多能干细胞的传代方法与流程

本公开涉及一种多能干细胞的传代方法。

背景技术：

作为与多能干细胞的传代方法相关的技术，例如已知有以下技术。例如，国际公开第2013/077423号中记载有将平均直径为约200μm～约300μm的均匀尺寸的多能干细胞的细胞块通过筛网并进行分割的传代方法。并且，国际公开第2013/077423号中记载有将筛网的孔径设为50μm左右，并将分割后的细胞块的直径设为约80μm～约120μm。

并且，国际公开第2014/136581号中记载有将含有通过传代用过滤器部的筛网的多能干细胞的液体流速设为每分钟90ml～300ml。

技术实现要素：

发明要解决的技术课题

例如，为了通过细胞移植来治疗肝病或心脏疾病等，认为一名患者需要1×10⁹个以上的分化细胞的移植。为了实现该需要，开发出大量培养多能干细胞的技术是不可或缺的。

例如，在多能干细胞的培养中，如果通过细胞的培养产生的细胞块(球体)的尺寸过大，则细胞块彼此会粘接融合，从而会产生细胞开始分化或者细胞块中心部分的细胞坏死这样的问题。因此，为了防止细胞块的尺寸变得过大，必需在细胞培养期间中的适当的时期进行分割细胞块的分割处理。

如上述国际公开第2013/077423号和国际公开第2014/136581号中的记载，与基于现有酶处理的传代方法相比，根据将生长到规定尺寸的细胞块通过筛网并进行分割的传代方法，能够实现提高传代后的细胞的生存率。但是，例如当要实现100升规模的大量培养时，如国际公开第2014/136581号中的记载，在将含有通过筛网的多能干细胞的液体的流速设为每分钟90ml～300ml时，处理需要大量时间，很难保持细胞的均质性。另一方面，对于增加和减小含有通过筛网的多能干细胞的液体的流速这两种情况，均需要考虑对多能干细胞损伤。

本公开提供一种适合大量培養的多能干细胞的传代方法。

用于解决技术课题的手段

本公开所涉及的第1方案为多能干细胞的传代方法，其包括如下工序：培养工序，培养多能干细胞来得到细胞块；以及分割工序，将细胞块以15cm/sec以上且150cm/sec以下的速度通过具有每个开口尺寸为30μm以上且80μm以下的多个通孔的筛网状膜，由此分割细胞块。

可以在培养工序中，在含有高分子化合物的培养液中培养多能干细胞。优选在分割工序中，将分割后的细胞块的当量圆直径的平均值设为30μm以上且75μm以下。多能干细胞可以为es细胞或ips细胞。

发明效果

根据本公开的上述方案，能够提供适合大量培養的多能干细胞的传代方法。

附图说明

图1a是表示本公开的例示的实施方式所涉及的分割装置的结构的剖视图。

图1b是表示本公开的例示的实施方式所涉及的筛网的结构的俯视图。

图2a是表示刚分割之后的细胞块的状态的显微镜照片。

图2b是表示分割后经过1小时之后的细胞块的状态的显微镜照片。

图2c是表示分割后经过2小时之后的细胞块的状态的显微镜照片。

图2d是表示分割后经过3小时之后的细胞块的状态的显微镜照片。

图2e是表示分割后经过4小时之后的细胞块的状态的显微镜照片。

图2f是表示分割后经过24小时之后的细胞块的状态的显微镜照片。

图3是表示本公开的例示的实施方式所涉及的细胞培养装置的结构的图。

图4是表示本公开的例示的实施方式所涉及的细胞培养装置实施培养开始处理的情况下的细胞和培养基等的流程的图。

图5是表示本公开的例示的实施方式所涉及的细胞培养装置实施培养基更换处理的情况下的细胞和培养基等的流程的图。

图6是表示本公开的例示的实施方式所涉及的细胞培养装置实施分割处理的情况下的细胞和培养基等的流程的图。

图7是表示本公开的例示的实施方式所涉及的细胞培养装置实施冷冻处理的情况下的细胞和培养基等的流程的图。

图8是表示本公开的例示的实施方式所涉及的细胞培养程序中的处理的流程的流程图。

图9是以通过速度100cm/s通过筛网(4)并传代后的球体像。

图10是以通过速度180cm/s通过筛网(6)并传代后的球体像。

图11是以通过速度15cm/s通过筛网(1)并传代后的球体像。

具体实施方式

以下，参考附图对本公开的例示的实施方式进行说明。另外，对于各附图中相同或等价的构成要件和部分标注相同的参考符号。

本公开的例示的实施方式所涉及的多能干细胞的传代方法包括如下工序：培养工序，培养多能干细胞来得到细胞块；以及分割工序，将细胞块以15cm/sec以上且150cm/sec以下的速度通过具有每个开口尺寸为30μm以上且80μm以下的多个通孔的筛网状膜，由此分割细胞块。

[多能干细胞]

能够适用于本例示的实施方式的多能干细胞只要是具有能够保持未分化状态的同时生长的“自我复制能力”和能够分化为所有三个胚层系列的“多分化能力”的未分化细胞，则并没有特别限制。作为多能干细胞，例如可举出胚胎干细胞(embryonicstemcell；es细胞)、诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell；ips细胞)、胚胎生殖细胞(embryonicgermcell；eg细胞)、胚胎癌细胞(embryonalcarcinomacell；ec细胞)、多能成体祖细胞(multipotentadultprogenitorcell；map细胞)、成体多能干细胞(adultpluripotentstemcell；aps细胞)、muse细胞(多系分化持续应激细胞(multi-lineagedifferentiatingstressenduringcell))等。作为适用于本例示的实施方式的多能干细胞，优选es细胞和ips细胞。

成为多能干细胞的来源的动物并没有特别限制。作为哺乳动物，例如可举出人、猴子、小鼠、大鼠、狗、牛、马、猪等。成为多能干细胞的来源的动物(即供体)优选是与移植其多能干细胞或从其多能干细胞分化诱导的细胞的动物(即受体)相同物种的动物。多能干细胞的建立可以通过公知的任意方法来进行。

关于多能干细胞是否维持未分化状态，可以通过公知的方法确认。例如可举出通过流式细胞术或免疫染色确认未分化标记的表达的方法、通过在免疫缺陷小鼠的皮下进行注射而确认畸胎瘤形成的方法等。

[多能干细胞的培养]

以下，对本公开的例示的实施方式所涉及的培养工序进行说明。在本例示的实施方式中，多能干细胞优选通过悬浮培养而生长。具体而言，在培养容器中，与培养基一同填充多能干细胞而进行悬浮培养，直到多能干细胞的细胞块的当量圆直径的平均值例如成为200μm～300μm。另外，当量圆直径是指将由所提取的细胞块的每条轮廓线划定的区域视作具有相同面积的圆时的圆的直径。通过将细胞块的当量圆直径的平均值设为300μm以下，能够抑制由于形成细胞分泌的细胞因子等的微小环境引起的分化诱导。并且，能够抑制在细胞块的中心部分产生的细胞的坏死，从而抑制生细胞回收率的降低。另一方面，通过将细胞块的当量圆直径的平均值设为200μm以上，能够使细胞的回收率成为一定值以上。另外，在培养工序中得到的细胞块的尺寸通过考虑分化诱导的抑制、细胞的坏死、细胞的回收率等而进行适当变更。

适用于本例示的实施方式的培养基并没有特别限制，可举出在干细胞培养中使用的公知的所有培养基。具体而言，可举出dmem(杜尔贝科改良伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeagle'smedium))、dmem/f-12(杜尔贝科改良伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium):营养混合物(nutrientmixture)f-12)、emem(伊格尔极限必需培养基(eagle'sminimalessentialmedium))、bme(伊格尔基础培养基(basalmediumeagle)、rpmi1640、mcdb104、mcdb153、199、l15、mtesr1、tesr2、e8(natureprotocols7：2029-2040，2012)以及在它们的培养基中添加细胞生长因子而得的培养基等。

可以在培养基中添加通常添加的各种成分，例如青霉素、链霉素等抗生素；抗坏血酸、视黄酸等维生素或维生素衍生物；葡萄糖等糖源；氨基酸；亚硒酸钠、氯化钠等无机盐；转铁蛋白等蛋白质；胰岛素等激素；tgf-β(转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β))、egf(表皮生长因子(epidermalgrowthfactor))等细胞因子：生长因子；分化抑制因子；2-巯基乙醇、二硫苏糖醇等抗氧化剂；等。为了在整个培养期间将浓度保持在期望的范围，可以在培养多能干细胞时在培养基中补充上述成分。从抑制抗原性物质或感染源等混入多能干细胞的观点考虑，优选培养基不含血清及血清替代物。培养基的ph例如为ph7.0～8.0，优选为ph7.3～7.4。

在本例示的实施方式中的培养工序中，优选适当地进行培养基更换。在一系列的培养工序中使用的培养基也可以不是相同的组成。只要能够将多能干细胞维持在未分化状态，则可以一边更换为不同组成的培养基一边继续进行培养。

作为悬浮培养用培养基，为了防止细胞块的移动和细胞块彼此之间的密合，期望培养基具有适当的粘性。在此，适当的粘性是表示不妨碍培养基更换且不发生细胞块彼此的粘接的程度的粘性。

对培养基赋予粘性的方法并没有特别限定，例如能够通过将水溶性高分子以适当的浓度添加到培养基中来实施。作为水溶性高分子，只要是能够对培养基赋予适当的粘性且在能够赋予粘性的浓度范围内不对细胞产生坏影响的(无细胞毒性)水溶性高分子，则也能够使用任何水溶性高分子。例如可举出纤维素、琼脂糖等多糖；甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基乙基纤维素、羟丙基乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、二羟丙基纤维素、羟乙基羟丙基纤维素等多糖醚；聚丙烯酰胺、聚环氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇共聚物、聚乙烯亚胺、聚乙烯基甲基醚、聚乙烯醇、聚丙烯酸、马来酸共聚物等合成高分子；胶原蛋白、明胶、透明质酸、葡聚糖、海藻酸、卡拉胶、淀粉等生物高分子；或者模仿了这些的人工高分子(例如，弹性蛋白样肽等)。这些水溶性高分子可以单独使用，也可以作为几种水溶性高分子的混合物使用。并且，也可以使用这些水溶性高分子的共聚物。优选为甲基纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素或这些的混合物，更优选为甲基纤维素。

例如，当为了赋予粘性而在培养基中添加甲基纤维素时，作为甲基纤维素的浓度，优选高于0.25w/v％且低于0.5w/v％的浓度。优选甲基纤维素的浓度为0.26w/v％～0.3w/v％，尤其优选为0.28w/v％。通过将甲基纤维素的浓度设为上述范围，能够在分割工序中维持对细胞块的分割中使用的筛网状膜的透过性的同时得到增粘作用，防止筛网状膜的局部堵塞，并且抑制速度的变化。其适当的粘性以动态粘度为代表。例如在25℃、剪切速度为100s^-1下的粘度为1.0mpa·s～15mpa·s，进一步优选为1.0mpa·s～7.5mpa·s。即使在使用其他水溶性高分子的情况下，为了得到前述适当的粘性，本领域技术人员也能够适当地选择其他水溶性高分子的浓度。另外，使用粘度测定装置(由antonpaargmbh制造的mcr301，25mm锥板，0.098mm间隙)进行剪切速度为100s^-1下的粘度的评价，并且以间隔设定1设定了评价条件。

还优选在悬浮培养的培养基中均匀地形成不规则的结构体以代替对培养基赋予粘性，并且不会实质上提高培养基的粘度而抑制细胞的沉降。作为能够形成这种结构体的材料，可举出高分子化合物，优选可举出具有阴离子性官能团的高分子化合物。作为阴离子性官能团，可举出羧基、磺基、磷酸基及它们的盐，优选羧基或其盐。作为高分子化合物的优选具体例，并没有特别限制，可举出由10个以上的单糖类(例如，丙糖、四糖、戊糖、己糖、庚糖等)聚合而成的多糖类，更优选可举出具有阴离子性官能团的酸性多糖类。更具体而言，可例示出由如下组中的一种或两种以上构成的高分子化合物，该组中包含透明质酸、结冷胶、脱酰基结冷胶、中性树胶(rhamsangum)、迪优坦胶(diutangum)、黄原胶(xanthangum)、角叉菜胶、黄原胶(xanthangum)、己糖醛酸、岩藻多糖、果胶、果胶酸、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素、肝素、类肝素硫酸盐(heparitinsulfate)、硫酸角质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素(dermatansulfate)、硫酸鼠李聚糖(rhamnansulfate)及它们的盐。多糖类优选为透明质酸、结冷胶、脱酰基结冷胶、迪优坦胶、黄原胶、角叉菜胶或它们的盐，如果考虑能够以低浓度的使用使细胞和细胞块悬浮并且细胞的回收容易度，则最优选为脱酰基结冷胶。

当与液体培养基进行了混合时，脱酰基结冷胶吸收液体培养基中的金属离子(例如，钙离子)，形成经由金属离子的不规则的结构体，并使细胞悬浮。对于含有脱酰基结冷胶而制备的培养基组合物的粘度，在剪切速度为1000s^-1下的粘度为8mpa·s以下，优选为4mpa·s以下，如果考虑细胞的回收容易度，更优选为1.0mpa·s以上且2mpa·s以下。另外，使用粘度测定装置(由antonpaargmbh制造的mcr301，25mm锥板，0.098mm间隙)并且在间隔设定1的评价条件下进行了剪切速度为1000s^-1下的粘度的评价。

关于培养，通过酶处理对已附着培养的多能干细胞进行解离，在培养容器中例如以细胞密度成为约1×10⁵～5×10⁶细胞/ml(优选为，约2×10⁵～2×10⁶细胞/ml)的方式进行接种，并且在浓度约1％～10％(优选为，约2％～5％co2)的环境气体下，以约30℃～40℃(优选为，约37℃)的条件进行1～7天(优选为3～6天，更优选为4～5天)。在培养期间中，优选为每1、2天将培养容器中的培养基更换为新鲜的培养基。

例如，当培养人es细胞时，在约24小时内分裂一次，因此认为如果将悬浮培养开始时的多能干细胞的细胞块的当量圆直径设为约80μm，则通过4、5天的培养，细胞块生长到200μm～300μm。

[多能干细胞的传代]

以下，对进行多能干细胞的传代时实施的本公开的例示的实施方式所涉及的分割工序进行说明。在分割工序中，将在上述培养工序中生长到当量圆直径的平均值成为200μm～300μm的多能干细胞的细胞块分割成更小尺寸的细胞块。

图1a是表示在分割工序中使用的分割装置400的结构的剖视图。分割装置400包含筛网401以及壳体402而构成。

壳体402具有流入口411以及流出口412。筛网401设置在壳体402内部的流入口411与流出口412之间。即，流入口411与流出口412被筛网401隔开。

图1b是表示筛网401的结构的俯视图。筛网401例如将尼龙或聚对苯二甲酸乙二醇酯等合成树脂或者由不锈钢等金属构成的纤维部件编织成格子状而构成。即，筛网401是具有多个通孔420的筛网状膜。如图1b所示，如果以相同的间隔编织构成筛网401的经线和纬线，则通孔420的形状成为正方形。

在分割工序中，使多能干细胞的细胞块与培养基一同从分割装置400的流入口411流入并从流出口412流出。从流入口411流入的多能干细胞的细胞块通过筛网401时被分割成更小尺寸的细胞块。多能干细胞的细胞块通过筛网401的速度设为15cm/sec以上且150cm/sec以下。将多能干细胞的细胞块通过筛网401的速度设为15cm/sec以上，由此能够在分割工序中实现例如还能够适用于100升规模的大量培养的处理能力。例如，将分割装置400的流路中与细胞块的流动方向正交的方向上的截面积设为10cm²时，能够将每1秒的分割处理量设为150cm³以上。例如，即使在进行了100升规模的大量培养时，也能够在10分钟左右完成分割处理，从而能够确保细胞的均质性。并且，将多能干细胞的细胞块通过筛网401的速度设为15cm/sec以上且150cm/sec以下，由此能够抑制由于分割引起的对细胞的损伤。从处理能力以及缓和对细胞的损伤的观点考虑，多能干细胞的细胞块通过筛网401的速度更优选为30cm/sec以上且120cm/sec以下，进一步优选为50cm/sec以上且100cm/sec以下。

筛网401的通孔420的开口尺寸优选设为30μm以上且80μm以下，更优选为40μm以上且70μm以下，典型地为50μm。对于开口尺寸，当通孔420的形状如图1b所示那样为正方形时是指该正方形的边长，当通孔420的形状为圆形时是指该圆的直径。通过将通孔420的开口尺寸设为上述范围，在通过筛网401时能够抑制对细胞块的损伤并且能够有效地进行细胞块的分割。而且，在分割后的细胞块的尺寸中，能够得到后述的优选分布。

分割后的细胞块的当量圆直径的平均值优选30μm以上且75μm以下。在此，如下测量分割后的细胞块的当量圆直径的平均值。用显微镜观察通过筛网401后被分割的细胞块并且例如随机提取300个，测量所提取的细胞块的每个当量圆直径，并计算所测量的当量圆直径的平均值。细胞块的当量圆直径的测量优选在细胞块进行分割之后经过1小时之前完成。

在此，图2a～图2f分别表示刚分割之后，分割后经过1小时之后，分割后经过2小时之后，分割后经过3小时之后，分割后经过4小时之后，分割后经过24小时之后的细胞块的状态的显微镜照片。如图2a和图2b所示，在分割后经过1小时之前的期间，细胞块的状态维持刚分割之后的状态。另一方面，如图2c～图2f所示，如果分割后经过2小时，则随着时间的经过，作为死细胞的单细胞从细胞块的表面脱离，单细胞的数量增加。因此，通过在分割后经过1小时之前完成细胞块的尺寸的测量，能够得到适当的信息作为刚分割之后的细胞块的统计信息。

在本例示的实施方式所涉及的分割工序中分割的细胞块中当量圆直径为30μm以上且小于40μm的细胞块的个数设为x。并且，在本例示的实施方式所涉及的分割工序中分割的细胞块中当量圆直径为40μm以上且小于300μm的细胞块的个数设为y。在该情况下，分割后的细胞块的当量圆直径的分布优选满足下述式(1)。

1＜x/y＜3……(1)

认为当量圆直径为30μm以上且小于40μm的细胞块因分割导致的损伤比较大，但是认为这种损伤比较大的细胞积极地分泌有助于从损伤中恢复的蛋白质。认为该蛋白质不仅有助于自身细胞的损伤恢复，还有助于其他细胞的损伤恢复。另一方面，认为当量圆直径为40μm以上且小于300μm的细胞块因分割导致的损伤比较小，并且认为分割后的生存率比较高。因此，认为通过使分割后的细胞块的当量圆直径的分布满足上述式(1)，能够将传代后(即分割后)的细胞的生长率最大化。

通过将筛网401的通孔420的开口尺寸设为30μm以上且80μm以下，并且将多能干细胞的细胞块通过筛网401的速度设为15cm/sec以上且150cm/sec以下，由此容易将分割后的细胞块的当量圆直径的平均值设为30μm以上且75μm以下，并且控制成在分割后的细胞块的当量圆直径的分布中满足上述式(1)。因此，能够抑制对多能干细胞的损伤的同时有效地分割细胞块，从而适合多能干细胞的大量培养。

以下，对本公开的例示的实施方式所涉及的细胞培养装置进行说明，该细胞培养装置能够在封闭系统中进行在上述本公开的例示的实施方式所涉及的培养工序和分割工序中的各处理。

图3是表示本公开的例示的实施方式所涉及的细胞培养装置10的结构的图。细胞培养装置10具备细胞供给部100、培养基供给部110、稀释液供给部120以及冷冻液供给部130。并且，细胞培养装置10具备培养容器20、储存容器30、分割处理部40、废液回收容器16以及冷冻部17。

细胞培养装置10将从细胞供给部100供给的细胞与从培养基供给部110供给的培养基(培养液)一同收容于培养容器20内，并且在培养容器20内以细胞悬浮于培养基中的状态进行培养。

＜细胞供给部＞

细胞供给部100具有：细胞收容部101，以冷冻状态收容成为由细胞培养装置10进行培养的对象的细胞；以及泵p1，将收容于细胞收容部101的细胞送出到包含配管c1而构成的流路f3。并且，细胞供给部100具有开闭阀v1，该开闭阀v1设置在连接细胞收容部101与配管c1的配管上的泵p1的下游侧。收容于细胞收容部101的细胞通过驱动泵p1并将开闭阀v1设为打开状态而送出到流路f3。

＜培养基供给部＞

培养基供给部110具有：培养基收容部111和114，收容在细胞培养中使用的培养基(培养液)；泵p2和p3，将分别收容于培养基收容部111和114的培养基送出到流路f3；以及过滤器113和116，用于对从泵p2和p3分别送出的培养基进行除菌。并且，培养基供给部110具有：开闭阀v2，设置在连接培养基收容部111与配管c1的配管上的过滤器113的下游侧；以及开闭阀v3，设置在连接培养基收容部114与配管c1的配管上的过滤器116的下游侧。如此，本例示的实施方式所涉及的培养基供给部110具备两个系统的培养基供给功能，能够供给相互不同的两种培养基，该两个系统包括：包含培养基收容部111、泵p2、过滤器113以及开闭阀v2的第1系统和包含培养基收容部114、泵p3、过滤器116以及开闭阀v3的第2系统。另外，培养基供给部110中的系统的数量能够根据细胞的培养方案等而适当地进行增减。即，可以将培养基供给部110设为能够供给三种以上的培养基的结构，也可以设为能够供给一种培养基的结构。收容于培养基收容部111的培养基通过驱动泵p2并将开闭阀v2设为打开状态而送出到流路f3。收容于培养基收容部114的培养基通过驱动泵p3并将开闭阀v3设为打开状态而送出到流路f3。

＜稀释液供给部＞

稀释液供给部120具有：稀释液收容部121，收容在细胞的培养过程中适当地实施的稀释处理中使用的稀释液；泵p4，将收容于稀释液收容部121的稀释液送出到流路f3；以及过滤器123，用于对从泵p4送出的稀释液进行除菌。并且，稀释液供给部120具有开闭阀v4，该开闭阀v4设置在连接稀释液收容部121与配管c1的配管上的过滤器123的下游侧。收容于稀释液收容部121的稀释液通过驱动泵p4并将开闭阀v4设为打开状态而送出到流路f3。

＜冷冻液供给部＞

冷冻液供给部130具有冷冻液收容部131，收容在冷冻部17冷冻保存已培养的细胞时使用的冷冻液；泵p5，将收容于冷冻液收容部131的冷冻液送出到流路f3；以及过滤器133，用于对从泵p5送出的冷冻液进行除菌。并且，冷冻液供给部130包含开闭阀v5，该开闭阀v5配置在连接冷冻液收容部131、泵p5以及过滤器133的配管上的过滤器133的下游侧。收容于冷冻液收容部131的冷冻液通过驱动泵p5并将开闭阀v5设为打开状态而送出到流路f3。另外，在不需要冷冻保存已培养的细胞时，可以在细胞培养装置10中省略冷冻液供给部130。

＜培养容器＞

培养容器20是用于与从培养基供给部110供给的培养基一同收容从细胞供给部100供给的细胞，并对已收容的细胞进行培养的容器。培养容器20的形态并没有特别限定，例如能够使用，玻璃制或不锈钢制的容器或者具有塑料制的袋形态的容器。培养容器20具有：流入口21，用于使细胞和培养基流入到培养容器20内；以及流出口22，用于使收容于培养容器20的细胞和培养基流出到培养容器20的外部。

培养容器20例如收容于培养箱24内，该培养箱24内将温度控制成30℃～40℃(优选为37℃)且将co2浓度控制成2％～10％(优选为5％)并且是封闭的。培养箱24具备气体供给机构25，该气体供给机构25用于在培养容器20内对与培养基一同收容的细胞供给氧(o2)和二氧化碳(co2)。并且，培养箱24具备调整培养容器20内的压力的压力调整机构26。压力调整机构26通过向培养容器20内导入空气而对培养容器20内的环境气体进行加压，或者通过将培养容器20内的环境气体排出到外部而将培养容器20内的环境气体释放到大气中。压力调整机构26通过使培养容器20内的压力高于后述循环流路f1内的压力，从而使收容于培养容器20内的细胞和培养基流出到循环流路f1内。

＜循环流路＞

细胞培养装置10具有包含配管a1～a7而构成的循环流路f1，该配管a1～a7连接培养容器20的流出口22与流入口21。在培养过程中，收容于培养容器20的细胞和培养基在循环流路f1内进行循环。在循环流路f1内流动的细胞和培养基经由流入口21流入到培养容器20内，并且收容于培养容器20的内部的细胞和培养基经由流出口22流出到循环流路f1内。

在构成与培养容器20的流入口21连接的循环流路f1的配管a7上设置有开闭阀v11，在构成与培养容器20的流出口22连接的循环流路f1的配管a1上设置有开闭阀v12。开闭阀v11在细胞和培养基从循环流路f1流入到培养容器20内的情况下设为打开状态，在除此以外的情况下设为关闭状态。开闭阀v12在细胞和培养基从培养容器20内流出到循环流路f1内的情况下设为打开状态，在除此以外的情况下设为关闭状态。

由与细胞供给部100、培养基供给部110、稀释液供给部120以及冷冻液供给部130连接的配管c1构成的流路f3在连接部位x3上与循环流路f1连接。即，收容于细胞收容部101的细胞、分别收容于培养基收容部111和114的培养基、收容于稀释液收容部121的稀释液以及收容于冷冻液收容部131的冷冻液经由流路f3和连接部位x3供给到循环流路f1内。

在构成流路f3的配管c1上的连接部位x3的附近设置有开闭阀v6。开闭阀v6在从细胞供给部100、培养基供给部110、稀释液供给部120以及冷冻液供给部130分别将细胞、培养基、稀释液和冷冻液供给到循环流路f1内的情况下设为打开状态，在除此以外的情况下设为关闭状态。

＜储存容器＞

储存容器30设置在循环流路f1内即循环流路f1的中途。储存容器30是用于暂时储存在循环流路f1内流动的细胞、培养基、稀释液和冷冻液的容器，并且用于在培养期间中实施的后述培养开始处理、培养基更换处理、分割处理以及冷冻处理中。储存容器30的形态并没有特别限定，例如，能够使用玻璃制或不锈钢制的容器、具有塑料制的袋形态的容器。

储存容器30具有：流入口31，用于使在循环流路f1内流动的细胞、培养基、稀释液和冷冻液流入到储存容器30内；以及流出口32，用于使收容于储存容器30的细胞、培养基、稀释液和冷冻液流出到循环流路f1内。储存容器30的流入口31通过构成循环流路f1的配管a1、a2和a3与培养容器20的流出口22连接。储存容器30的流出口32通过构成循环流路f1的配管a4、a5、a6和a7与培养容器20的流入口21连接。并且，在本例示的实施方式中，连接循环流路f1与流路f3的连接部位x3配置在储存容器30的流入口31的附近，但循环流路f1与流路f3的连接位置能够配置在循环流路f1内的所有位置上。

在构成循环流路f1的配管a2上的储存容器30的流入口31的附近设置有开闭阀v13。开闭阀v13在细胞和培养基等从循环流路f1流入到储存容器30内的情况下设为打开状态，在除此以外的情况下设为关闭状态。并且，在构成循环流路f1的配管a5上的储存容器30的流出口32的附近设置有开闭阀v14。开闭阀v14在从储存容器30内向循环流路f1内将细胞和培养基等传送到培养容器20、分割处理部40以及冷冻部17的情况下设为打开状态，在除此以外的情况下设为关闭状态。

储存容器30具备调整储存容器30内的压力的压力调整机构33。压力调整机构33通过向储存容器30内导入空气而对储存容器30内的环境气体进行加压，或者通过将储存容器30内的环境气体排出到外部而将储存容器30内的环境气体释放到大气中。压力调整机构33通过使储存容器30内的压力高于循环流路f1内的压力，从而使储存于储存容器30内的细胞、培养基、稀释液和冷冻液从流出口32流出到循环流路f1内。

细胞培养装置10具有包含配管b1和b2而构成的流路f2，该配管b1和b2连接在循环流路f1内位于储存容器30的流出口32与培养容器20的流入口21之间的连接部位x1和在循环流路f1内位于储存容器30的流入口31与培养容器20的流出口22之间的连接部位x2。在循环流路f1内流动的细胞和培养基等能够经由连接部位x1流入到流路f2内。并且，在流路f2内流动的细胞和培养基等能够经由连接部位x2流入到循环流路f1内。

＜分割处理部＞

分割处理部40设置在流路f2内即流路f2的中途。分割处理部40在培养容器20内具备图1a所示的上述分割装置400。分割处理部40在分割装置400中分割从循环流路f1经由连接部位x1流入到流路f2内的细胞块。已实施分割处理的细胞经由连接部位x2流出到循环流路f1内。

分割处理部40具备与分割装置400的流入口411(参考图1a)连接的液体输送部450。液体输送部450具有用于将含有细胞块的培养基送出到分割装置400的液体输送机构。液体输送部450可以具有通过活塞推出收容于筒状容器内的液体的所谓注射泵的形态。通过液体输送部450控制多能干细胞的细胞块通过分割装置400的筛网401的速度。液体输送部450以多能干细胞的细胞块通过分割装置400的筛网401的速度为15cm/sec以上且150cm/sec以下的范围内的恒定速度进行液体输送。

在构成流路f2且配置于分割处理部40的上游侧的配管b1上的连接部位x1的附近设置有开闭阀v21。开闭阀v21在细胞等从储存容器30传送到分割处理部40的情况下设为打开状态，在除此以外的情况下设为关闭状态。另一方面，在构成流路f2且配置于分割处理部40的下游侧的配管b2上的连接部位x2的附近设置有开闭阀v22。开闭阀v22在通过分割处理部40实施了分割处理的细胞流出到循环流路f1内的情况下设为打开状态，在除此以外的情况下设为关闭状态。

在构成循环流路f1的配管a1上的连接部位x2的附近且连接部位x2的上游侧设置有开闭阀v15。开闭阀v15在细胞和培养基等从培养容器20传送到储存容器30的情况下设为打开状态，在除此以外的情况下设为关闭状态。

＜废液回收容器＞

细胞培养装置10具有包含配管d1而构成的流路f4，该配管d1在循环流路f1内的位于储存容器30的流出口32与培养容器20的流入口21之间且比连接部位x1更靠上游侧(更靠近储存容器30)的连接部位x4上与循环流路f1连接。在流路f4的端部设置有废液回收容器16。废液回收容器16是用于回收从循环流路f1经由连接部位x4流入到流路f4内的废液的容器。回收到废液回收容器16的废液中包含使用过的培养基、使用过的稀释液、伴随从细胞供给部100以冷冻状态供给的细胞的冷冻液等。废液回收容器16的形态并没有特别限定，例如，能够使用玻璃制或不锈钢制的容器、具有塑料制的袋形态的容器。

在构成流路f4的配管d1上的连接部位x4的附近设置有开闭阀v31。开闭阀v31在将从储存容器30流出的废液回收到废液回收容器16内的情况下设为打开状态，在除此以外的情况下设为关闭状态。

＜冷冻部＞

细胞培养装置10具有包含配管e1而构成的流路f5，该配管e1在连接部位x1上与循环流路f1连接。在流路f5的端部设置有冷冻部17。冷冻部17具有保存容器17a，该保存容器17a与从冷冻液供给部130供给的冷冻液一同收容从循环流路f1经由连接部位x1流入到流路f5内的细胞。保存容器17a例如也可以具有小瓶、冷冻管或袋的形态。冷冻部17可以包含收容于保存容器17a的细胞和将冷冻液冷冻的冷冻器而构成。并且，冷冻部17可具备填充有液氮的罐，也可以构成为能够在罐内收容保存容器17a。并且，冷冻部17例如也可以包含由taiyonipponsansocorporation制造的cryolibrary(注册商标)系统而构成。在构成流路f5的配管e1上的连接部位x1的附近设置有开闭阀v41。开闭阀v41在从储存容器30向冷冻部17传送细胞和冷冻液的情况下设为打开状态，在除此以外的情况下设为关闭状态。另外，流路f5与循环流路f1的连接位置只要在储存容器30的流出口32与培养容器20的流入口21之间，则可以位于任何位置。并且，当不需要冷冻保存细胞时，能够省略冷冻部17。

＜控制部＞

控制部18综合控制泵p1～p5、开闭阀v1～v5、v11～v16、v21、v22、v31和v41、气体供给机构25、压力调整机构26、33和43的动作。由此，根据规定的细胞培养方案进行的细胞的培养在没有人为干预的情况下自动地实施。另外，图3中，从避免附图的复杂化的观点考虑，省略了控制部18与由控制部18控制的上述各构成要件之间的电连接配线的图示。

以下，示出在本例示的实施方式所涉及的细胞培养装置10中能够实施的处理的一例。细胞培养装置10例如实施以下例示的培养开始处理、培养基更换处理、分割处理以及冷冻处理。另外，以下说明的培养开始处理、培养基更换处理、分割处理以及冷冻处理通过由控制部18控制开闭阀v1～v5、v11～v16、v21、v22、v31和v41、泵p1～p5、压力调整机构26、33和43的动作来实现。

＜培养开始处理＞

细胞培养装置10如下实施培养开始处理，该培养开始处理是，将收容于细胞收容部101的细胞与收容于培养基收容部111和114的培养基一同收容到培养容器20内并开始进行细胞培养。图4是表示细胞培养装置10实施培养开始处理时的细胞和培养基等的流程的图。另外，图4中示出细胞和培养基等的流程与以下所示的各处理步骤之间的对应关系。

在步骤s1中，开闭阀v1、v4和v6设为打开状态，并驱动泵p1和p4。由此，在细胞收容部101以冷冻状态收容的细胞和收容于稀释液收容部121的稀释液经由流路f3和循环流路f1流入到储存容器30内。

在步骤s2中，从含有储存于储存容器30内的细胞、随伴细胞的冷冻液以及稀释液的混合物中去除冷冻液和稀释液而实施浓缩处理。上述浓缩处理例如通过使与稀释液一同收容于储存容器30内的细胞在储存容器30内沉降(自然沉降)，并去除含有稀释液和冷冻液的上清液来进行。具体而言，使细胞在储存容器30内沉降之后，将开闭阀v14短暂地设为打开状态。由此，上清液残留在储存容器30内，并且细胞从储存容器30流出并滞留在配管a5内。之后，将开闭阀v14设为关闭状态，将开闭阀v31设为打开状态。由此残留在储存容器30内且含有稀释液和冷冻液的废液从储存容器30的流出口32流出并经由流路f4回收到废液回收容器16。另外，通过压力调整机构33对储存容器30内的环境气体进行加压，由此进行细胞从储存容器30到配管a5的传送和稀释液和冷冻液从储存容器30到废液回收容器16的传送。

在步骤s3中，开闭阀v2、v3和v6设为打开状态，并驱动泵p2和p3。由此，收容于培养基收容部111和114的培养基a和培养基b经由流路f3和循环流路f1流入到储存容器30内。之后，开闭阀v14设为打开状态，由培养基a和培养基b组成的混合培养基从储存容器30流出并与滞留在配管a5内的细胞合流。

在步骤s4中，开闭阀v14、v16和v21设为打开状态。并且，通过压力调整机构33对储存容器30内的环境气体进行加压。由此，滞留在配管a5内的细胞和培养基经由连接部位x1流入到流路f2内，从而流入到分割处理部40内。流入到分割处理部40内的细胞在分割装置400内实施分割处理。另外，此处的分割处理是出于破碎设为冷冻状态的细胞的目的而进行的。

在步骤s5中，开闭阀v22和v13设为打开状态，已实施分割处理的细胞与培养基一同经由连接部位x2流出到循环流路f1内，并传送到储存容器30内。

在步骤s6中，开闭阀v14、v16和v11设为打开状态。并且，通过压力调整机构33对储存容器30内的环境气体进行加压。由此，储存于储存容器30内的细胞和培养基经由循环流路f1流入到培养容器20内。经过以上步骤s1～s6的处理，完成培养开始处理。另外，在上述例子中，在分割处理前实施了浓缩处理和新培养基的供给，但也可以在分割处理后实施浓缩处理和新培养基的供给。

＜培养基更换处理＞

在细胞培养中，培养基因从细胞分泌的代谢物等而发生变质。因此，需要在培养期间内的适当的时期进行将培养容器20内的使用过的培养基更换为新培养基的培养基更换处理。本例示的实施方式所涉及的细胞培养装置10如下实施上述培养基更换处理。图5是表示细胞培养装置10实施培养基更换处理时的细胞和培养基等的流程的图。另外，图5中示出细胞和培养基等的流程与以下所示的各处理步骤之间的对应关系。

在步骤s11中，开闭阀v12、v15和v13设为打开状态。并且，通过压力调整机构26对培养容器20内的环境气体进行加压。由此，收容于培养容器20内的细胞和使用过的培养基流出到循环流路f1内，并传送到储存容器30内。

在步骤s12中，从含有储存于储存容器30内的细胞和使用过的培养基的混合物中去除使用过的培养基而实施浓缩处理。浓缩处理以与上述培养开始处理的步骤s2中的处理相同的步骤进行。通过浓缩处理，使用过的培养基回收到废液回收容器16内，并且细胞滞留在配管a5内。另外，为了促进细胞的沉降，也可以将稀释液导入到储存容器30内。

在步骤s13中，开闭阀v2、v3和v6设为打开状态，并驱动泵p2和p3。由此，收容于培养基收容部111和114的新培养基a以及新培养基b经由流路f3和循环流路f1流入到储存容器30内。之后，开闭阀v14设为打开状态，含有培养基a和培养基b的新培养基从储存容器30流出并与滞留在配管a5内的细胞合流。

在步骤s14中，开闭阀v14、v16和v11设为打开状态。并且，通过压力调整机构33对储存容器30内的环境气体进行加压。由此，滞留在配管a5内的细胞和新培养基流入到培养容器20内。通过新培养基培养收容于培养容器20内的细胞。经过以上步骤s11～s14的处理，完成培养基更换处理。

＜分割处理＞

在多能干细胞的培养中，如果通过细胞的培养产生的细胞块(球体)的尺寸过大，则细胞块彼此粘接融合，可能会产生细胞开始分化或者细胞块的中心部分的细胞坏死这样的问题。因此，为了防止细胞块的尺寸过大，有时需要在培养期间中的适当的时期进行分割细胞块的分割处理。本例示的实施方式所涉及的细胞培养装置10如下实施上述分割处理。图6是表示细胞培养装置10实施分割处理时的细胞和培养基等的流程的图。另外，图6中示出细胞和培养基等的流程与以下所示的各处理步骤之间的对应关系。

在步骤s21中，开闭阀v12、v15和v13设为打开状态。并且，通过压力调整机构26对培养容器20内的环境气体进行加压，在培养容器20内产生的细胞块和使用过的培养基流出到循环流路f1内，并传送到储存容器30内。

在步骤s22中，从含有储存于储存容器30内的细胞块和使用过的培养基的混合物中去除使用过的培养基而实施浓缩处理。浓缩处理以与上述培养开始处理的步骤s2中的处理相同的步骤进行。通过浓缩处理，使用过的培养基回收到废液回收容器16内，并且细胞块滞留在配管a5内。另外，为了促进细胞的沉降，也可以将稀释液导入到储存容器30内。

在步骤s23中，开闭阀v2、v3和v6设为打开状态，并驱动泵p2和p3。由此，收容于培养基收容部111和114的新培养基a以及新培养基b经由流路f3和循环流路f1流入到储存容器30内。之后，开闭阀v14设为打开状态，含有培养基a和培养基b的新培养基从储存容器30流出并与滞留在配管a5内的细胞块合流。

在步骤s24中，开闭阀v14、v16以及v21设为打开状态。并且，通过压力调整机构33对储存容器30内的环境气体进行加压。由此，滞留在配管a5内的细胞块和培养基经由连接部位x1流入到流路f2内，从而流入到分割处理部40内。通过分割装置400分割流入到分割处理部40内的细胞。通过液体输送部450控制多能干细胞的细胞块通过分割装置400的筛网401的速度。液体输送部450以多能干细胞的细胞块通过分割装置400的筛网401的速度为15cm/sec以上且150cm/sec以下的范围内的恒定速度进行液体输送。

在步骤s25中，开闭阀v22和v13设为打开状态，已实施分割处理的细胞与培养基一同经由连接部位x2流出到循环流路f1内，并传送到储存容器30内。

在步骤s26中，开闭阀v14、v16和v11设为打开状态。并且，通过压力调整机构33对储存容器30内的环境气体进行加压。由此，储存于储存容器30内的已实施分割处理的细胞和新培养基流入到培养容器20内。在培养容器20内继续培养已实施分割处理的细胞。经过以上步骤s21～s26的处理，完成分割处理。即，完成细胞的传代。

另外，在上述例子中，在分割处理前实施了浓缩处理和新培养基的供给，但也可以在分割处理后实施浓缩处理和新培养基的供给。

＜冷冻处理＞

当回收并保存已培养的细胞时，通常将细胞回收到保存容器内并进行冷冻保存。本例示的实施方式所涉及的细胞培养装置10如下实施回收并冷冻已培养的细胞的冷冻处理。图7是表示细胞培养装置10实施冷冻处理时的细胞和培养基等的流程的图。另外，图7中示出细胞和培养基等的流程与以下所示的各处理步骤之间的对应关系。

在步骤s41中，开闭阀v12、v15和v13设为打开状态。并且，通过压力调整机构26对培养容器20内的环境气体进行加压。由此，收容于培养容器20内的细胞和使用过的培养基流出到循环流路f1内，并传送到储存容器30内。

在步骤s42中，从含有储存于储存容器30内的细胞和使用过的培养基的混合物中去除使用过的培养基而实施浓缩处理。浓缩处理以与上述培养开始处理的步骤s2中的处理相同的步骤进行。通过浓缩处理，使用过的培养基回收到废液回收容器16内，并且细胞滞留在配管a5内。另外，为了促进细胞的沉降，也可以将稀释液导入到储存容器30内。

在步骤s43中，开闭阀v5和v6设为打开状态，并驱动泵p5。由此，收容于冷冻液收容部131的冷冻液经由流路f3和循环流路f1流入到储存容器30内。之后，开闭阀v14设为打开状态，冷冻液从储存容器30流出，并与滞留在配管a5内的细胞合流。

在步骤s44中，开闭阀v14、v16和v41设为打开状态。并且，通过压力调整机构33对储存容器30内的环境气体进行加压。由此，滞留在配管a5内的细胞和冷冻液经由流路f5收容到冷冻部17的保存容器17a内。冷冻部17将收容到保存容器17a内的细胞与冷冻液一同进行冷冻。经过以上步骤s41～s44的处理，完成冷冻处理。

另外，作为冷冻保存细胞的方法，例如可适用日本专利第4705473号中记载的方法。该方法中包含如下工序，即，在含有规定量的二甲基亚砜(dmso)、丙二醇、乙酰胺以及培养基的介质中急速冷冻细胞的工序。并且，也可以适用日本专利第4223961号中记载的方法。该方法是利用了冷冻保存液的细胞的冷冻保存方法，该冷冻保存液含有选自由规定浓度的二甲基亚砜、丙三醇、乙二醇、丙二醇以及聚乙烯吡咯烷酮组成的组中的至少一个作为冷冻保护剂，该方法包括如下工序：使细胞悬浮于冷冻保存液的工序；以规定的冷却速度将冷冻保存液冷却至-80℃以下并使其冷冻的冷却工序；以及在-80℃以下保存冷冻保存液的保存工序。

另外，在上述培养开始处理、培养基更换处理以及分割处理中例示了从培养基供给部110供给两种培养基a和培养基b的情况，但所使用的培养基的种类能够根据细胞的培养方案进行适当变更。即，所使用的培养基根据培养方案可以是一种，也可以是三种以上。

＜细胞培养处理＞

细胞培养装置10通过由控制部18执行以下例示的细胞培养处理程序，能够在没有人为干预的情况下自动地进行细胞培养。图8是表示由控制部18执行的细胞培养程序中的处理的流程的流程图。

在步骤s101中，控制部18通过执行上述培养开始处理，将从细胞供给部100供给的细胞和从培养基供给部110供给的培养基收容到培养容器20内，并开始进行细胞培养。

在步骤s102中，控制部18通过从开始进行细胞培养并经过规定期间后，实施上述培养基更换处理(第1次)，将培养容器20内的使用过的培养基更换为收容于培养基收容部111和114的新培养基，并继续进行细胞培养。

在步骤s103中，控制部18通过从实施第1次培养基更换处理并经过规定期间后，实施上述培养基更换处理(第2次)，将培养容器20内的使用过的培养基更换为收容到培养基收容部111和114内的新培养基，并继续进行细胞培养。

在步骤s104中，控制部18通过从实施第2次培养基更换处理并经过规定期间后，实施上述分割处理，对细胞块进行分割并继续进行细胞培养。

在步骤s105中，控制部18判定将上述步骤s102～s104中的处理设为1个周期的培养周期的周期数是否达到规定数。控制部18在判定为培养周期的周期数没有达到规定数时，使处理返回步骤s102。另一方面，控制部18在判定为培养周期的周期数达到规定的周期数时，使处理进入步骤s106。随着培养周期的进行，细胞的培养规模增大。

在步骤s106中，控制部18通过实施上述冷冻处理，将已培养的细胞收容到冷冻部17的保存容器17a内并进行冷冻保存。

另外，在上述例子中，在培养周期的1个周期内实施了两次培养基更换处理，但培养周期的1个周期内的培养基更换处理的实施次数能够进行适当变更。

如上所述，本例示的实施方式所涉及的细胞培养装置10具有连接培养容器20的流入口21与流出口22的循环流路f1。并且，细胞培养装置10具有设置在循环流路f1内的储存容器30。储存容器30具有与培养容器20的流出口22连接的流入口31以及与培养容器20的流入口21连接的流出口32。储存容器30用于在上述培养开始处理、培养基更换处理、分割处理以及冷冻处理中实施的浓缩处理等。并且，细胞培养装置10具有流路f2，该流路f2连接位于储存容器30的流出口32与培养容器20的流入口21之间的循环流路f1内的连接部位x1和位于储存容器30的流入口31与培养容器20的流出口22之间的循环流路f1内的连接部位x2。细胞培养装置10具有分割处理部40，该分割处理部40设置在流路f2内，并对经由连接部位x1从循环流路f1流入的细胞块进行分割，并且将已分割的细胞块经由连接部位x2流出到循环流路f1内。并且，细胞培养装置10具有向循环流路f1内供给培养基的培养基供给部110。

通过如上述那样构成细胞培养装置10，能够在封闭系统中连续地实施在培养基更换处理或分割处理等细胞培养中需要的一系列处理。由此，能够大量生产均质的细胞。根据本例示的实施方式所涉及的细胞培养装置10，能够在没有人为干预的情况下进行从培养开始处理到冷冻处理的细胞培养中需要的一系列处理。

另外，本例示的实施方式所涉及的细胞培养装置10中例示了通过由控制部18控制开闭阀v1～v5、v11～v16、v21、v22、v31和v41、泵p1～p5、压力调整机构26、33和43的动作，从而使从培养开始处理到冷冻处理自动化的情况，但并不限定于该方案。也可以由用户手动操作开闭阀v1～v5、v11～v16、v21、v22、v31和v41、泵p1～p5、压力调整机构26、33和43。

实施例

以下，通过实施例对发明的例示实施方式进行详细说明，但发明的例示实施方式并不限定于实施例。

下述中，关于物质浓度，“m”表示摩尔浓度，1m＝1mol/l。

下述中，“pbs”是指磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline)，“imdm”是指伊思考夫改良杜尔贝可培养基(iscove'smodifieddulbecco'smedium)。

下述中，“球体”是指球状细胞块。

＜材料＞

[人诱导多能干细胞株(hips细胞株)]

·253g1。由ipsportal，inc(creationcorekyotomiguruma，448-5kajiicho，kawaramachiimadegawasagaru，kamigyoku，kyoto)出售。

[基本培养基以及培养基添加剂]

·tesr-e8，stemcelltechnologies公司的型号st-05940。

·3％甲基纤维素溶液(imdm中。甲基纤维素浓度为w/v％)，r&dsystems公司的型号hsc001。

·10mmy-27632液。将y-27632(rock抑制剂，sigma-aldrich的型号y0503)溶解于dulbeccopbs(不含ca、mg)中而得的溶液。

[培养基]

·培养基1：向450mltesr-e8中加入50ml3％甲基纤维素溶液并充分进行搅拌，加入10mmy-27632溶液以使y-27632的最终浓度成为10μm，从而制备了培养基1。

·培养基2：向450mltesr-e8中加入50ml3％甲基纤维素溶液并充分进行搅拌，从而制备了培养基2。

[培养皿以及离心管]

·超低吸附培养皿(ultra-lowattachmentplate)，corning公司的型号costar3471。6孔，带盖。

·15ml离心管，thermoscientific公司的型号339650。

·50ml离心管，thermoscientific公司的型号339652。

[传代用筛网]

·筛网(1)：sysmexcorporation的parteccelltrics型号06-04-004-2325。

·筛网(2)：sysmexcorporation的parteccelltrics型号06-04-004-2326。

·筛网(3)：nipponbectondickinsoncompany，ltd.的细胞过滤网型号352340。

·筛网(4)：sysmexcorporation的parteccelltrics型号06-04-004-2327。

·筛网(5)：nipponbectondickinsoncompany，ltd.的细胞过滤网型号352350。

·筛网(6)：nipponbectondickinsoncompany，ltd.的细胞过滤网型号352360。

利用相位差显微镜(olympuscorporation的ix73)以20倍的倍率观察筛网(1)～(6)，测量开口的两个边并通过它们的平均值求出筛网的开口尺寸。筛网的开口尺寸如下。

·筛网(1)：开口尺寸为25.7μm

·筛网(2)：开口尺寸为35.9μm

·筛网(3)：开口尺寸为40.5μm

·筛网(4)：开口尺寸为43.3μm

·筛网(5)：开口尺寸为73.1μm

·筛网(6)：开口尺寸为100.1μm

所有传代用筛网均用高压灭菌器进行灭菌处理并提供到传代操作。

＜实施例：hips细胞的培养和传代＞

[hips细胞的培养]

使用6孔培养皿和培养基2，在培养箱中，在37℃、5％co2的条件下一边更换培养基一边对hips细胞株253g1进行了5天的悬浮培养，从而形成球体。

[hips细胞的传代]

在进行5天的悬浮培养后，从培养箱取出6孔培养皿，以绘制圆的方式使孔移动，将球体集中到孔的中央部，并使每个培养基移动到15ml离心管中。将3ml预先加热至37℃的tesr-e8加入到孔中，收集残留在孔中的球体，进而移动到15ml离心管中。

对15ml离心管进行离心处理(50rpm，2分钟分钟)并去除上清液之后，加入预先加热至37℃的培养基1，并使球体再悬浮于培养基1中。将球体悬浮液移动到加入有培养基1(液温37℃)的另一15ml离心管中，从而制备了细胞浓度为5×10⁵/ml的球体悬浮液。

将注射器(terumocorporation的型号ss50-lz)的口部与硅管的一端经由luer锁紧接口类型的管接头连接，并将硅管的另一端与吸移管(greinerbio-one公司的型号607160，前端内径1.5mm)经由管接头连接。将球体悬浮液移动到注射器中，并将注射器装填到注射泵(harvard公司的型号phd-2000)中。

在15ml离心管或50ml离心管的口部分别安装了筛网(1)～(6)。将与收容有球体悬浮液的注射器连接的吸移管的前端按压到筛网上，使注射泵工作以挤出球体悬浮液，使球体悬浮液通过筛网并对球体进行了分割。利用注射泵进行流量控制，由此改变球体悬浮液在筛网通过速度。

[传代后的培养]

将通过了筛网后的球体悬浮液接种于6孔培养皿中，并在培养箱中，在37℃、5％co2的条件下进行了培养。

在传代后第一天培养(即，从通过筛网并经过24小时后)中，从培养箱取出6孔培养皿，以绘制圆的方式使孔移动，将球体集中到孔的中央部并使其移动到15ml离心管中。将3ml预先加热至37℃的tesr-e8加入到孔中，收集残留在孔中的球体，进而移动到15ml离心管中。

对15ml离心管进行离心处理(50rpm，2分钟分钟)并去除上清液之后，加入与更换前的培养基等量的预先加热至37℃的培养基2并使球体再悬浮，从而进行了培养基更换。使球体悬浮液返回孔中，并在培养箱中，在37℃、5％co2的条件下继续了培养。

在传代后的第3天培养(即，从通过筛网并经过72小时后)中实施与上述相同的操作，从而进行了培养基更换。

＜传代的评价＞

[传代前的球体的大小]

在上述[hips细胞的传代]中将用于传代而制备的球体悬浮液的一部分返回孔中，并在平面上使孔纵向和横向移动，从而将球体在孔内均匀地分散。用相位差显微镜(olympuscorporation的ix73)观察孔内的球体，并以10倍的倍率拍摄了显微镜图像。对随机选择的300个球体像进行分析，根据各球体像的面积求出当量圆直径，从而求出300个的平均。当量圆直径的平均为263.4μm。

[传代后的球体的大小和形状]

在传代1小时后(即，从通过筛网并经过1小时后)，从培养箱取出6孔培养皿，并在平面上使孔纵向和横向移动，从而将球体在孔内均匀地分散。用相位差显微镜(olympuscorporation的ix73)观察孔内的球体，并以10倍的倍率拍摄了显微镜图像。对随机选择的300个球体像进行分析，根据各球体像的面积求出当量圆直径，从而求出300个的平均。并且，如下述那样根据当量圆直径对球体进行分类，并求出x与y之比“x/y”。

x：当量圆直径为30μm以上且小于40μm的球体的个数。

y：当量圆直径为40μm以上且小于300μm的球体的个数。

根据球体的显微镜图像，对球体形状进行了如下分类。

分类a：球体轮廓清晰，轮廓平滑，球体为球形。

分类d：球体轮廓不清晰，轮廓存在凹凸，球体为不规则的形状。

分类e：由于传代而球体被过度分割，球体的大小减小到不适当的大小。

图9是以速度100cm/s通过筛网(4)并传代后的球体像，是球体形状的分类a的典型例。

图10是以速度180cm/s通过筛网(6)并传代后的球体像，是球体形状的分类d的典型例。

图11是以速度15cm/s通过筛网(1)并传代后的球体像，是球体形状的分类e的典型例。

[传代时的细胞回收率，传代5天后的细胞生长率]

在刚开始进行传代操作之前，在传代1小时后(即，从通过筛网并经过1小时后)，以及在传代后的第5天培养(即，从通过筛网并经过120时间后)中，从培养箱取出6孔培养皿，并在平面上使孔纵向和横向移动，从而将球体在孔内均匀地分散。将球形分散液300μl置于1ml管中，加入700μl的tesr-e8进行离心处理(4000rpm，3分钟)并去除了上清液。接着，添加300μl的trypleselect(胰蛋白酶样酶，gibco公司的型号12563)，并用旋涡混合器进行搅拌，在37℃下静置3分钟之后再次用旋涡混合器进行搅拌，从而得到细胞悬液。针对细胞悬液，通过细胞计数装置(chemometec公司的nc-200)对细胞数进行测定，通过下述式(2)计算出细胞回收率，并通过下述式(3)计算出传代5天后的细胞生长率。

式(2)：传代时的细胞回收率＝传代1小时后的细胞数÷传代前的细胞数

式(3)：传代5天后的细胞生长率＝传代5天后的细胞数÷传代1小时后的细胞数

[综合判定]

分类g1：x/y超过1且小于3，球体形状为分类a，传代时的细胞回收率为0.40以上，传代5天后的细胞生长率为3.0以上。

分类g2：x/y超过3，除此以外，与分类g1相同。

分类ng：不适合分类g1和分类g2。

[表1]

[表2]

[表3]

[表4]

[表5]

[表6]

如表1～表6所示，将多能干细胞球以通过速度为15cm/s～150cm/s的范围通过开口尺寸为30μm～80μm的范围的筛网，由此能够抑制对多能干细胞的损伤的同时有效地分割细胞块。即，可以说本公开例示的实施方式所涉及的多能干细胞的传代方法是适合大量培養的传代方法。

对于日本申请2016-093300的公开，其全部内容通过参考收入本说明中。

本说明书中记载的所有文献、专利申请以及技术标准，以与具体且个别记载了通过参考收入个别文献、专利申请以及技术标准的情况相同程度地，通过参考收入本说明书中。