mcm融合蛋白增加来源于mcm(-/-)hepg2细胞的白蛋白和尿素分泌。图12a-b显示了在生长培养基中的分泌的白蛋白水平。5x105个hepg2mcm(-/-)细胞(被证实失去mcm蛋白表达(a))在oxphos依赖性培养基中生长24小时。之后,用1.5μg的tat-mtscs-mcm孵育细胞24小时(图12b)或48小时(图12c),收集生长培养基并以5分钟500g进行离心。白蛋白水平是通过使用抗白蛋白抗体的western印迹分析确定的。加载生长培养基的相等等分。图12d显示了b&c的量化数据。图12e显示了在生长培养基中的分泌的尿素水平。5x105个hepg2mcm(-/-)细胞在提供有1.5μg的tat-mtscs-mcm的完整培养基中生长24小时。之后,在加入了1.5μg的tat-mtscs-mcm的oxphos依赖性培养基中孵育细胞24小时。然后收集生长培养基并以5分钟14000g进行离心,溶解剩下的细胞。由cobas分析仪确定尿素水平。结果代表平均值±sem,n=3,*p<0.05。
图13显示了tat-lad递送进小鼠组织中。tat-mtscs-mcm被注射到c57bl小鼠体内。在不同的时间点,杀死小鼠,并且移除大脑、肝脏和心脏。制备组织裂解液,并通过使用抗甲基丙二酰辅酶a变位酶和抗β肌动蛋白抗体的western印迹分析进行分析。
实施方案的详细描述
本公开是基于甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)融合蛋白构建体的构建。这类构建体包含蛋白质转导结构域(tat递送系统)和线粒体易位序列并适用于与mcm的缺陷或与有缺陷的mcm有关的疾病或病症的酶替代疗法(ert)。
如图1所示,制备了各种mcm融合蛋白,其线粒体易位序列(mts)不同。所使用的mts是甲基丙二酰辅酶a变位酶的原生mts或不同的线粒体多肽(异源多肽)、柠檬酸合成酶(cs)和硫辛酰胺脱氢酶(lad)的mts。如下所示,所有如本文描述地制备的融合mcm蛋白构建体被证明可以内化到线粒体中并进行它们的活性所需的分裂。
因此,在一个方面,本公开提供了一种融合蛋白,其包含hiv-1转录反式激活因子(tat)结构域、功能性人类甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)和位于所述tat结构域和所述功能性人类mcm之间的人类线粒体靶向序列(mts)。
术语“人类甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)”是一种催化甲基丙二酰辅酶a异构化为琥珀酰辅酶a的酶,并且它涉及到关键的代谢途径。它需要维生素b12衍生的辅基腺苷钴胺素(通常被称为adocbl)来发挥作用。mcm由核mut基因编码,其位于染色体6p21上并由13个跨越35kb的外显子组成。人类mcm前体包含32个氨基酸的n-末端线粒体靶向序列(mts)和两个功能域,即(β/α)8桶(barrel)(残基88-422)底物结合位点和c-端(βα)5b12-结合域(残基578-750)。在进入线粒体并移除前导序列之后,两个相同的亚基形成功能性酶(10)。
在mcm的上下文中,在本文使用的术语“功能性”是指包含在本公开中描述的构建体中的任何mcm多肽在进入线粒体和在其中分裂时能够发挥它的生物活性。mcm的生物活性可以根据任何本领域已知的方法来确定,例如但不限于以下对各种融合蛋白构建体所述的方法。
在一些特定的实施方案中,功能性人类甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)是指蛋白质的全长氨基酸序列。
在上述和其他的实施方案中,人类甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)是“成熟的”蛋白质,即是指缺乏线粒体靶向序列(mts)的蛋白质。在进一步特定的实施方案中,本文定义的mcm具有由seqidno:8表示的氨基酸序列。
在进一步的实施方案中,功能性人类甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)是所述蛋白质的突变衍生物,其中mcm的原生氨基酸残基中的一个或多个被删除、被另一个氨基酸残基取代或被修饰,同时仍然维持蛋白质的线粒体功能。
在不希望被理论束缚的情况下,在所有实施方案中,根据本发明公开的主题的功能性人类甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)在进入线粒体时被从融合蛋白构建体中分离,并以其成熟、适当折叠的活性状态在其中驻留。在一些实施方案中,在mts的分裂时,功能性人类mcm单元联系到活性多肽二聚体中。
根据本发明公开的主题的融合蛋白可以通过本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如,本文定义的融合蛋白可以通过如下所示的标准分子生物学和克隆技术进行制备,通过将编码融合蛋白构建体的相关核酸序列克隆到本领域已知的任何合适的表达载体中,用表达载体转化细胞并生长并收获经转化的细胞以制备融合蛋白构建体。本文定义的融合蛋白构建体可随后通过本领域技术人员熟知的方法进行纯化。
在本发明的上下文中,术语“融合蛋白”涉及主要(但不是必须)通过肽键相互连接的氨基酸序列。根据本公开的融合蛋白,术语“融合”是指至少三种不同来源的氨基酸序列,即tat结构域、线粒体靶向结构域的序列(mts)和功能性mcm,通过共价键直接地或通过连接(桥接、偶联、共价结合)氨基酸序列的氨基酸接头,彼此连接。融合可以通过化学偶联,如通过使用用于偶联的现有技术方法进行。
本文所用的术语“氨基酸残基”是指天然存在的和合成的氨基酸,以及可以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸,以及后期被修饰的氨基酸,如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物和氨基酸模拟物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物。这些类似物具有经修饰的r基团或经修饰的肽骨架,但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸可以通过它们通常已知的三字母符号或由iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。
本领域众所周知,氨基酸残基可根据它们的化学性质分为各种群组,尤其是基于涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性。
例如,非极性的“疏水性”氨基酸选自缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)、半胱氨酸(c)、丙氨酸(a)、酪氨酸(y)、组氨酸(h)、苏氨酸(t)、丝氨酸(s)、脯氨酸(p)、甘氨酸(g)、精氨酸(r)和赖氨酸(k);“极性”氨基酸选自精氨酸(r)、赖氨酸(k)、天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q);“带正电荷的”氨基酸选自精氨酸(r)、赖氨酸(k)和组氨酸(h),其中“酸性”氨基酸选自天冬氨酸(d)、天冬酰胺(n)、谷氨酸(e)和谷氨酰胺(q)。“碱性”氨基酸选自组氨酸(h)、赖氨酸(k)和精氨酸(r),它们在低于其pka的ph值下是极性的和带正电荷的,并且是非常亲水的。
本公开进一步涉及包含本文公开的核酸序列的dna构建体。本发明公开的主题的dna构建体可以进一步包含其他元件,如启动子、调节和控制元件、翻译、表达和其他信号,其可操作地连接至本发明的核酸序列。
在一些实施方案中,在根据本公开的融合蛋白中,功能性人类mcm对于所述人类mts来说是c-末端。
大多数被引导向线粒体的蛋白质是通过线粒体靶向(或易位)序列(mts)合成的,这允许它们通过易位机制从细胞质进入线粒体。一旦进入线粒体,mts就会被识别并被分离,允许进行适当的处理,并且如果需要,组装成线粒体酶复合物。
因此,如本文所用,术语“线粒体靶向序列”、“mts”或“线粒体易位序列”是指能够将蛋白质、肽、氨基酸序列或与其连接的化合物运输至线粒体中的氨基酸序列,及其任何生物活性片段。根据本文公开的主题的融合蛋白构建体中使用的mts是位于功能性人类甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)的n-末端,通常长度为约15至约40个氨基酸,包括约3至约5个非连续的碱性氨基酸(精氨酸/赖氨酸)残基,通常具有几个丝氨酸/苏氨酸残基,但没有酸性氨基酸(天冬氨酸/谷氨酸)残基。在它们的分子结构中,这些mts能够形成强碱性两亲性α-螺旋,其对有效的线粒体运输是必不可少的。
如下文详述,为了测试各种tat-mts-mcm融合蛋白构建体到达完整细胞内的线粒体的能力,患者的原纤维细胞(其携带编码甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)蛋白质的基因中的突变),在如本文所述制备的各种tat-mts-mcm融合蛋白构建体的存在下进行孵育,所述各种构建体即:tat-mtsmcm,其携带mcm的原生mts;以及tat-mtscs-mcm和tat-mtslad-mcm,其携带与mcm异源的mts,即分别为柠檬酸合成酶(cs)和硫辛酰胺脱氢酶(lad)的mts。
值得注意的是,如下所述制备的所有tat-mts-mcm融合蛋白构建体成功地内化到线粒体中并进行处理,例如如图6c所证明的。
因此,在一些实施方案中,在根据本公开的融合蛋白中,人类mts是人类mcm的mts(即mcm的原生mts)或与所述人类mcm异源的mts(即不同线粒体蛋白/酶的mts)。
在具体的实施方案中,在根据本公开的融合蛋白中,人类mts是具有由seqidno:5表示的氨基酸序列的人类甲基丙二酰辅酶a变位酶mts。
在更进一步的实施方案中,根据本公开的融合蛋白具有由seqidno:18或seqidno:19表示的氨基酸序列,两者都包含mcm的mts。
如上所述,携带与mcm异源的mts的融合蛋白构建体,即分别包含柠檬酸合成酶(cs)和硫辛酰胺脱氢酶(lad)的mts的tat-mtscs-mcm和tat-mtslad-mcm,也显示内化到线粒体中并在其中进行分裂。
如本文所用,当提及融合至根据本公开的功能性人类甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)的mts时,术语“异源的”应理解为从另一种(不同的)线粒体蛋白或酶获得的mts,即不是mcm的天然存在的mts的mts(例如但不限于柠檬酸合成酶的mts或硫辛酰胺脱氢酶的mts)。
因此,在一些实施方案中,在根据本公开的融合蛋白中,人类mts是具有由seqidno:4表示的氨基酸序列的人类线粒体柠檬酸合成酶mts,或具有由seqidno:6表示的氨基酸序列的人类硫辛酰胺脱氢酶mts。
在具体的实施方案中,在根据本公开的融合蛋白中,人类mts是具有由seqidno:4表示的氨基酸序列的人类柠檬酸合成酶mts。
在一些实施方案中,本公开提供的融合蛋白包含具有由seqidno:3表示的氨基酸序列的hiv-1转录反式激活因子(tat)结构域,其连接至具有由seqidno:8表示的氨基酸序列的功能性人类mcm和具有由seqidno:4表示的氨基酸序列的人类线粒体柠檬酸合成酶mts,所述mts位于所述tat结构域和所述功能性人类mcm之间,并且其中所述mcm对于所述mts来说是c-末端。
在具体的实施方案中,根据本公开的包含人类线粒体柠檬酸合成酶mts的融合蛋白具有由seqidno:16或seqidno:17表示的氨基酸序列。
在其他具体的实施方案中,在根据本公开的融合蛋白中,人类mts是具有由seqidno:6表示的氨基酸序列的人类硫辛酰胺脱氢酶mts。
在一些实施方案中,本公开提供的融合蛋白包含具有由seqidno:3表示的氨基酸序列的hiv-1转录反式激活因子(tat)结构域,其连接至具有由seqidno:3表示的氨基酸序列的功能性人类mcm和具有由seqidno:6表示的氨基酸序列的人类线粒体硫辛酰胺脱氢酶mts,所述mts位于所述tat结构域和所述功能性人类mcm之间,并且其中所述mcm对于所述mts来说是c-末端。
在具体的实施方案中,根据本公开的融合蛋白具有由seqidno:20或seqidno:21表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,根据本公开的融合蛋白还包含至少一个接头。所述至少一个接头共价连接融合蛋白构建体的不同结构域。
在本公开的上下文中,术语“接头”是指位于不同的融合蛋白结构域之间并将它们共价连接在一起的约4至约20个氨基酸残基的氨基酸序列。例如,根据本发明的接头可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度。接头通常由柔性氨基酸残基(例如但不限于甘氨酸和丝氨酸)组成,使得相邻的蛋白质结构域相对于彼此自由移动。术语“接头”可与“间隔子(spacer)”互换使用。
能够使蛋白质的各种结构域正确折叠的接头的设计在本领域中是公知的。根据本公开的接头的非限制性实施例是以下氨基酸序列中的任何一个:mgss(由seqidno:9表示)、ssglvprgshm(由seqidno:10表示)、gsdpnsss(由seqidno:11表示)、gsdp(由seqidno:12表示)、gsdpm(由seqidno:13表示)、gss、ngie(由seqidno:14表示)、ni。
在本发明的上下文中的融合蛋白还可以任选地在其n-末端包含至少一个甲硫氨酸(m)残基,如下面示例的融合蛋白的情况所示。所述甲硫氨酸位于tat结构域的n-末端。
融合也可以通过重组技术实现,即通过构建编码整个融合蛋白(编码所有片段)的核酸序列,使得基本上所有的键都是肽键。
为了促进本文所述的蛋白质构建体的纯化,根据本公开的融合蛋白构建体还可以包含n-末端标签(例如,如下示例的his标签、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、麦芽糖-结合蛋白(mbp)、flag八肽,仅举几个例子),其可被去除或保留在最终的融合构建体中。这些标签通常在进入线粒体时与tat和mts序列一起从融合蛋白中分离。
因此,在一些实施方案中,根据本公开的融合蛋白还包含至少一种纯化标签(从而促进纯化,例如his标签或麦芽糖-结合蛋白(mbp)标签)。
也可通过在纯化标签附近的适当位点插入蛋白酶切割位点,而从根据本公开的融合蛋白构建体中分离纯化标签。因此,在一些实施方案中,根据本公开的融合蛋白还包含至少一个蛋白酶切割位点。
例如,由seqidno:16表示的融合蛋白构建体tat-mtscs-mcm从其n至c末端包含:具有氨基酸序列mgss(由seqidno:9表示)的接头,组氨酸标签(具有氨基酸序列hhhhhh,由seqidno:1表示),具有氨基酸序列ssglvprgshm(由seqidno:10表示)的另外的接头,tat结构域(具有氨基酸序列rkkrrqrrr,由seqidno:3表示),具有氨基酸序列gsdp(由seqidno:12表示)的另一个接头,柠檬酸合成酶的mts(由seqidno:4表示),位于mts和mcm之间的具有gss的氨基酸序列的另外的接头,以及mcm蛋白(由seqidno:8表示)。
因此,在一些实施方案中,在根据本公开的融合蛋白中,mts通过接头连接至所述功能性mcm和/或所述tat。
如上所述,本文定义的融合蛋白构建体还包含hiv-1转录反式激活因子(tat)结构域。如本文所用,术语“hiv-1转录反式激活因子(tat)”结构域是指由hiv-1中的tat基因编码的蛋白质的一部分,其是hiv-1tat蛋白的11-氨基酸精氨酸-和赖氨酸-富含部分。在一些实施方案中,如本文所述的tat具有由seqidno:2表示的氨基酸序列ygrkkrrqrrr。
本发明公开的主题还包括上述定义的tat结构域的任何片段。例如,根据本公开的主题的tat结构域可包含具有氨基酸序列ygrkkrrqrrr(seqidno:2)的hiv-1tat蛋白的约3至约11(例如4-11、5-11、6-11、7-11、8-11、9、10或11)个连续氨基酸残基。
在一些实施方案中,上述定义的tat结构域的片段包含hiv-1tat蛋白的9个连续氨基酸残基,其具有rkkrrqrrr的氨基酸序列,如seqidno.3所表示,如在下面举例说明的融合蛋白构建体的制备中所使用的。
因此,在本公开主题的上述和其他实施方案中,融合蛋白在其n-末端包含tat结构域和在其c-末端包含功能性mcm,两者共价连接(融合)至位于所述tat结构域和所述功能性mcm之间的mts。换句话说,本公开提供了蛋白质构建体,其包含融合至mts的n-末端的n末端-tat,该mts融合至功能性mcm的n-末端,如图1中所示。
通过另一个方面,本公开提供了一种组合物,其包含生理学上可接受的载体和作为活性成分的本文定义的融合蛋白。
通过另一个方面,本公开提供了一种药物组合物,其包含药学上可接受的载体和作为活性成分的本文定义的融合蛋白。
本文定义的“组合物”通常包含缓冲剂、调节其渗透压的试剂、和任选的一种或多种本领域已知的药学上(或生理学上)可接受的载体、稀释剂、添加剂和赋形剂。补充的活性成分也可以掺入组合物中。药学上可接受的载体可以是溶剂或分散介质,其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、以及植物油。在与其他成分相容并且对患者无害的意义上,视情况而定,每种载体应该是生理学上或药学上可接受的。
添加剂可以是但不限于蛋白酶抑制剂中的至少一种,例如苯基甲磺酰氟或苯甲基磺酰氟(pmsf)、甲磺酸萘莫司他(nafamostatmesylate)、4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(aebsf)、贝他定(bestatin)、天冬氨酸蛋白酶抑制剂(pepstatina)、e-64、亮抑酶肽(leupeptin)、1,10-菲咯啉(phenanthroline)和本领域已知的任何其他蛋白酶抑制剂。
本公开的主题的“药物组合物”是如上所述的组合物,其包含本领域已知的药学上可接受的载体、稀释剂、辅助剂和/或赋形剂和/或添加剂。
如下文详述,如本文所述制备的各种线粒体靶向的mcm融合蛋白构建体内化到线粒体中并经过切割成其活性形式。这通过在体外在由mma患者中获得的gm01673细胞的线粒体中融合蛋白构建体影响由氧化磷酸化(oxphos)产生的atp的能力而得到证明。如图7b所示,用各种融合蛋白构建体处理后观察到atp水平增加了15-25%,而融合蛋白构建体tat-mtscs-mcm引起最大的增加。此外,如图9所示,线粒体靶向的mcm融合蛋白构建体显示在gm01673成纤维细胞中影响线粒体的耗氧量,这是线粒体活性的另外的标记(图9)。
此外,线粒体靶向的mcm融合蛋白构建体还显示影响来自甲基丙二酸血症(mma)患者的gm01673细胞中的细胞活力。如图10所示,通过tat-mtscs-mcm(27%)和tat-mtslad-mcm(24%)融合蛋白构建体,在gm01673成纤维细胞中观察到相对于对照的细胞活力的显著增强。
因此,另一方面,本公开提供了如本文所定义的药物组合物,其用于治疗或缓解与mcm的缺陷或与有缺陷的mcm相关的疾病或病症。
如本领域已知的并且如本文所用,术语“与mcm的缺陷或与有缺陷的mcm相关的疾病或病症”是指影响具有mcm的缺陷或有缺陷的mcm的对象的任何疾病、病症、症状或病况。mcm的缺陷或有缺陷的mcm可能源于(但不限于)编码mcm的mut基因的突变。
术语“与mcm的缺陷或与有缺陷的mcm相关的疾病或病症”包括例如甲基丙二酸血症(mma)。
在上述和其他实施方案中,如本文定义的与mcm的缺陷或与有缺陷的mcm相关的疾病或病症是甲基丙二酸血症(mma)。
本领域已知的和本文所用的术语“甲基丙二酸血症”(mma)是指由线粒体酶甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)中的突变引起的常染色体隐性遗传性疾病,该酶催化甲基丙二酰辅酶a异构化为琥珀酰辅酶a并且需要钴胺素(b12)作为辅助因子。因此,mcm或腺苷钴胺素的缺陷导致甲基丙二酸血症。
mma包括单纯型甲基丙二酸血症(isolatedmethylmalonicacidemia)(omim251000)和甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症(methylmalonicacidemiaandhomocystinuria)omim277400。
因此,在本公开的一些实施方案中,mma是单纯型mmaomim251000。“单纯型甲基丙二酸血症”也称为本领域已知的并且如本文所定义的mut型mma(omim251000),是常染色体隐性病症,通常表现为代谢性酸中毒和高氨血症。症状发作时的年龄和对钴胺素的体内反应是疾病进程和生存的最强预测因子。基因型-表型相关性受到限制,这是由于纯合和复合杂合突变(特别是在编码mcm的mut基因中)的混合和丰度(11)。mut型mma也称为单纯型甲基丙二酸血症(omim251000),其由mcm脱辅酶的缺陷引起,该酶由核mut基因编码。
通常出现在婴儿早期的mma的影响从轻微到危及生命。受影响的婴儿可能会出现呕吐、脱水、肌肉张力减弱(肌张力减退)、发育迟缓、过度疲倦(嗜睡)、肝脏肿大(肝肿大)、以及体重增加及以预期的速度生长不能(发育停滞)。长期并发症可以包括喂养问题、智力残疾、慢性肾病、以及胰腺的炎症(胰腺炎)。若不进行治疗,这种疾病有时可能导致昏迷和死亡。
目前对维生素b12(羟钴胺素)无反应性mma患者的管理方法包括对营养源氨基酸的饮食限制、营养补充剂给药和警惕性监控。肝脏或联合肝/肾移植已被用于治疗具有最严重临床表现的患者。
患有mma的患者,即使是那些接受过肝移植的患者,也可能发展为进行性肾功能不全,并且最终可能需要进行肾移植。在患者群体(即使是那些经过深度治疗的患者)中看到的疾病表现,也表明需要新疗法,理想的是能够针对肝脏和肾脏的疗法,以增加稳定性并防止肾功能不全。
本公开进一步提供如本文所定义的融合蛋白或药物组合物,在治疗或缓解与mcm的缺陷或与有缺陷的mcm相关的疾病或病症的方法中的应用。
本公开进一步提供一种在有需要的对象中治疗或缓解与mcm的缺陷或与有缺陷的mcm相关的疾病或病症的方法,所述方法包括以下步骤:向所述对象施用治疗有效量的根据本发明的融合蛋白或药物组合物,从而治疗或缓解与mcm的缺陷或与有缺陷的mcm相关的疾病或病症。
本文定义的术语“治疗”、“处理”、“缓解”或其形式意指防止恶化或阻止或减轻或治愈有此需要的对象中的疾病或病症,即与mcm的缺陷或与有缺陷的mcm相关的疾病或病症,例如甲基丙二酸血症(mma)。
在意图的上下文中,术语“治疗”、“处理”、“缓解”并不是指疾病的完全治愈,因为它不会改变引起疾病的突变遗传学。该术语是指减轻与疾病相关的至少一种不希望的症状、改善对象的生活质量、降低疾病引起的死亡率、或(如果足够早地施用治疗)在其发生之前防止线粒体病症的完全表现,主要是对能量需求高的器官和组织。
换句话说,本公开提供了如本文所定义的融合蛋白或药物组合物或方法,该方法包括施用所述融合蛋白或药物组合物,以在有需要的对象中至少部分地替代有缺陷的、缺陷性或非功能性人mcm的活性。
因此,根据另一方面,本公开内容提供了一种在有需要的对象中至少部分地替代有缺陷的、缺陷性或非功能性人mcm的活性的方法,所述方法包括:向所述对象施用治疗有效量的如本文所定义的融合蛋白或药物组合物。
本文所用的术语“替代(substituting)”是指替换、交换、代替使用、或用作有缺陷的或非功能性mcm的替代物。
在一些实施方案中,功能性人mcm蛋白在有需要的对象中至少部分地替代有缺陷的、缺陷性或非功能性人mcm的活性。在具体的实施方案中,功能性人mcm蛋白在有需要的对象中提供无缺陷的人mcm的活性的至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或者高达100%。
本公开进一步提供了一种将功能性人甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)蛋白引入进有需要的对象的线粒体中的方法,所述方法包括以下步骤:向所述对象施用治疗有效量的根据本发明的融合蛋白或药物组合物,从而将功能性人mcm蛋白引入进所述对象的线粒体中。
治疗性组合物(或制剂)或药物组合物可以以本领域技术人员确定的任何常规途径和剂量施用。施用可以是静脉内、腹膜内、肌肉内和鞘内施用中的任何一种。还考虑了口服给药。
在具体的实施方案中,将如本文定义的融合蛋白或药物组合物静脉内施用至所述对象。
出于本文定义的目的,根据本发明的融合肽的术语“治疗有效量”(或量)通过本领域已知的考虑因素来确定,从而治愈或至少阻止或至少减轻医学状况。
在一些实施方案中,可以基于患者的mcm的基础蛋白活性,单独地为每个患者确定治疗有效量。可以使用本领域已知的任何方法,确定患者的基础蛋白质活性或蛋白质活性水平。
在一些实施方案中,根据本公开的方法还包括向所述对象施用额外的治疗剂。
在与mcm的缺陷或与有缺陷的mcm相关的疾病或病症(例如mma病症)的上下文中,术语“额外的治疗剂”是本领域技术人员已知的任何护理疗法标准。例如,对营养源氨基酸的饮食限制和营养补充剂给药。
本文使用的术语“对象(subject)”是指任何温血动物,例如大鼠、小鼠、狗、猫、豚鼠、灵长类动物和人,对于其来说有需要施用本文定义的治疗剂、或者本发明的任何药物组合物,即被诊断为患有与mcm的缺陷或与有缺陷的mcm相关的疾病或病症(例如mma)的对象。
本文使用的术语“约”表示可以与所指的值相比偏差高达1%、更具体地5%、更具体地10%、更具体地15%、并且在一些情况下高达20%更高或更低的值,偏差范围包括整数值,并且如果适用的话,也包括非整数值,构成连续范围。
应当理解,为了清楚起见,在单独的实施方案的上下文中描述的本公开主题的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反,为简洁起见,在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供,或者适合于本发明的任何其他描述的实施例。在各种实施例的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施例的必要特征,除非该实施例在没有那些元素的情况下不起作用。
公开和描述的,应当理解,本发明不限于本文公开的具体实施例、工艺步骤和材料,因为这些工艺步骤和材料可以有所不同。还应理解,本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的,而不是限制性的,因为本发明的范围仅受所附权利要求及其等效物的限制。
必须注意,如在本说明书和所附权利要求中使用的,单数形式“一”、“一个”和“该/所述”包括复数指示物,除非上下文另有明确说明。
在整个说明书和随后的权利要求中,除非上下文另有要求,否则词语“包括”和诸如“包含”和“含有”的变体将被理解为暗示包括所述的整数或步骤或整数或步骤的群组,但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的群组。
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。以下术语是为了本文所述的本发明的目的而定义的。
以下实施例代表发明人在实施本发明的方面时所采用的技术。应当理解,虽然这些技术是用于实施本发明的优选实施例的示例,但是本领域技术人员根据本公开将认识到,在不脱离本发明的精神和预期范围的情况下,可以进行多种修改。
实施例
无需进一步详细说明,相信本领域技术人员可以使用前面的描述最大限度地利用本发明。因此,以下优选的具体实施方案将被解释为仅仅是说明性的,并且不以任何方式限制要求保护的发明。
本文未具体描述的本领域已知的标准的分子生物学方案通常基本上如sambrook&russell,2001中所述。
实施例1:一般方法
细胞培养
从coriellcellrepositories(camden,nj)获得来自甲基丙二酸血症(mma)患者的成纤维细胞(gm01673、gm00050)并在推荐的培养基(memeaglerpmi培养基,补充有10%hyclonefbs、2mml-谷氨酰胺、100u/ml盘尼西林、以及100μg/ml链霉素,biologicalindustries,beitha'emek,israel)中生长。从哈达萨医学中心的遗传和代谢疾病部获得346成纤维细胞,并在与上述相同的培养基中生长。所有细胞系在37℃下在5%co2的潮湿气氛中生长。
质粒构建
表1融合蛋白构建体及其组分的氨基酸序列
蛋白质表达
在37℃下,在含有卡那霉素(50μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的盐水乳糖肉汤(slb培养基)中,培养用编码上文所述的融合蛋白tat-mts-mcm融合蛋白的质粒转化的大肠杆菌bl21-codonplus(λde3)或rosseta感受态细胞。在o.d.600为0.2-0.3时,向培养物中加入0.1%甘油和0.1mm谷氨酸钾,然后在42℃下进行热休克20-30分钟,之后细菌在37℃下生长,直到o.d.600为0.8。通过加入异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg,最终浓度参见以下的表1),诱导蛋白质表达。在12℃温育18小时后,通过离心(2000g,在4℃下20分钟)收获细胞。以下的表2总结了tat-mts-mcm融合蛋白的表达条件。
表2生长条件和融合蛋白构建体的浓度。
蛋白质纯化
对于纯化程序,使用在含有0.2mg/ml溶菌酶的结合缓冲液(25mmtrishclph8.0、0.2mnacl、10%甘油、5mmβ巯基乙醇、1mm苯甲基磺酰氟(pmsf))中的微射流机(microfluidics),破坏来自4升表达细胞培养物的细菌沉淀。通过离心(24,000g,4℃,1小时)澄清悬浮液,并加入咪唑(sigmaaldrich,st.louis,mo,usa)至终浓度10mm。将含有融合蛋白的上清液上样到预平衡(在结合缓冲液中)的hitrapchelatinghp柱(amersham-pharmaciabiotech,uppsala,sweden)上。通过逐步添加增加的咪唑浓度洗涤柱。最后,用洗脱缓冲液(结合缓冲液,250mm咪唑)洗脱目标蛋白质。所有纯化步骤均使用fplc系统
蛋白质浓度的确定
使用bradford试剂和bsa的标准曲线,根据bradford方法测量蛋白质浓度。在595nm的波长下确定蛋白质浓度。
通过电泳分离蛋白质
将来自各种蛋白质组分(5-2μg蛋白质/泳道)的样品上样到12%(w/v)sds/page凝胶上。
western蛋白质印迹分析
在12%sds-page凝胶上分离样品。然后将蛋白质电转移到immobilon-p转移膜(millipore,millipore,bradford,ma,usa)上。使用抗mcm(abcam,mass,usa)或抗his(amersham-pharmaciabiotech)抗体分别以1:1000和1:30,000的稀释度进行western印迹分析,以鉴定相关蛋白质。使用增强的化学发光试剂盒(ez-ecl,biologicalindustries,beit-haemek,israel)进行条带可视化。
线粒体的分离
使用差速离心分离线粒体。将细胞在缓冲液a(320mmol/l蔗糖,5mmol/ltris-hcl,2mmol/legta,ph7.4)中匀浆,并以2,000g离心3分钟以除去细胞核和细胞碎片。将获得的上清液在4℃以12,000g离心10分钟以沉淀线粒体。用缓冲液a再次洗涤线粒体沉淀两次并保持在-80℃直至使用。
将融合蛋白递送到细胞中
将细胞接种在3个t-75烧瓶上。当细胞达到90%汇合时,用含有0.02-0.05μg/μl(终浓度)tat-mts-mcm融合蛋白构建体的新鲜培养基替换培养基,在不同的时间段进行。温育后,用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞,用胰蛋白酶消化,沉淀并保持在-80℃直至使用。将沉淀重悬于含有1mmol/lpmsf的细胞裂解缓冲液(promega)中,在冰上保持10分钟并以15,000g离心10分钟。通过western印迹分析上清液。
测量atp水平
在无葡萄糖培养基中培养细胞48小时,该培养基含有dmem(不含d-葡萄糖、丙酮酸钠和l-谷氨酰胺)、10%经过认证的胎牛血清(fbs)(经透析的)、2mml-谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100μg/ml(biologicalindustries,beitha'emek,israel)、1.25μm维生素b-12(其是mcm和5mm半乳糖(sigma)的必需辅助因子)。
在用1μg的四种融合蛋白构建体中的每一种孵育后6小时,测定线粒体atp水平。根据制造商的说明书(perkinelmer,waltham,ma,usa),使用基于atplite发光的测定法测量atp水平,并且表达为相对于对照患者细胞的水平,即未用任何融合蛋白构建体处理(只添加pbs)的水平。
线粒体膜电位
分别使用mitotrackergreenfm(mtg)(molecularprobes,eugene,or,usa)和四甲基罗丹明乙酯(tmre)(abcam,mass,usa),估计线粒体含量和线粒体膜电位。将mtg加入到现有培养基中至终浓度为200nm,并将细胞在37℃、5%co2下孵育45分钟。将tmre连续加入到现有培养基中至终浓度为200nm,并将细胞在37℃、5%co2下再温育20分钟。除去培养基,并且在用pbs(对于mtg)或在pbs中的0.2%bsa(对于tmre)冲洗一次之后,用100μlpbs替换。在37℃,在λex485nm、λem528nm(mtg)和λex485nm、λem590nm(tmre)下读板。
耗氧量
使用xf24细胞外通量分析仪(seahorsebiosciences,northbilleric,ma,usa)测量耗氧率(ocr)。
细胞活力测试
将细胞接种在96孔板(每孔15,000个细胞)中的100μl无葡萄糖培养基中24小时。第二天,加入1.5μg的融合蛋白72小时。将单独的线粒体分离缓冲液用作对照。根据制造商的手册,使用celltiter-
实施例2
tat-mts-mcm融合蛋白构建体的构建、表达和纯化
为了测试使用基于甲基丙二酰辅酶a变异酶(mcm)的融合蛋白有效地靶向线粒体的可行性,如上所述地准备和分析了基于mcm的融合蛋白构建体,其包含转录反式激活因子(tat)结构域和各种不同的线粒体易位序列(mts)。
使用的mts是mcm的同源的、天然的mts,或人的异源mts,其是核编码的线粒体蛋白,是将人mcm蛋白靶向线粒体的经典mts序列。使用的异源mts是:硫辛酰胺脱氢酶的mts(在本文中也称为“lad”或“lad”,具有由seqidno.6表示的氨基酸序列),对应的融合蛋白构建体在本文中称为“tat-mtstlad-mcm”;柠檬酸合成酶的mts(cs,具有由seqidno.4表示的氨基酸序列),对应的融合蛋白构建体在本文中称为“tat-mtscs-mcm”;以及mcm的天然mts(mcm,具有由seqidno.5表示的氨基酸序列),对应的融合蛋白构建体在本文中称为“tat-mtsmcmmcm”。
此外,制备了缺乏mts的融合蛋白构建体,在本文中称为“tat-δmts-mcm”。
所有质粒在其编码序列的5'端用his标签克隆以促进其纯化,并且所有编码序列都在t7启动子的控制下。
各种融合蛋白构建体的示意图显示在图1中,并且如上所述制备的各种融合蛋白构建体的序列详述于表1中。如表1所示,制备了包含柠檬酸合成酶的mts(cs)的两种融合蛋白构建体“tat-mtscs-mcm”和“tat-mtscs-mcm变体”,并且其氨基酸序列分别由seqidno:16和seqidno:17表示。
由seqidno:16表示的融合蛋白构建体(tat-mtscs-mcm)从其n至c末端包含:具有氨基酸序列mgss(由seqidno:9表示)的连接子,组氨酸标签(具有氨基酸序列hhhhhh,由seqidno:1表示),具有氨基酸序列ssglvprgshm的另外的接头(由seqidno:10表示),tat结构域(具有氨基酸序列rkkrrqrrr,由seqidno:3表示),具有氨基酸序列gsdp(由seqidno:12表示)的另一个接头,柠檬酸合成酶的mts(由seqidno:4表示),具有gss的氨基酸序列的位于mts和mcm之间的另外的接头,以及mcm蛋白(由seqidno:8表示)。
如表1所示,由seqidno:17表示的融合蛋白构建体(tat-mtscs-mcm变体)不包含接头gss,因此该融合蛋白构建体的mts和mcm片段是直接连接的。
还如表1中所示,制备了包含甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)的mts的两种融合蛋白构建体,其氨基酸序列由seqidno:18和seqidno:19表示,并且制备了包含硫辛酰胺脱氢酶(lad)的mts的两种融合蛋白构建体,其氨基酸序列由seqidno:20和seqidno:21表示。
除了上述含有his的融合蛋白构建体之外,还制备了融合蛋白构建体,其中his标签可以从最终产物中除去,并且在本文中被称为“tat-mtsmbp-mcm”或mbp-tat-mtsmcm-mcm,其氨基酸序列由seqidno:22表示。该融合蛋白构建体包含(从其n至c末端)his和麦芽糖结合蛋白(mbp)标签,然后是tev蛋白质切割位点、tat结构域、mcm的天然mts以及mcm。
还制备了缺乏mts的融合蛋白构建体,在本文中称为“his-tat-δmts-mcm”,其氨基酸序列由seqidno:23表示。通过限制酶和测序分析确认了克隆。
在大肠杆菌宿主中进行融合蛋白构建体的表达。通过改变几个参数,包括宿主(其选自bl21、bl21codonplus、rosseta和hms)、诱导物(iptg)的浓度、诱导期的长度和条件(即温度、化学品的添加等,如上表1所示),分别对tat融合蛋白构建体中的每一个校准表达宿主和表达条件。
选择codon+细菌细胞用于表达融合蛋白构建体tat-mtscs-mcm和tat-mtsmcmmcm,而选择rosseta细菌细胞用于融合蛋白构建体tat-mtstlad-mcm和tat-δmts-mcm,因为这些细胞中的表达似乎最有效,如图2所示。
表达后,破坏细菌细胞并制备细胞亚组分,分离可溶性和不溶性组分,如上所述。如图3所示,在sds-page凝胶上对全细胞细菌(wce)、可溶性组分(溶胶)和不溶性组分进行分析,从而检查融合蛋白是否被表达以及它积累在哪个亚细胞组分。目标是在表达细菌的可溶性亚组分中获得不同tat融合蛋白的高表达水平,用于将来的纯化。如图3e和图3f所示,还使用抗his抗体,通过western印迹分析表征不同的tat融合蛋白构建体。
接下来,如上所述,使用亲和色谱法高度纯化各种融合蛋白构建体。将融合蛋白构建体(每个都包含不同的mts序列)中的每一个的可溶性组分加载到ni-螯合柱上,然后用增加浓度的咪唑进行多个洗涤步骤,最后在高浓度的咪唑下洗脱,如在图4a-图4d中所示。
为了表征融合蛋白,使用抗mcm抗体,通过sds-page和western印迹分析来分析洗脱的蛋白质。如在图5a和图5b中所示,纯化的融合蛋白构建体显示出预期大小的主要条带(约87kda)。在四种融合蛋白构建体中观察到轻微的大小变化,这是由于所用各种mts多肽的长度变化引起的。
实施例3
tat-mts-mcm融合蛋白构建体的内化及其加工
为了测试各种tat-mts-mcm融合蛋白构建体到达完整细胞之内的线粒体的能力,首先将患者673成纤维细胞(其在编码甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)蛋白的基因中携带终止密码子突变)与各种浓度的tat-mtscs-mcm(具有由seqidno:16表示的氨基酸)一起温育24小时,并通过western印迹分析测定细胞内化(进入全细胞裂解物)。如图6a所示,tat-mtscs-mcm成功地内化到细胞中。
如下详述的,还检查了额外的融合蛋白构建体内化到线粒体中的能力。在各种融合蛋白构建体的存在下孵育患者673成纤维细胞后,制备亚细胞组分,从而将线粒体与胞质溶胶分离。然后使用抗his抗体(图6b)和抗mcm抗体(图6c和图6d),通过western印迹,分析线粒体样品中基于mcm的融合蛋白构建体的存在。
如图6所示,western印迹分析证实了线粒体内融合蛋白构建体的内化。
此外,通过使用抗mcm抗体(图6c和图6d),证明了tat-mtscs-mcm、tat-mtslad-mcm以及tat-mtsmcm-mcm融合蛋白构建体经历了加工,如从额外的产物的外观可以看出,其尺寸小于与特异性抗体反应(图6c,标记为经加工的蛋白)。
然而,tat-δmts-mcm融合蛋白构建体缺乏任何mts,尽管最可能由于允许穿过生物膜的tat序列而到达线粒体,是唯一没有经历任何加工的融合蛋白构建体,如图6d所示。
实施例4
线粒体靶向的mcm对线粒体atp生产的影响。
为了确定线粒体靶向的mcm融合蛋白构建体是否能够影响线粒体中由氧化磷酸化(oxphos)产生的atp,在无葡萄糖的oxphos依赖性培养基中培养gm01673、gm00050和346成纤维细胞48小时,该培养基补充有作为能量来源的经透析的血清、以及1.25μm维生素b-12(它是mcm的必需辅助因子)。
在用10μg/ml(100μl体积)的线粒体靶向的mcm融合蛋白构建体(即tat-mtscs-mcm、tat-mtstlad-mcm、tat-δmts-mcm、tat-mtsmbp-mcm和tat-mtsmcmmcm,分别由seqidno:18、seqidno:22、seqidno:25、seqidno:24和seqidno:20表示)中的每一个孵育后6小时,测定线粒体atp水平。
如图7所示,对于所有融合蛋白构建体,在346细胞(图7a)中观察到atp水平在14-21%之间的显著增强,而tat-mtscs-mcm和tat-δmts-mcm增幅最大。
在gm01673成纤维细胞中(图7b),用各种融合蛋白构建体处理后观察到atp水平增加15-25%,而融合蛋白构建体tat-mtscs-mcm导致最大增加。有趣的是,相对于这些细胞中的对照,融合蛋白构建体tat-δmts-mcm不影响atp水平,这意味着其加工对mcm活性是重要的。相对于对照,gm00050成纤维细胞导致atp水平没有显著变化(图7c)。
实施例5
线粒体靶向的mcm融合蛋白构建体对线粒体膜电位的影响
为了确定线粒体靶向的mcm是否会影响线粒体膜电位,将gm01673成纤维细胞在无葡萄糖的、oxphos依赖性培养基中培养24小时,该培养基补充有作为能量来源的经透析的血清,并添加1.25μm维生素b-12。在用15μg/ml(100μl体积)的线粒体靶向的mcm融合蛋白构建体(tat-mtscs-mcm和tatmcmmcm,分别由seqidno:16和seqidno:18表示)孵育后6小时,测定线粒体膜电位。
如上所述,在孵育时间结束前1小时(即5小时后),将mitotrackergreenfm加入培养基中至终浓度为200nm。然后,在孵育时间结束前30分钟,加入fccp(20μm)作为对照,并在孵育时间结束前20分钟,以200nm加入tmre。用补充有0.2%bsa的pbs洗涤tmre孔一次,并再悬浮100μl。将mtg孔洗涤一次并再悬浮100μl。如上所述测量tmre/mtg比率。
如图8所示,两种融合蛋白构建体都改变了线粒体膜电位,其中构建体tat-mtscs-mcm导致线粒体膜电位(51%)略高于tatmcmmcm(40%)。
实施例6
线粒体靶向的mcm融合蛋白构建体对耗氧量的影响
为了确定线粒体靶向的mcm融合蛋白构建体是否能够影响线粒体的氧消耗(这是线粒体活性的另一个标志物),在无葡萄糖的、oxphos依赖性培养基中培养gm01673成纤维细胞48小时,该培养基补充有作为能量来源的经透析的血清以及1.25μm维生素b-12。
在用10μg/ml(100μl体积)的线粒体靶向的mcm融合蛋白构建体中的每一种孵育后6小时,使用seahorse细胞外通量(xf)分析仪测定耗氧量。如图9所示,在用各种融合蛋白构建体处理后,在氧消耗中观察到50-102%(相对于对照)的显著增强。tat-mtscs-mcm导致氧消耗量增加最多,而tat-δmts-mcm再次显示活性降低。
实施例7
线粒体靶向的mcm融合蛋白对细胞活力的影响
为了确定tat-mts-mcm融合蛋白向mma患者细胞中的递送是否会影响细胞活力,将gm01673、gm00050或346患者成纤维细胞在oxphos依赖性培养基中培养24小时。在用15μg/ml的每种融合蛋白孵育后72小时测定细胞活力。如图10所示,对于所有融合蛋白,在gm01673中观察到细胞存活率显著增加13-30%(图10a),在gm00050中观察到11-36%增加(图10b),在346成纤维细胞中观察到12-22%增加(图10c)。同样,与未处理的对照细胞相比,用tat-mtscs-mcm融合蛋白处理导致细胞活力的最高改善(27%),而tat-mtsδ-mcm处理显示出gm01673细胞的活性降低。
实施例8
线粒体靶向的mcm融合蛋白对mma水平的影响。
mma病理的主要症状是mma水平升高,这可能是多系统病理学的影响[12,13]。为了确定tat-mts-mcm融合蛋白向mma患者细胞中的递送是否可以降低mma水平,将gm01673患者成纤维细胞在oxphos依赖性培养基中培养24小时。在用7.5或15μg/ml的tat-mtscs-mcm孵育后48小时,使用eliza试剂盒测定全细胞裂解物中的甲基丙二酸水平。如图11所示,用15μg/ml的tat-mtscs-mcm处理后,观察到mma水平显著降低25%。
有趣的是,基于使用腺相关病毒血清型8载体(aav8)的基因治疗的其他报道的治疗[14]也表明,mma水平没有像预期的那样彻底降低(观察到~40%降低)[15]]。即使将aav8递送给新生小鼠,甚至在重新施用病毒之后,这也是一致的[16]。因此,在治疗时线粒体可能已经不可逆地受损。因此,应考虑在早期阶段(例如在怀孕期间)提供治疗。
实施例9
tat-mts-mcm融合蛋白对肝脏分泌的影响。
在从mma患者获得的成纤维细胞的培养物中,测试了所有tat-mts-mcm融合蛋白的作用。然而,由于在mma病理中受影响的主要器官是肝脏[16],我们的目的是产生缺乏mcm表达的肝细胞系以模拟mma肝脏病理学。最近,erlich等人已经证明线粒体功能对肥大细胞分泌介质至关重要[17]。因此,我们的假设是mcm突变的肝细胞中的分泌可能受损。为了检验这一假设,我们使用crispr技术,从hepg2细胞中敲除了mut基因,这是一种可接受的白蛋白分泌模型[18]。用抗mcm抗体通过western印迹分析证实了mut基因的缺失(图12a)。在hepg2mcm(-/-)细胞中未检测到mcm蛋白水平。接下来,在用15μg/ml的tat-mtscs-mcm处理24小时(图12b)或48小时(图12c)的hepg2mut(-/-)细胞(oxphos培养基)的生长培养基中,与对照相比,通过western印迹分析测定白蛋白水平。如图12b-c所示,在用tat-mtscs-mcm处理后,分泌的白蛋白水平增加(24小时为21%,48小时为69%)。此外,已确定尿素是从肝细胞分泌的。因此,在用tat-mtscs-mcm融合蛋白处理48小时后,通过covas分析测定生长培养基中尿素的水平(将样品标准化为裂解细胞的蛋白质浓度)。如图12c所示,用tat-mtscs-mcm处理后,分泌的尿素水平增加了29%。总之,恢复肝细胞中的mcm活性可能会影响肝脏的主要功能,例如白蛋白和尿素分泌。此外,我们建议线粒体功能和mcm活性在肝脏介质分泌中的作用。
实施例9
tat-mts-mcm融合蛋白在怀孕小鼠体内穿过胎盘
鉴于tat跨越许多不同细胞和组织类型的能力,我们假设tat-mts-mcm能够穿过胎盘。我们测试了tat-mts-mcm蛋白在小鼠模型中穿过胎盘并递送到胚胎的能力和功效,这一要求对于未来的人类治疗也是至关重要的。
由于在甲基丙二酰基co变位酶的小鼠模型中,在出生当天观察到死亡率,在我们的治疗中我们在妊娠的最后一周注射w.tc57bl小鼠三次,使用抗甲基丙二酰辅酶a变位酶和抗β肌动蛋白抗体的western印迹分析在几个组织中检测了酶的存在。我们选择针对能量需求最高并因此通常在线粒体疾病中受影响最大的三个主要器官-肝脏、心脏(肌肉)和大脑进行工作。从图13a-d中可以看出,与对照小鼠相比,tat-mtscs-mcm蛋白的量在经过处理的新幼仔的心脏(a)、以及肝脏(b)、但最重要的是在脑(a)中显著更高,这证明了tat-mtscs-mcm递送进入组织中,进一步地,与对照相比,在治疗中经注射的大脑的母亲中tat-mtscs-mcm的量更高。
我们还测量了mut/肌动蛋白的比率,并且正如我们所看到的,与对照小鼠相比,经处理小鼠的组织中蛋白质的量更高。
参考文献
以下列出了被认为与当前公开的主题相关的参考文献:
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[18]ha,c.e.,etal.,jbiomedsci.,2009.16:p.32。
对本文上述参考文献的确认,不应被推断为意味着这些与本发明公开的主题的可专利性有任何关联。
序列表
<110>夏甲·格雷夫
阿娜特·费尔德曼
<120>用于治疗与mcm缺陷相关的病症的甲基丙二酰辅酶a变位酶(mcm)融合构建体
<130>biob-008/001wo322146-2121
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