使用CLEVER-1、TNF-α和HLA-DR结合剂的免疫活化的诊断的制作方法

本发明涉及用于免疫活化中的能够结合clever-1的试剂和基于其的方法。

发明背景

本文中用于说明本发明的背景的出版物和其他材料，并且特别是为实践提供额外细节的情况，通过引用并入本文。

clever-1是wo03/057130中公开的蛋白，常见淋巴内皮和血管内皮受体-1，也称为stabilin-1或feel-1。clever-1也已经由kzhyshkowskaj.(2010),thescientificworldjournal10,2039-2053综述。clever-1在淋巴内皮细胞、某些血管内皮细胞中表达，而且也在巨噬细胞亚群中表达。clever-1是一种多功能分子，其为2型巨噬细胞和人单核细胞的亚群赋予清除能力。

巨噬细胞在肿瘤的生长或消退中起重要作用。肿瘤相关巨噬细胞(tam)的机制公开于例如noyr.和pollardj.w.的出版物,“tumour-associatedmacrophages:frommechanismstotherapy”,出版于immunity41,july17,2014,p.49-61。m2巨噬细胞在人类癌症中占主导地位并刺激肿瘤生长，但这些促进肿瘤的巨噬细胞可以被调节成抑制肿瘤生长的巨噬细胞，也被称为m1巨噬细胞或促炎性巨噬细胞，其旨在减缓或停止癌症生长。因此，巨噬细胞表型的调节是各种癌症的免疫疗法中的有前途的方法。然而，已经注意到，用目前可用的旨在靶向tam的治疗剂治疗癌症的尝试伴随着不期望的副作用，例如，巨噬细胞治疗方法可能具有全身毒性或矛盾地促进肿瘤生长，因为它们靶向所有巨噬细胞。

发明概述

已经发现，能够结合人clever-1的试剂可用于活化巨噬细胞以将它们的表型从m2巨噬细胞转换成m1巨噬细胞。特别地，能够结合tam上的clevr-1的试剂，诸如抗体及其片段、肽或大分子，可用于实现促进肿瘤的巨噬细胞(m2)调节为促炎性巨噬细胞(m1)。本发明涉及用于利用巨噬细胞以转换其表型的能力的方法。

现在，已经发现，可以通过测量巨噬细胞/单核细胞tnf-α分泌和/或hla-dr表达来监测m2巨噬细胞向m1巨噬细胞的调节。因此，本发明提供了用于监测和/或估计患者中抗clever-1疗法的效力的方法。

本发明涉及通过在患者中施用能够结合clever-1的试剂后监测m2巨噬细胞向m1巨噬细胞的调节的发展来估计抗clever-1疗法的效力的方法，其包括以下步骤：

(a)从抽取自所述患者的血液样品获得外周血单核细胞(pbl)，

(b)测量所述pbl的tnf-α分泌，和/或

(c)测量cd14阳性pbl上的hla-dr表达，和

(e)将步骤(b)和(c)中测量的tnf-α分泌和/或hla-dr表达的值与对照值进行比较用于估计抗clever-1治疗的效力，其中对照值是在患者中施用能够结合clever-1的试剂之前测量的值或在同一患者中在不同时间点进行的一次或多次先前测量的值，且其中tnf-α分泌或hla-dr表达增加指示m2巨噬细胞向m1巨噬细胞的调节。

在一个方面，能够在个体中结合clever-1的试剂适合用于通过将m2巨噬细胞调节成m1巨噬细胞来去除肿瘤或抗原免疫抑制。优选地，本发明涉及能够结合clever-1分子上的表位的试剂，诸如抗体或其片段、肽或大分子，其中所述表位是不连续的且包含以下序列：

人clever-1的pftvlvpsvssfssr(seqidno:1)，和

qeitvtfnqftk(seqidno:2)。

巨噬细胞表型的调节增加t细胞活化且最终导致例如去除癌症起源的免疫抑制。因此，本发现提供了用于影响个体中的免疫系统的方法，并且特别可用于治疗癌症或预防癌转移，但不限于该方法。因此，能够结合tam上的clever-1、优选结合clever-1分子上的特定序列的试剂，诸如抗体或其片段、肽或大分子，适合用于在个体中治疗癌症或预防癌转移，其中通过将m2巨噬细胞调节成m1巨噬细胞来去除恶性生长周围的免疫抑制。

能够结合clever-1、优选结合clever-1分子上的特定序列的试剂，诸如抗体或其片段、肽或大分子，也适合用于治疗个体中的慢性感染，其中通过将m2巨噬细胞调节成m1巨噬细胞来去除针对感染抗原的免疫抑制。

因此，当在患者中施用能够结合clever-1的试剂用于治疗癌症或预防癌转移或治疗慢性感染时，可以特别应用根据本发明的用于估计抗clever-1疗法的效力的方法。

此外，能够结合clever-1、优选结合clever-1分子上的特定序列的试剂也适合用作疫苗的佐剂，其中通过将m2巨噬细胞调节成m1巨噬细胞来去除针对疫苗抗原的免疫抑制。

在另一个方面，本发明涉及用于将m2巨噬细胞调节成m1巨噬细胞的方法，其包括向有需要的受试者施用本申请中公开的能够结合clever-1、优选结合clever-1分子上的特定序列的试剂。此外，本发明涉及所述用于将m2巨噬细胞调节成m1巨噬细胞的方法用于在个体中治疗癌症或预防癌转移或在个体中治疗慢性感染的用途。

附图简述

图1a显示测定来自cd14阳性细胞的hla-dr表达的结果。用人igg或靶向clever-1的人源化抗体vh3/vk5处理细胞。用于测定来自cd14阳性细胞的hla-dr表达的方法在实验部分中详细呈现。

图1b显示使用tnf-αelisa试剂盒(invitrogen)从培养基测量的可溶性tnf-α的结果。

图2a显示在施用结合clever-1的抗体后，同系e0771乳腺癌中的tam再极化。通过流式细胞术，通过表达mhcii(在人hla-dr中)的巨噬细胞群体的增加来测量tam再极化。每个点代表一只小鼠中mhcii^高cd11b⁺f4/80⁺tam的百分比。

图2b显示在施用结合clever-1的抗体后，来自e0771同系乳腺癌的tam上tnf-α的分泌增加。每个点代表从一只小鼠分离的tam。

发明的定义和详述

术语“clever-1”用于表示wo03/057130中公开的蛋白，常见淋巴内皮和血管内皮受体-1。

术语“能够结合人clever-1的试剂”是指能够结合人clever-1的试剂，包括抗体及其片段或肽等。该试剂也可以是具有足够亲和力以结合本申请中定义的人clever-1的特定表位的任何其他大分子。

术语“抗体或其片段”以最广泛的含义使用，以覆盖能够在个体中结合clever-1分子的抗体或其片段。特别地，应理解为包括嵌合、人源化或灵长类化的抗体以及抗体片段和单链抗体(例如fab、fv)，只要它们表现出期望的生物活性。

wo03/057130中公开了特别优选的clever-1拮抗剂单克隆抗体3-266(dsmacc2519)和3-372(dsmacc2520)，两者均在国际承认用于专利程序的目的的微生物保藏的布达佩斯条约的条款下，在2001年8月21日保藏在dsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,mascheroderweg1b,d-38124braunschweig。

术语“患者”或“个体”是指人。

术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”应理解为包括疾病的完全治愈以及所述疾病的改善或缓解。术语“预防”应理解为包括完全防止、预防以及降低个体患有所述疾病或病症的风险。

巨噬细胞可以分为两种不同的表型：m1和m2巨噬细胞。m1巨噬细胞是经典的促炎性巨噬细胞，其产生大量促炎性细胞因子和共刺激分子，并且在t细胞应答的活化中非常有效。相反，m2巨噬细胞是免疫抑制细胞，其合成抗炎性细胞因子并诱导调节性t细胞，并且因此极大地抑制抗原驱动的t细胞活化。肿瘤相关巨噬细胞(tam)被认为是有害的，因为它们在肿瘤环境内成熟为m2巨噬细胞(促进肿瘤的巨噬细胞)并抑制抗肿瘤免疫应答并介导血管生成转换(癌症生长中的关键步骤)。m2巨噬细胞可以被调节成m1巨噬细胞(促炎性巨噬细胞)，并且这种从m2至m1的表型转化可以直接或间接地引起肿瘤排斥。

在本上下文中，表述“m1巨噬细胞”或“促炎性巨噬细胞”是指这样的巨噬细胞，其特征在于巨噬细胞/单核细胞tnf-alpha(tnf-α)分泌或hla-dr表达的测量水平增加。与在患者中施用能够结合clever-1的试剂之前测量的对照值或在同一患者中在不同时间点进行的一次或多次先前测量的值相比，m2巨噬细胞向m1巨噬细胞的调节将增加单核细胞tnf-α分泌以及hla-dr表达。重要的是，将单核细胞tnf-α分泌和hla-dr表达的测量值与同一患者的值进行比较，因为这些标记物的水平可能因个体而各不相同，且例如细胞因子诸如干扰素-γ和lps活化可以增加m2巨噬细胞的tnf-α表达。

已经令人惊讶地发现，可以活化m2巨噬细胞以调节m1巨噬细胞，其通过以能够结合人clever-1的试剂接触所述巨噬细胞来实现。特别是已经发现，与恶性肿瘤相关的m2巨噬细胞可以被调节或再极化成m1巨噬细胞，其通过以能够结合tam上的clever-1的试剂接触所述巨噬细胞来实现。两种表型可以同时存在，并且两种表型均可以在肿瘤中找到。

试剂，诸如抗原或其片段、肽或大分子，与人clever-1结合，用于实现巨噬细胞表型的所述调节或再极化。已经鉴定，对clever-1蛋白特异性的试剂诸如抗体识别特定clever-1表位。因此，试剂优选地与clever-1分子上的特定序列(即表位)结合，用于实现巨噬细胞表型的所述调节，其中所述表位是不连续的且包含以下氨基酸序列：

人clever-1的pftvlvpsvssfssr(seqidno:1)，和

qeitvtfnqftk(seqidno:2)。

在本发明的一些实施方案中，所述不连续表位进一步包含一种或多种选自以下的氨基酸序列：

人clever-1的atqtgrvflq(seqidno:3)，

dslrdgrliylf(seqidno:4)，

skgriltmanqvl(seqidno:5)，和

lcvyqkpgqafctcr(seqidno:6)。

靶蛋白人clever-1(即人stabilin-1)的一部分已在seqidno:7中定义。clever-1分子上的表位seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6对应于seqidno:7中定义的靶蛋白人clever-1的氨基酸420-434、473-484、390-399、576-587、615-627和313-327。在芬兰专利申请号20165335中更详细地公开了人clever-1的不连续表位作图。

与tam上clever-1上的两个或更多个所述表位序列的特异性结合将提供用于治疗癌症或预防癌转移而没有有害副作用的新型方法，因为该治疗可靶向至特定表位以实现巨噬细胞表型的期望调节。因此，本文描述的发现特别可用于治疗或预防所有种类的与促进肿瘤的巨噬细胞的量增加相关的恶性肿瘤或其他病理诸如慢性炎症，其中个体呈现免疫抑制的优势。因此，用于治疗癌症或预防癌转移的方法，其包括向个体施用结合clever-1、优选上文定义的clever-1分子上的特定表位的抗体或其片段。所述方法包括通过如下治疗或预防癌症：减小肿瘤尺寸和/或；减小个体中的肿瘤生长；和/或抑制癌细胞迁移和癌转移形成。因此，可以治疗任何良性或恶性肿瘤或恶性肿瘤的癌转移，诸如皮肤癌和结肠癌。还可以治疗白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。具体地，基于动物模型，预期黑色素瘤和淋巴瘤对所述治疗反应非常好。

调节巨噬细胞表型的方法据信可用于治疗或预防所有种类的肉瘤，诸如纤维肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤、间皮瘤、脑膜瘤、白血病、淋巴瘤，以及所有种类的癌，诸如鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、乳头状癌、囊腺癌、支气管癌、黑色素瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、移行细胞癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤和胚胎癌。

除了影响肿瘤的生长或消退以外，巨噬细胞在炎症和感染消退期间也具有重要作用。在感染中，可以发生从m1向m2巨噬细胞的转换，导致产生废除效应物免疫的抑制环境。因此，此处描述的调节巨噬细胞表型的发现也可用于治疗慢性感染以去除针对感染抗原的免疫抑制。用于治疗慢性感染的方法，包括向个体施用能够结合clever-1、优选上文定义的clever-1分子上的两个或更多个特定表位序列的试剂，其中所述试剂可以活化巨噬细胞以将其表型从m2转换为m1。

此外，能够在个体中结合巨噬细胞和单核细胞上的clever-1分子的试剂可用作疫苗中的佐剂。所述试剂实现巨噬细胞的再极化，且因此去除或至少降低针对疫苗抗原的免疫抑制。如果宿主或疫苗接种部位可以暂时从免疫抑制要素中除去，则任何抗原诱导的疫苗接种都可以是有益的。

包含能够结合clever-1的试剂和适当的赋形剂的药物组合物适合用于治疗或预防癌症，或治疗慢性感染。待用于本发明中的药物组合物可以通过实现其预期目的的任何手段来施用。例如，施用可以是静脉内、关节内、肿瘤内或皮下的。除了药理学上活性化合物以外，化合物的药物制剂优选含有合适的药学上可接受的载体，其包含赋形剂和助剂，其有助于将活性化合物加工成可药用的制剂。

可以通过测量来自人血液样品的单核细胞tnf-α分泌来验证m2向m1巨噬细胞的调节。因此，tnf-α分泌增加可用作用于监测个体中的治疗应答的标记物。tnf-α分泌可以从抽取自患者的血液富集的外周血单核细胞测定。当测量的tnf-α的水平与在患者中施用能够结合clever-1的试剂之前从同一患者测量的对照水平或在同一患者中在不同时间点进行的一次或多次先前测量的值相比时，测量的tnf-α的水平可以用作患者对治疗(其包括施用能够结合人clever-1的所述试剂)的反应的标记物。

根据本发明的一个实施方案，通过当在患者中施用能够结合clever-1、优选clever-1上的所述两个或更多个特定表位序列的试剂时监测m2巨噬细胞向m1巨噬细胞的调节的发展来估计抗clever-1疗法的效力的方法，其包括以下步骤：

(a)从抽取自所述患者的血液样品获得外周血单核细胞(pbl)，

(b)测量所述pbl的tnf-α分泌，和/或

(c)测量cd14阳性pbl上的hla-dr表达，和

(e)将步骤(b)和(c)中测量的tnf-α分泌和/或hla-dr表达的值与对照值进行比较，用于估计抗clever-1治疗的效力，其中对照值是在患者中施用能够结合clever-1的试剂之前测量的值或在同一患者中在不同时间点进行的一次或多次先前测量的值，且其中tnf-α分泌或hla-dr表达增加指示m2巨噬细胞向m1巨噬细胞的调节。

来自从抽取自患者的血液样品获得的外周血单核细胞的tnf-α分泌的测定可以通过众所周知的方法、例如通过使用市售的tnf-αelisa试剂盒来进行。还可以通过使用已知方法通过流式细胞术来监测cd14阳性单核细胞上的hla-dr表达。

可以通过将单核细胞tnf-α分泌的测量水平与在患者中施用能够结合clever-1的试剂之前测量的对照值或在同一患者中在不同时间点进行的一次或多次先前测量的值进行比较来监测m2巨噬细胞向m1巨噬细胞的调节的发展。例如，与来自先前测量的结果或对照相比，单核细胞tnf-α分泌的水平降低可用于指示m2巨噬细胞的更高表达，而与来自先前测量的结果或对照相比，tnf-α的水平增加可用于指示m1巨噬细胞的表达更多，且m2巨噬细胞的表达更少，其中其也可用于指示抗clever-1处理的效力。tnf-α的水平增加指示m1巨噬细胞的表达更多，且m2巨噬细胞的表达更少，即其将反应性归因于所述疗法。能够结合clever-1的试剂将活化至少一部分m2巨噬细胞以再极化成m1巨噬细胞，并且在施用所述试剂后，可以存在两种巨噬细胞表型，但可以观察到m1巨噬细胞的表达与施用所述试剂前的情况相比增加。

根据本发明的一个实施方案，与对照值相比，测量的tnf-α分泌增加至少两倍指示m2巨噬细胞向m1巨噬细胞的调节，并且从而指示患者对疗法的反应性。

通过以下非限制性实施例说明本发明。应当理解，以上描述中给出的实施方案和实施例仅用于说明目的，并且在本发明的范围内可以进行各种变化和修改。

实施例

实施例1：体外抗体结合

收集来自健康供体的人外周血单核细胞，并通过ficoll-梯度离心从约9ml外周血中富集它们。其后，将它们以1.2×10⁶个细胞/孔的密度铺板在低附着96孔板中的补充有1％人ab血清的imdm培养基中。将细胞用1μg/ml或10μg/ml抗clever-1抗体3-372(在2001年8月21日保藏于dsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh的dsmacc2520)或vh3/vk5(识别所述特定clever-1表位的人源化抗clever-1抗体，抗体的细节在下面更详细地呈现)处理48小时。通过使用lsrfortessa流式细胞术，在48小时后从cd14阳性细胞测定hla-dr表达。基于对于7-aad细胞活力染料的阳性信号，从分析中去除死细胞。

人igg用作参照。

图1a显示测定来自cd14阳性细胞的hla-dr表达的结果。与人igg的参照相比，cd14阳性细胞上的hla-dr表达随着人源化抗clever-1抗体vh3/vk5的处理而增加。

没有观察到处理之间细胞活力的差异。因此，可以得出结论，clever-1靶向抗体不影响单核细胞存活。

人源化抗clever-1抗体vh3/vk5

使用复合人抗体^tm技术(其更详细地公开于芬兰专利申请fi20165335中)，从3-372小鼠单克隆抗体(在2001年8月21日保藏于dsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh的dsmacc2520)生成人源化抗clever-1抗体vh3/vk5。人源化抗clever-1抗体vh3/vk5识别本申请中定义的人clever-1的表位序列。

实施例2：tnf-α的测量

如实施例1中所述收集和富集来自健康供体的人外周血单核细胞。使来自3ml红细胞裂解缓冲液处理的血液的单核细胞在6孔板上粘附过夜，用pbs洗涤一次，并用10μg/ml抗clever-1抗体3-372或ak-1培养3天。

使用市售的tnf-αelisa试剂盒(invitrogen)从培养基测量可溶性tnf-α。测量的结果显示于图1b中。与未处理的样品或用ak-1处理的对照样品相比，已经通过用抗clever-1抗体处理的样品注意到tnf-α分泌增加。

实施例3：小鼠同系癌症模型

每3-4天用5mg/kg抗clever-1(mstab1)或同种型对照处理建立的e0771小鼠乳腺癌，直至肿瘤达到1mm³的尺寸。使用流式细胞术评价抗clever-1处理对tam、不同单核细胞亚群和肿瘤浸润性白细胞的募集和表型的影响。

图2a显示在施用结合clever-1的抗体后，同系e0771乳腺癌中的tam再极化。与对照处理的肿瘤相比，用抗clever-1处理的肿瘤显示相似水平的tam(cd11b⁺f4/80⁺)。然而，抗clever-1肿瘤中的tam群体由具有ii型标记物cd206的较低表达的更具促炎性的巨噬细胞(ly6c^低mhcii^高)组成。

与igg处理的tam相比，抗clever-1处理的tam分泌显著更多的tnf-α，如图2b中所示。与此一致，还观察到foxp3⁺肿瘤浸润性白细胞的减少。

结果表明，clever-1是巨噬细胞定向免疫疗法的潜在靶标，并且可以通过单核细胞tnf-α分泌来监测抗clever-1治疗的效力。

序列表

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<120>使用clever-1、tnf-α和hla-dr结合剂的免疫活化的诊断

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