新细菌物种的制作方法

本发明涉及预防和/或治疗代谢紊乱，例如与超重和肥胖症，如2型糖尿病和高胆固醇相关的代谢紊乱。本发明还涉及调节和/或促进肠黏膜免疫系统功能和/或维持和/或恢复和/或增加哺乳动物如人或宠物或生产动物中肠黏膜屏障的物理完整性的方法。

背景技术：

肥胖症主要是由在不利的遗传背景下有害的营养习惯和运动习惯导致的结果。它具有严重的健康后果，包括增加2型糖尿病、心血管疾病、肺动脉高压、睡眠呼吸暂停和许多癌症的风险，并且与死亡风险增加密切相关。

人体肠道含有多种微生物，其中最主要和多样化的是细菌。总体而言，微生物组比人类基因组大100多倍。因此，肠道微生物群可被视为有助于整体新陈代谢并在将食物转化为营养和能量方面发挥作用的“外置器官”。群落中至少10¹⁴的细菌以厌氧细菌为主，并且由数千种细菌构成，现在已培养出其中的1000种细菌(rajilicstojanovic和devos,2014,femsmicrobiolrev38:996-1047)。

越来越多的证据表明肠道微生物群在宿主新陈代谢中的作用。目前认为，肠道细菌的稳态取决于宿主特征(年龄、性别、遗传背景等)、环境条件(压力、药物、胃肠手术等)以及饮食。

当用益生元治疗时，具有饮食诱导的肥胖症且患有糖尿病的小鼠表现出改善的葡萄糖和脂质代谢、降低的血浆lps和改善的肠道屏障功能(例如，炎症减轻)、增加的肠内分泌l细胞数量、以及改善的瘦素敏感性和葡萄糖稳态(everard等人,diabetes,2011,第60卷(11):2775-2786)。益生元治疗明显改变了这些小鼠的肠道微生物群组成，其中嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)的丰度大量增加。

据发现，向喂以对照饮食或高脂肪(hf)饮食的小鼠经口施用嗜黏蛋白阿克曼氏菌，在不改变食物摄入的情况下使饮食诱导的代谢性内毒素血症、肥胖症和脂肪组织cd11c标志物正常化(wo2014/075745)。此外，嗜黏蛋白阿克曼氏菌治疗减轻了体重并改善了身体组成(即脂肪/瘦体质量比)。据发现，在高脂肪饮食下，嗜黏蛋白阿克曼氏菌处理增加了脂肪细胞分化和脂质氧化的标志物的mrna表达，而不影响脂肪生成。还发现嗜黏蛋白阿克曼氏菌定殖完全逆转饮食诱导的空腹高血糖症，并且治疗后胰岛素抵抗指标同样地降低。最后，已发现嗜黏蛋白阿克曼氏菌增加肠道屏障功能(jreunanen等人2015,applenvironmicrobiol.81:3655-3662)。正是这种肠道屏障保护我们免受病原体和有害肠道成分的侵害，而受损的屏障功能与各种疾病和病症相关，包括ibs、ibd和其它与肠道健康有关的疾病和病症。最近，肠道屏障被定义为使肠腔与内部宿主分开的功能实体，并且由机械、体液、免疫、肌肉和神经元件组成(scbishoff等人,2014,bmcgastroenterol.14:189)。因此，改善肠道渗透性可被定义为肠道屏障的可测量特征，它是影响肠道健康的重要因素。

为了在肠道中起作用，益生菌应该在肠道中的适当位置具有活性。人类和其它动物的肠道具有复杂的结构，特别是ph差异巨大。在人体肠道中，酸性胃后的十二指肠腔内的ph值为约6，在小肠中ph从6增加到ph7.4(回肠末端)，在盲肠中ph降至5.7，并在直肠中逐渐增加至6.7。在一些动物中ph会发生很大的变化，在狗中的ph通常高于人类并且最高达7.3，而在猫中的ph可能低于6.6，这也取决于品种。根据饮食、年龄和疾病的不同，可能会发生变化。ph值反映了质子浓度的以10为底的对数，因此一个单位的ph值变化代表质子浓度的十倍差异。因此，产生既适用于人类又可用于宠物或生产动物、能在不同ph值下起作用的益生菌具有重要意义。

本发明的目的是提供一种新型益生菌，其可用于预防和/或治疗代谢紊乱和/或改善肠道屏障功能。

技术实现要素：

本发明涉及一种分离的嗜聚糖阿克曼氏菌(akkermansiaglycaniphilus)菌株，其优选能够在以黏蛋白作为唯一碳源和氮源的情况下生长，并且优选还能够在以n-乙酰葡糖胺、n-乙酰半乳糖胺、葡萄糖、乳糖、麦芽糖或半乳糖作为唯一碳源的情况下生长。在一个实施方案中，所述菌株是在真菌菌种保藏中心(cbs)保藏的cbs141023菌株或由其衍生的菌株。

本发明还提供了一种组合物，其包含如本文所述的分离的嗜聚糖阿克曼氏菌菌株和生理上可接受的载体。所述组合物可以是药物组合物，优选为固体剂型，例如胶囊剂、片剂或散剂。在一个实施方案中，所述嗜聚糖阿克曼氏菌以冻干形式或微囊化形式存在。所述嗜聚糖阿克曼氏菌可以以约10⁴至约10¹⁵个细胞的量存在。

本发明还涉及如本文所述的分离的嗜聚糖阿克曼氏菌菌株或如本文所述的组合物用作药物、用作益生菌和/或共生菌、或用作化妆品。如本文所述的菌株或组合物可以例如用于促进肠黏膜免疫系统功能，用于维持、恢复和/或增加哺乳动物肠黏膜屏障的物理完整性，用于促进体重减轻，和/或用于预防和/或治疗选自以下的病症：代谢综合征、肥胖症、胰岛素缺乏症或胰岛素抵抗相关病症、2型糖尿病、1型糖尿病、炎性肠病(ibd)、肠易激综合征(ibs)、葡萄糖不耐症、脂质代谢异常、动脉粥样硬化、高血压、心脏病、中风、非酒精性脂肪肝、酒精性脂肪肝、高血糖症、肝性脂肪变性、血脂异常、与肥胖症(体重增加)相关的免疫系统功能失调、过敏、哮喘、自闭症、帕金森病、多发性硬化、神经退行性疾病、抑郁症、与屏障功能受损有关的其他疾病、伤口愈合、行为障碍、酒精依赖、心血管疾病、高胆固醇、甘油三酯升高、动脉粥样硬化、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、胆囊疾病、癌症、以及改变肠黏膜屏障的物理完整性的病症(如食物过敏、肠道不成熟，例如由于婴儿早产、接触辐射、化疗和/或毒素引起的肠道不成熟)、自身免疫病、营养不良和脓毒症。

在最后一个方面，本发明提供了用于增加哺乳动物、优选人类的胃肠(gi)道中嗜聚糖阿克曼氏菌水平的方法，所述方法包括以下步骤：向所述哺乳动物施用如本文所述的分离的嗜聚糖阿克曼氏菌菌株或组合物；以及通过向所述哺乳动物施用选自以下的化合物：包含葡糖胺或葡糖胺衍生物如n-乙酰葡糖胺作为结构单元的化合物、和多酚，促进所述哺乳动物胃肠道中所述嗜聚糖阿克曼氏菌菌株的生长。

定义

如本文所用的术语“益生菌”或“益生菌产品”是指微生物，例如肠道细菌，当以有效量施用或摄入时，其赋予宿主(例如人类或哺乳动物)健康益处。优选地，益生菌应该是活的或有活力的，当施用于对象时使益生菌在宿主的大肠中定殖。然而，在某些条件下，益生菌在施用时也可能死亡，但是由益生菌产生的物质仍然对宿主产生益生的有益效果。大多数益生菌或益生菌产品由乳酸菌如乳酸杆菌或双歧杆菌构成。技术人员熟悉益生菌领域并且知道如何选择具有益生菌活性的乳酸菌。

本文提及的名称为“嗜聚糖阿克曼氏菌(akkermansiaglycaniphilus)”的物种与例如ouwerkerk等人(2016.intjofsystevolmicrobiol66:1-7)所用的名称为“嗜聚糖阿克曼氏菌(akkermansiaglycaniphila)”的物种相同。因此，这些名称可以互换使用。

如本文所用的术语“益生元”或“益生元产品”通常是指促进胃肠微生物的生长和/或活性、有助于其宿主的健康的化合物。益生元或益生元产品主要由可发酵纤维或不易消化的碳水化合物组成。通过益生菌发酵这些纤维促进了有益的最终产物的产生，例如scfa，特别是丁酸盐的产生。技术人员熟悉益生元领域并且知道如何选择具有益生元活性的成分。

如本文使用的术语“共生菌”或“共生菌产物”通常是指将益生菌和一种或多于一种促进胃肠微生物生长和/或活性的化合物(例如益生元)组合成一种产品的组合物和/或营养补充剂。共生菌通过选择性地刺激益生菌生长和/或通过激活益生菌的代谢来改善胃肠道中益生菌的存活和定殖而有益地影响宿主，从而改善宿主健康。技术人员熟悉共生菌，并且知道如何选择可以组合成共生菌的成分。

如本文所用的术语“有益肠道细菌”是指寄居在哺乳动物(例如人类)肠道中(即先天的)并对其所在哺乳动物的胃肠、代谢和其它健康状况产生有益影响(例如，保护免受病原细菌的侵害，产生丁酸和/或丁酸盐及其衍生物等)的细菌。有益肠道细菌的非限制性实例包括来自乳酸杆菌属的乳酸菌和双歧杆菌属。有益肠道细菌的其它非限制性实例包括产生丁酸盐的细菌，其使用乙酰-coa产生丁酸和/或丁酸盐及其衍生物，例如us2014/0242654、wo2014/150094或wo2013032328a1中公开的细菌菌株。类似地，产生丙酸盐的物种可视为益生菌，因为丙酸盐像丁酸盐一样控制体重和胰岛素敏感性，通过调节性t细胞向免疫系统等发出信号，并通过ffar2受体影响神经回路(canfora等人,2015.naturereviewsendocrinology11:577-591；smith等人,2013.science341:569-573；erny等人,2015,natneurosci18:965-977)。丙酸盐是肝脏糖异生的底物，对脂质和胆固醇合成具有抑制作用，而对炎症和癌变具有防护作用(hosseini等人,2011.nutritionreviews69:245-258)。人类的饮食干预表明，丙酸盐还可以增加饱腹感并调节食欲，从而维持超重成人的体重(chambers等人2015.gut64:1744-1754)。

如本文所用术语“病原细菌”是指寄居在哺乳动物(例如人类)肠道中(即先天的)并对其所在的哺乳动物的胃肠健康产生有害影响(例如感染)的细菌。病原细菌的著名的非限制性实例是产生毒素的艰难梭菌(clostridiumdifficile)。

如本文所用的术语“有效量”是指实现如本文所述效果所需的量。本领域普通技术人员无需过度实验即可容易地确定有效量。

如本文所用的术语“由其衍生的菌株”涉及通过使用如本文所述的保藏菌株作为起始材料而获得的菌株。由其衍生的菌株可以是突变菌株，其可以通过例如基因工程、辐射、紫外光、化学处理而衍生自本发明的菌株。或者，此类衍生菌株或突变菌株可以是衍生自如本文所述的保藏菌株的菌株，其已经经历特定条件的生长适应从而获得了衍生菌株的额外益处，例如在肠道中更快速的生长、更好的存活等。优选地，衍生菌株或突变菌株在功能上等同于如本文所述的保藏菌株。如本文所述的优选的衍生菌株或突变菌株具有与如本文所述的保藏菌株基本相同的活性或功能。衍生菌株或突变菌株有利地为施用所述衍生菌株或突变菌株的哺乳动物(例如人类或其它哺乳动物)提供与施用保藏菌株时的情况基本上相同的益处。衍生菌株或突变菌株也可以是具有与本文所述保藏菌株相同特征的自发衍生菌株或突变菌株。

术语“适合于摄入”或“营养学上可接受”是指成分或物质通常被认为对人类(以及其它哺乳动物)摄入而言是安全的。

如本文所用的术语“包含”或“包括”及其结合是指这样的情况，其中所述术语的非限制性含义是指包括该词语后的项目，但是并不排除未特别提及的项目。该术语还包括更限制性的动词“基本上由……组成”和“由……组成”。

要素前没有数量词不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个要素。因此要素前没有数量词通常指“至少一个”。

术语“增加”和“水平增加”以及术语“降低”和“水平降低”是指显著增加或显著降低或水平显著增加或水平显著降低的能力。通常，当分别比对照或参照中的相应水平高或低至少5％，例如10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％时，水平增加或降低。或者，与对照或参照中的水平相比，当统计学上显著增加或降低时，样品中的水平可以增加或降低。

具体实施方式

细菌

本发明人从网纹蟒(reticulatedpython)的肠中分离出新的阿克曼氏菌物种pyt^t菌株。

它是革兰氏阴性、非运动性、严格厌氧、椭圆状、不形成孢子的细菌。它能够使用黏蛋白作为唯一的碳源、能源和氮源，这是它与人类菌株嗜黏蛋白阿克曼氏菌muc^t共有的特性。pyt^t菌株可以在有限数量的单一糖类上生长，这些糖包括n-乙酰葡糖胺、n-乙酰半乳糖胺、葡萄糖、乳糖、麦芽糖和半乳糖，但仅在提供丰富的蛋白质来源时才能生长。基于16srrna基因测序的系统发育分析显示pyt^t菌株属于疣微菌纲i阿克曼氏菌科阿克曼氏菌属(verrucomicrobiaeclassi,familyakkermansiaceae,genusakkermansia)，与嗜黏蛋白阿克曼氏菌muc^t是亲缘关系最近的物种(94.4％序列相似性)。基于表型、系统发育和遗传特征，pyt^t菌株代表阿克曼氏菌属中的新物种，为此提出了pyt^t菌株类型的名称为嗜聚糖阿克曼氏菌新种(akkermansiaglycaniphilussp.nov.)。

因此，本发明涉及嗜聚糖阿克曼氏菌菌株，例如，pyt^t菌株类型，该菌株由瓦赫宁恩大学于2016年2月24日在荷兰uppsalalaan8真菌菌种保藏中心保藏，其接收保藏号为cbs141023；或涉及由嗜聚糖阿克曼氏菌衍生的菌株。

在一个实施方案中，所述菌株能够在以黏蛋白作为其唯一碳源和氮源的情况下生长。黏蛋白聚糖主要由半乳糖、n-乙酰葡糖胺、n-乙酰半乳糖胺组成，并且嗜聚糖阿克曼氏菌pyt^t菌株能够将这些全部用作生长底物。与嗜黏蛋白阿克曼氏菌muc^t菌株相比，嗜聚糖阿克曼氏菌pyt^t菌株能够使用半乳糖作为唯一的碳源，同时主要产生丙酸盐、乙酸盐和少量琥珀酸盐。

虽然嗜聚糖阿克曼氏菌pyt^t菌株具有较宽的可以最佳生长的ph范围，但其最佳ph比嗜黏蛋白阿克曼氏菌muc^t的最佳ph低约0.5个ph单位。

研究显示，肥胖或超重对象的肠道中嗜黏蛋白阿克曼氏菌耗尽，并且在食物摄入没有任何改变的情况下嗜黏蛋白阿克曼氏菌补充剂使饮食诱导的代谢性内毒素血症、肥胖症和脂肪组织cd11c标志物正常化(wo2014/075745)。此外，嗜黏蛋白阿克曼氏菌治疗减轻了体重并改善了身体组成(即脂肪/瘦体质量比)。考虑到嗜聚糖阿克曼氏菌与嗜黏蛋白阿克曼氏菌的相似性，假设嗜聚糖阿克曼氏菌能够以与嗜黏蛋白阿克曼氏菌相同的方式预防和/或治疗代谢紊乱。类似地，预计由嗜黏蛋白阿克曼氏菌刺激的屏障功能会由嗜聚糖阿克曼氏菌加强，因为后者是在蟒蛇的肠道中发现的唯一的阿克曼氏菌物种。类似于嗜黏蛋白阿克曼氏菌，肠道阿克曼氏菌的水平在禁食时增加，这是蟒蛇正常生命周期的一部分(belzer和devos,2012,ismej6:1449-58)。

在一个实施方案中，所述菌株还能够在以n-乙酰葡糖胺、n-乙酰半乳糖胺、葡萄糖、乳糖、麦芽糖或半乳糖作为唯一碳源的情况下生长，并且特别是能够在存在合适的氮源如胰蛋白胨、任选地补充有苏氨酸的情况下，在含有n-乙酰葡糖胺、n-乙酰半乳糖胺、d-葡萄糖、d-乳糖或d-半乳糖的基础培养基中生长，例如，在存在16gl-¹胰蛋白胨和4gl-¹苏氨酸的情况下，在含有n-乙酰葡糖胺、n-乙酰半乳糖胺、d-葡萄糖、d-乳糖或d-半乳糖的基础培养基中生长。胰蛋白胨是酪蛋白的蛋白水解消化物，可以被其它蛋白质源替代，例如，被来源于大豆或豌豆及其它植物蛋白质的蛋白质源替代。

组合物

本发明还涉及包含如本文所述的分离的嗜聚糖阿克曼氏菌菌株和生理上可接受的载体的组合物。

在一个实施方案中，生理上可接受的载体可以是适合于保持如本文所述的细菌菌株的活力直到被对象(例如人类和/或动物)摄入的任何载体。例如，适用于此目的的可接受载体的非限制性实例包括任何熟知的生理或药物载体、缓冲剂和赋形剂。应当理解，合适的生理或药物载体的选择取决于如本文所述的组合物的预期给药方式(例如经口给药)和组合物的预期形式(例如饮料、酸奶、散剂、胶囊等)。技术人员知道如何选择适合于如本文所述的组合物的生理或药物载体。

在一个实施方案中，如本文所述的组合物可以是食品组合物、饲料组合物、饲料补充剂组合物、食品补充剂组合物或药物组合物的形式。组合物优选适合于由哺乳动物如人类、宠物或生产动物摄入。

在一个实施方案中，组合物是食品或食品补充剂组合物。食品或食品补充剂组合物可以选自液体、液体饮料(包括乳饮料和发酵饮料)、酸奶、奶酪、凝胶、明胶、明胶胶囊、散剂、糊剂、压缩片剂和凝胶胶囊。在合适的实施方案中，组合物为液体，优选为液体饮料(例如乳饮料)。食品或食品补充剂组合物可以为乳制品，优选为发酵乳制品，优选酸奶或酸奶饮料。

在一个实施方案中，如本文所述的组合物可以是益生菌组合物。这种益生菌组合物可以包含如本文所述的任何分离的肠道细菌菌株或由其衍生的菌株。

在一个实施方案中，如本文所述的组合物还包含一种或多于一种另外的有益的分离肠道细菌菌株。

在一个实施方案中，如本文所述的组合物可以是共生菌组合物。向如本文所述的组合物中加入一种或多于一种益生元成分可能是有利的，例如，增强如本文所述的肠道细菌菌株的作用(例如，产生丁酸和/或丁酸盐或其衍生物)。

在一个实施方案中，一种或多于一种益生元成分可以是如本文所述的任何益生菌成分，其适于增强所分离的肠道细菌或由其衍生的菌株的活性和/或刺激所分离的肠道细菌或由其衍生的菌株的生长。合适的益生元成分的非限制性实例包括纤维、纤维二糖、麦芽糖、甘露糖、水杨苷、海藻糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、蜜二糖、鼠李糖和/或木糖。

在一个实施方案中，如本文所述的组合物可以包含一种或多于一种成分，该成分适于在储存期间和/或在暴露于胆汁期间和/或在通过哺乳动物(例如人类)的胃肠道期间促进如本文所述的细菌菌株或由其衍生的菌株的存活和/或活力。这类成分的非限制性实例包括允许通过胃的肠溶包衣和控释剂。技术人员知道如何选择合适的成分来维持细菌菌株的活力和功能，即能够实现其预期的功能。

在一个实施方案中，如本文所述的组合物还可以包含一种或多于一种进一步增强如本文所述的组合物的营养价值和/或治疗价值的成分。例如，加入一种或多于一种选自以下的成分(例如营养成分、兽用药剂或医学药剂等)是有利的：蛋白质、氨基酸、酶、矿物盐、维生素(例如盐酸硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、氯化胆碱、泛酸钙、生物素、叶酸、抗坏血酸、维生素b12、对氨基苯甲酸、维生素a乙酸酯、维生素k、维生素d、维生素e等)、糖类和复合碳水化合物(例如可溶于水和不溶于水的单糖、二糖和多糖)、药用化合物(例如抗生素)、抗氧化剂、微量元素成分(例如钴、铜、锰、铁、锌、锡、镍、铬、钼、碘、氯、硅、钒、硒、钙、镁、钠和钾等的化合物)。技术人员熟悉适合于增强如本文所述的组合物的营养价值和/或治疗价值/药用价值的方法和成分。

本文所述的细菌菌株可以以冻干形式、微囊化形式(例如solanki等人biomedres.int.2013,文章id620719中所综述的)、或保留细菌菌株的活性和/或活力的任何其它形式并入组合物中。

如本文所述的组合物可以是药物组合物。该药物组合物可以用作补充剂。药物组合物除了包含本文所述的细菌菌株之外，通常还包含药物载体。载体优选为惰性载体。优选的形式取决于预期的给药方式和(治疗)应用。药物载体可以是适于将本文所述的细菌菌株的细菌递送至对象胃肠道的任何相容的无毒物质。例如，可以使用无菌水或惰性固体作为载体，通常补充有药学上可接受的佐剂、缓冲剂、分散剂等。如本文所述的药物组合物可以是液体形式，例如本文所述的细菌菌株的稳定细菌悬浮液；或固体形式，例如本文所述的细菌菌株的冻干细菌粉末。在本文所述的细菌菌株被冻干的情况下，可以使用冷冻保护剂，例如乳糖、海藻糖或糖原。例如，对于经口给药，本文所述的细菌菌株的细菌可以以包含冻干细菌的固体剂型如胶囊剂、片剂和散剂给药，或以液体剂型如酏剂、糖浆剂和混悬剂给药。本文所述的细菌菌株的细菌，例如冻干形式的细菌，可以与非活性成分和粉末状载体一起包封在胶囊如明胶胶囊中，该粉末状载体例如为葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁等。

在一个实施方案中，在如本文所述的组合物中可以包含有效量的如本文所述的肠道细菌或由其衍生的菌株，有效量例如为约10⁴个细胞或菌落形成单位(cfu)至约10¹⁵个细胞或cfu。例如，组合物中可以包含的肠道细菌的量为约10⁶或10⁷个细胞或cfu至约10¹⁴个细胞或cfu，优选约10⁸个细胞或cfu至约10¹³个细胞或cfu，优选约10⁹个细胞或cfu至约10¹²个细胞或cfu，更优选约10¹⁰个细胞或cfu至约10¹²个细胞或cfu。

如本文所述的组合物可以通过任何常规方法产生。

细菌菌株和组合物的方法和用途

另一方面，本发明涉及如本文所述的细菌菌株或如本文所述的组合物，其用作药物、用作食品或食品补充剂、或用作益生菌和/或共生菌。

本发明还涉及如本文所述的分离的嗜聚糖阿克曼氏菌菌株或如本文所述的组合物，其用于预防和/或治疗选自以下的病症：代谢综合征、肥胖症、胰岛素缺乏症或胰岛素抵抗相关病症、2型糖尿病、1型糖尿病、炎性肠病(ibd)、肠易激综合征(ibs)、葡萄糖不耐症、脂质代谢异常、动脉粥样硬化、高血压、心脏病、中风、非酒精性脂肪肝、酒精性脂肪肝、高血糖症、肝性脂肪变性、血脂异常、与肥胖症(体重增加)相关的免疫系统功能失调、过敏、哮喘、自闭症、帕金森病、多发性硬化、神经退行性疾病、抑郁症、与屏障功能受损有关的其他疾病、伤口愈合、行为障碍、酒精依赖、心血管疾病、高胆固醇、甘油三酯升高、动脉粥样硬化、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、胆囊疾病、癌症、和改变肠黏膜屏障的物理完整性的病症(如食物过敏、肠道不成熟，例如由于婴儿早产、接触辐射、化疗和/或毒素引起的肠道不成熟)、自身免疫病、营养不良和脓毒症；以及用于促进哺乳动物肠道的抗炎活性。

本发明还提供调节和/或促进肠黏膜免疫系统功能和/或维持和/或恢复和/或增加哺乳动物如人类的肠黏膜屏障的物理完整性的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物如人类施用如本文所述的嗜聚糖阿克曼氏菌菌株或如本文所述的组合物的步骤。

在一个实施方案中，如本文所述的细菌菌株或如本文所述的组合物每周施用至少一次，优选每周施用至少两次，更优选每天施用至少一次，甚至更优选每天施用至少两次。

在一个实施方案中，每天施用的嗜聚糖阿克曼氏菌的每日量为约10⁴个细胞或菌落形成单位(cfu)至约10¹⁵个细胞或cfu。例如，施用的肠道细菌的量可以为每天约10⁶或10⁷个细胞或cfu至约10¹⁴个细胞或cfu，优选每天约10⁸个细胞或cfu至约10¹³个细胞或cfu，优选每天约10⁹个细胞或cfu至约10¹²个细胞或cfu，更优选每天约10¹⁰个细胞或cfu至约10¹²个细胞或cfu。

在一个实施方案中，将如本文所述的细菌菌株或如本文所述的组合物施用于超重的对象或肥胖的对象。在一个实施方案中，对象被诊断为代谢紊乱，例如与超重和/或肥胖症相关的代谢紊乱。在另一个实施方案中，所述对象存在发展出代谢紊乱的风险，例如与超重和/或肥胖症相关的代谢紊乱。例如，所述风险可能与对象超重或肥胖的事实有关。替代地或另外地，所述风险对应于易患病的倾向，例如，家族易患病的倾向，对应于代谢紊乱，例如与超重和/或肥胖症相关的代谢紊乱。

对象可以是任何年龄群体(例如，婴幼儿、成人、老年人)和任何性别(男性和女性)。在一个实施方案中，哺乳动物是婴幼儿(例如，新生儿、婴儿、幼儿等)，特别是早产的婴幼儿。

在一个实施方案中，对象的肠道微生物群中耗尽了嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌株。例如，对象肠道中嗜黏蛋白阿克曼氏菌的比例(肠道中嗜黏蛋白阿克曼氏菌的数量占细菌细胞总数量的比例)可以小于1％，优选小于0.5％，更优选小于0.1％。

本发明还涉及嗜聚糖阿克曼氏菌用于促进对象体重减轻的美容用途。

因此，本发明还提供了包含美容有效量的嗜聚糖阿克曼氏菌的美容组合物及其用于促进对象体重减轻的用途。如本文所用，“美容有效量”是指必需且足以促进美容效果，例如诱导对象体重减轻的美容组合物的量。

在一个实施方案中，嗜聚糖阿克曼氏菌的美容有效量为约10⁴个细胞或菌落形成单位(cfu)至约10¹⁵个细胞或cfu。例如，施用的肠道细菌的量可以为每天约10⁶或10⁷个细胞或cfu至约10¹⁴个细胞或cfu，优选每天约10⁸个细胞或cfu至约10¹³个细胞或cfu，优选每天约10⁹个细胞或cfu至约10¹²个细胞或cfu，更优选每天约10¹⁰个细胞或cfu至约10¹²个细胞或cfu。

在一个实施方案中，如本文所述的美容组合物每周施用至少一次，优选每周施用至少两次，更优选每天施用至少一次，甚至更优选每天施用至少两次。

本发明还提供了用于提高哺乳动物、优选人类的胃肠道中嗜聚糖阿克曼氏菌水平的方法，所述方法包括以下步骤：

向所述哺乳动物施用权利要求1至4中任一项所限定的分离的嗜聚糖阿克曼氏菌菌株或权利要求5至8中任一项所限定的组合物；和

通过向所述哺乳动物施用选自以下的化合物：包含葡糖胺或葡糖胺衍生物如n-乙酰葡糖胺作为结构单元的化合物、和多酚，促进所述哺乳动物胃肠道中所述嗜聚糖阿克曼氏菌菌株的生长。

包含葡糖胺或葡糖胺衍生物的化合物的非限制性实例是壳多糖。多酚例如可以包含在蔓越莓、葡萄或如所述的其它植物衍生产品中(参见anhêff等人gutmicrobes.2016年2月22:0.[印刷前电子出版])。

通过以下实施例进一步说明但非限制本发明。由上文的叙述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的必要特征，并且可以在不脱离本发明的内容和范围的情况下对本发明进行各种变化和修改以使其适应各种用法和条件。因此，根据前面的描述，除了本文所显示和描述的之外，本发明的各种修改对本领域技术人员将是显而易见的。这些修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。

实施例

材料和方法

微生物的来源和培养

在从位于伯格斯动物园(荷兰阿纳姆)的网纹蟒(malayopythonreticulatus)获得的新鲜粪便中分离黏液溶解细菌的过程中，使用含有0.5％黏蛋白作为唯一碳源和能源的厌氧基础培养基(如先前所述的黏蛋白培养基)回收pyt^t菌株(derrien,vaughan,plugge和devos,2004.intjsystevolmicrobiol54:1469-1476)。为了进行比较，使用嗜黏蛋白阿克曼氏菌muc^t(cip107961^t)。在黏蛋白培养基上使用绝迹稀释法分离pyt^t菌株，然后在黏蛋白平板上划线，该黏蛋白平板由补充有0.8％琼脂(惰性琼脂；difco)的黏蛋白培养基组成。挑取单菌落，在黏蛋白培养基中重新生长并在黏蛋白平板上重新划线直至达到一定纯度。

基于遗传的方法：系统发育分析和基因组分析

对克隆的16srrna基因的核苷酸序列进行分析以确定pyt^t菌株的系统发育关系。使用革兰氏阳性dna纯化试剂盒(epicenter)提取总dna，使用通用引物27f和1492r通过pcr扩增16srrna基因序列(suzuki,taylor和delong,2000.applenvironmicrobiol66:4605-4614)，并使用微量高纯度pcr清洁试剂盒(rochediagnostics)纯化pcr产物。为了获得几乎完整的pyt^t菌株的16srrna基因序列，根据制造商的说明使用pgem-teasy载体系统(promega)将纯化的pcr产物克隆到大肠杆菌xl1-blue中。使用qiaprepspinminiprep试剂盒(qiagen)从44个转化体培养物中分离质粒dna，并将所分离的质粒dna作为模板以使用插入侧翼序列的t7和sp6启动子靶向引物(promega)进行sanger序列分析(由gatc进行)。使用dnabaser对序列进行比对，并手动校正比对以确保重叠序列正确。发现所有克隆的插入序列来源于相同的16srrna基因，并获得了1439bp的序列。使用sina比对器(http://www.arb-silva.de/aligner/)(pruesse,peplies和glockner,2012.bioinformatics28:1823-1829)比对pyt^t菌株和疣微菌门其它成员的16srrna基因序列。使用arb重建系统发育树(ludwig,strunk,westram等人,2004.nucleicacidsres32:1363-1371)。通过使用基于1000次复制的自展值来确定邻位相连法和最大简约法的距离和聚类。

确定pyt^t菌株的部分基因组序列以进一步支持系统发育位置并研究其基因组关系。如上述分离的总dna用于制备miseq文库，该文库用于在具有250bp配对末端读取序列和500bp插入片段大小的illuminamiseq个人型测序仪上进行下一代测序。使用ray(k-mer101)组装读取序列(biosvert,raymond,godzaridis等人,2012.genomebiol13:r122)。

使用由用于预测蛋白质编码dna序列(cds)的prodigalv2.5(hyatt,chen,locascio等人,2010.bmcbioinformatics11:119)、用于蛋白质注释的interproscan5rc7(hunter,jones,mitchell等人,2012.nucleicacidsres40:d306-d312)、用于预测trna的trnascan-sev1.3.1(lowe和eddy,1997.nucleicacidsres25:955-964)和用于预测rrna的rnammerv1.2(lagesen,hallin,rodland等人,2007.nucleicacidsres35:3100-3108)组成的内部流水线进行注释。通过针对uniref50(suzek,huang,mcgarcey等人,2007.bioinformatics23:1282-1288)和swissprot(uniprot-consortium,2014)数据库(2013年8月下载)的blast鉴定获得额外的蛋白质功能预测。随后，通过添加priam2013年03月06日版本的ec编号进一步加强注释(claudel-renard,chevalet,faraut等人,2003.nucleicacidsres31:6633-6639)。使用rfam_scan.plv1.04，根据rfam数据库的11.0版本(burge,daub,eberhardt等人,2013.nucleicacidsres41:d226-d232)鉴定非编码rna。

对于dna-dna杂交(ddh)实验，使pyt^t菌株和muc^t菌株的细胞生长并在稳定期收获，然后将沉淀重悬于h2o:异丙醇(1:1)中。此后，leibniz-institutdsm-z(德国布伦瑞克deutschesammlungfurmikroorganismenundzellkulturen)进行了如前所述的ddh实验(cashion,holder-franklin,mccully等人,1977.analbiochem81:461-466；deley,cattoir和reynaert.a,1970.eurjbiochem12:133；huss,festl和schleifer,1983.systapplmicrobiol4:184-192)。

如前所述，leibniz-institutdsmz测定了pyt^t菌株的基因组dna的g+c含量百分比(cashion,holder-franklin,mccully和franklin,1977.analbiochem81:461-466；mesbah,premachandran和whitman,1989.intjsystbacteriol39:159-167,tamaoka和komagata,1984.femsmicrobiollett25:125-128)。

表型特征：形态学、生理学和化学分类学

如所述进行革兰氏染色(plugge,zoetendal和stams,2000.intjsystevolmicrobiol50pt3:1155-1162)。细胞在37℃下在基于黏蛋白的培养基上生长2天，通过相差显微镜监测细胞形态、运动性和孢子形成。通过用印度油墨悬浮液对生长在黏蛋白培养基中的细胞进行染色来确定荚膜的存在。

为进行扫描电子显微镜分析，将细胞在0.1m磷酸盐缓冲液(ph7.4)中的2％戊二醛中室温下固定2小时，并用2％四氧化锇再固定30分钟至60分钟。此后，将细胞在系列梯度醇(50％、70％、96％和100％)中脱水，最后用六甲基二硅氮烷处理，装到铝短柱中并涂覆铂。随后用feiquanta250feg扫描电子显微镜研究细胞。

使用30ml血清瓶对每种菌株进行两次重复的生长实验。气相为1.5atm的n2/co2(80:20，v/v)。除非另有说明，否则一般条件是ph6.5，温度37℃。通过用分光光度计(ultraspec10，biosciences)测量600nm处的光密度(od600)来监测生长。使用配备有agilentmetacarb67h柱的thermoelectronspectrasystemhplc测量短链脂肪酸。

在补充有0.5重量/体积％猪胃黏蛋白(iii型，sigma)和0.05重量/体积％半胱氨酸的脑心浸出液(bhi；difco)中两次重复测量最佳ph和最佳温度。测试温度为10℃至55℃，间隔为5℃；在37℃、ph为3.5至9、间隔为0.5个ph单位(用hcl或naoh调节)下测定生长。将培养物孵育至少1个月。

在前述补充有16gl^-1胰蛋白胨和苏氨酸4gl^-1的基础培养基中，以10mm的浓度两次重复地测试含有d-甘露糖、d-葡萄糖、l-岩藻糖、d-果糖、d-半乳糖、n-乙酰葡糖胺、n-乙酰半乳糖胺、d-纤维二糖时的生长(derrien,vaughan,plugge和devos,2004.intjsystevolmicrobiol54:1469-1476)。使用20a(biomérieux，法国)根据制造商的说明在含有d-葡萄糖、d-麦芽糖、d-乳糖、d-甘露醇、d-蔗糖、水杨苷、d-木糖、l-阿拉伯糖、甘油、d-纤维二糖、d-甘露糖、d-松三糖、d-棉子糖、d-山梨糖醇、l-鼠李糖和d-海藻糖时测定生长，其中进行一次改变：如前所述的补充有16gl^-1胰蛋白胨和4gl^-1苏氨酸的基础培养基(derrien,vaughan,plugge和devos,2004.intjsystevolmicrobiol54:1469-1476)用于接种20a。此后，通过与3％(重量/体积)的h2o2溶液反应来测定过氧化氢酶活性。吲哚和脲酶的形成以及明胶和七叶苷的水解也用20a(biomérieux，法国)鉴定条进行测定。

使用etest方法测定对氨苄青霉素和万古霉素(biomérieux，marcy法国)的抗生素抗性。孵育48小时后测定最小抑制浓度(mic)。更详细地，使pyt^t菌株在黏蛋白培养基中生长，并且在达到稳定期后，将100μl铺到补充有0.5％(体积/体积)猪胃黏蛋白(iii型，sigma)和0.05％(重量/体积)半胱氨酸-hcl(sigma-aldrich)的bhi平板上。将平板在严格厌氧条件下孵育24小时至48小时。使用欧盟药敏试验标准(eucast)折点表格对革兰氏阴性厌氧菌mic的解释来确定抗性水平(5.0版，有效期自2015年01月01日)。

为进行化学分类学表征，使pyt^t菌株和muc^t菌株生长并在稳定期收获，随后冷冻干燥。如前所述，通过leibniz-institutdsmz进行细胞脂肪酸的分析(kampfer和kroppenstedt,1996.canjmicrobiol42:989-1005)。

结果

系统发育和基因组特征

pyt^t菌株的16srrna基因核苷酸序列包括1437bp的连续延伸序列。邻接连接分析后的序列相似性计算表明，与pyt^t菌株亲缘关系最近的菌株是嗜黏蛋白阿克曼氏菌muc^t(94.4％)。对于97％的物种，16srrna序列相似性远低于目前的截止值(tindall,rossello-mora,busse等人,2010.intjsystevolmicrobiol60:249-266)。值得注意的是，pyt^t菌株的16srrna基因序列与来自海洋哺乳动物儒艮(ab264081)的粪便的未培养菌落显示出99.7％的相似性。发现与所有有效描述的属于疣微菌门的属的代表具有较低的序列相似性(<90.0％)，疣微菌门包括rubritaleaceae、阿克曼氏菌科和疣微菌科。

pyt^t菌株与muc^t菌株显示出相对较低的ddh相似性(28.3％±5.2％)。gc含量测定为58.2摩尔％。

通过单分子pacbio测序确定pyt^t菌株的完整基因组，并且发现完整基因组由单个染色体组成，其长度为3074121bp，gc含量为57.6％。pyt^t基因组比muc^t菌株(2.66mbp)的基因组大400kb。计算的pyt^t菌株的dnag+c含量％为57.6％，这与实验测定值(58.2％)具有良好的一致性，但略高于muc^t菌株(56.0％)。与muc^t菌株相比，pyt^t菌株基因组的blast相似性(>5kb)为82.0％。与muc^t菌株基因组相比，pyt^t菌株基因组的平均核苷酸同一性(ani)为79.7％。根据建议，ani可以准确地替代ddh(goris,konstantinidis等人,2007.intjsystevolmicrobiol57:81-91)。目前的数据证实了疣微菌门适用于此，并表明ani和ddh的相似性远低于目前70％ddh和95％ani的物种截止值。

pyt^t菌株的基因组反映了其黏蛋白降解能力，因为预测其编码55种糖苷水解酶，其中有28种预测是分泌的；编码5种岩藻糖苷酶，其中有3种预测是分泌的；并且编码7种唾液酸酶，其中有6种预测是分泌的。为了降解黏蛋白糖蛋白，需要切割可以连接在聚糖链末端的硫酸基团。预测pyt^t菌株将编码14种硫酸酯酶，其中有9种预测是分泌的。pyt^t基因组还包含细胞色素bd泛醇氧化酶的基因和ni依赖性氢化酶的基因，这显示出其有氧呼吸的潜能，从而可能用于肠黏蛋白层的氧-缺氧界面。

黏蛋白聚糖主要由半乳糖、n-乙酰葡糖胺、n-乙酰半乳糖胺组成，而pyt^t菌株能够将这些全部用作生长底物。与嗜黏蛋白阿克曼氏菌muc^t菌株相比，pyt^t菌株能够使用半乳糖作为唯一的碳源，同时主要产生丙酸盐、乙酸盐和少量琥珀酸盐。与在黏蛋白上生长(<16小时)相比，在半乳糖上生长相对缓慢(>1周)。基因组预测表明，pyt^t菌株仅编码标准的leloir途径酶，即半乳糖激酶(galk)和udp-葡萄糖4-差向异构酶(gale)。还预测这些酶由muc^t菌株编码(vanpassel,kant,zoetendal,plugge,derrien,malfatti,chain,woyke,palva,devos和smidt,2011.plosone6:e16876)。然而，在pyt^t菌株的基因组中我们可以鉴定出8个预测编码具有半乳糖结合结构域的蛋白质的基因，其中7个是分泌的，而在muc^t菌株的基因组中未发现。未知的半乳糖代谢途径可能在pyt^t菌株中起作用，并且这些基因可能参与结合和转运半乳糖的系统。

形态学

细胞呈椭圆状、非运动性并且染色为革兰氏阴性。当在基于黏蛋白的培养基中生长时，单细胞的长轴为0.6μm至1.0μm。细胞以单一、成对、短链和聚集形式存在。在37℃下在基于黏蛋白的琼脂上生长48小时，pyt^t菌株显示出直径为0.7mm的小白色菌落。sem显示出存在连接各个细菌细胞的丝状结构。pyt^t菌株的细胞可以不被印度油墨染色，这是有荚膜细菌的特征。

生理学

pyt^t菌株是严格的厌氧菌，在以l-半胱氨酸和/或硫化物作为还原剂的情况下生长。在15℃至40℃和ph5.0至ph7.5下生长，在25℃至30℃和ph6.0下具有最佳生长。与muc^t菌株相比，pyt^t菌株在略微更低的温度和ph下生长(表1)。其最佳温度30℃适合pyt^t菌株的栖息地，因为蟒蛇是变温动物并且依赖于外部热源来调节其体温，因此低于作为其猎物的人类或小型哺乳动物的体温(wang,zaar,arvedsen等人,2002.compbiochemphysiolamolitegrphysiol133:519-527)。在网纹蟒的近亲物种缅甸蟒(pythonbivittatus)中，胃肠ph值从禁食时的6.5(胃)至7.6(盲肠)，从2至3(胃)，7至8(食道、远端小肠、盲肠和近端大肠)变化到进食后的5至6.7(远端食道、近端胃和远端大肠)(secor,boback和lignot,2006.integrcompbiol46)。这表明pyt^t菌株的最佳ph(ph约6.0)可能对应于远端大肠的定殖。

pyt^t菌株在黏蛋白培养基中生长最好，并且能够使用黏蛋白作为碳源、能源和氮源，形成乙酸盐、丙酸盐和1,2-丙二醇。pyt^t菌株可以在不含维生素的黏蛋白培养基上生长，但也可以在含有n-乙酰葡糖胺、n-乙酰半乳糖胺、d-葡萄糖、d-乳糖和d-半乳糖、存在16gl^-1胰蛋白胨和4gl^-1苏氨酸的脑心浸出液培养基和基础培养基中缓慢生长。在补充有胰蛋白胨16gl^-1和苏氨酸4gl^-1的基础培养基中，含有d-甘露糖、l-岩藻糖、d-纤维二糖或d-果糖时不生长。

使用补充有16gl^-1胰蛋白胨和4gl^-1苏氨酸的基础培养基的20a(biomérieux，法国)鉴定条，观察到pyt^t菌株在含有d-葡萄糖、d-麦芽糖时生长，在含有d-乳糖时弱生长，但在含有d-甘露醇、d-蔗糖、水杨苷、d-木糖、l-阿拉伯糖、甘油、d-纤维二糖、d-甘露糖、d-松三糖、d-棉子糖、d-山梨糖醇、l-鼠李糖、d-海藻糖时没有观察到生长。过氧化氢酶活性为阳性。吲哚和脲酶形成为阴性，明胶和七叶苷水解为阳性。

pyt^t菌株能够使用乳糖作为唯一的碳源，同时主要产生丙酸盐和乙酸盐。在乳糖上的生长(td约4小时)比在黏蛋白上的生长(td约1小时)更慢。通过hplc定量分析发酵产物显示，乳糖最初分解成葡萄糖和半乳糖。此后，葡萄糖和半乳糖都转化为主要的丙酸盐和乙酸盐以及少量的琥珀酸盐。网纹蟒不是哺乳的哺乳动物，因此出乎意料的是pyt^t菌株可以使用乳糖作为生长底物。然而，在黏蛋白糖蛋白中存在许多β4糖酵解连接(linden,sutton,karlsson等人,2008.mucosalimmunol1:183-197)。乳糖具有类似的β4连接，其将葡萄糖与半乳糖连接在一起。因此，为了使用黏蛋白作为生长底物，pyt^t菌株需要能够降解该聚糖连接，因此pyt^t菌株可以使用与通常用于降解黏蛋白相同的酶来降解乳糖。

使用etest方法(biomérieux，法国)的分析显示，pyt^t菌株对氨苄青霉素(最小抑制浓度(mic)值为32μg/ml)和万古霉素(mic值为24μg/ml)具有相对抗性，但对临床上所有其它相关抗生素敏感，其它相关抗生素包括头孢菌素、氟喹诺酮类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、甲硝唑、氯霉素、利福平或粘菌素。

pyt^t菌株的生理学表征结果在物种描述中进行了描述并且在表1中与疣微菌纲(verrucomicrobiae)的其它成员进行了比较。

表1-与疣微菌科(分支i)的其它属的代表相比的阿克曼氏菌菌株类型的生理特征。数据取自(hedlund,2010.phylumxxiii.verrucomicrobiaphyl.nov.inbergey'smanualofsystematicbacteriology.第二版：施普林格，纽约)。菌株：1，嗜聚糖阿克曼氏菌pyt^t；2，嗜黏蛋白阿克曼氏菌muc^t；3，rubritalea(基于r.marina、r.sabuli、r.spongiae、r.squalenifaciens和r.tangerina)；4，突柄杆菌属(prosthecobacter)(基于p.debontii、p.dejongeii、p.fusiformis和p.vanneervenii)；5，疣微菌属(基于verrucomicrobiumspinosum)；+，阳性；-，阴性；(+)，弱阳性；存在16gl^-1胰蛋白胨和4gl^-1苏氨酸；取决于物种。所有菌株的运动性均为阴性，对维生素需求为阴性。所有菌株对氨苄青霉素敏感。

嗜聚糖阿克曼氏菌新种的描述

嗜聚糖阿克曼氏菌(种名取自聚糖+嗜好；表示该物种是嗜好聚糖的)。

细胞呈椭圆状、非运动性并且染色为革兰氏阴性。当在基于黏蛋白的培养基中生长时，单细胞的长轴为0.6μm至1.0μm。细胞以单一、成对、短链和聚集形式存在。细胞被细丝覆盖。在软琼脂黏蛋白培养基中菌落呈白色，直径为0.7mm。pyt^t菌株的细胞可以不被印度油墨染色，这是有荚膜细菌的特征。在15℃至40℃和ph5.0至ph7.5下生长，在25℃至30℃和ph6.0下具有最佳生长。严格厌氧或微需氧。能够在胃黏蛋白和脑心浸出液中生长，并在补充有16gl^-1胰蛋白胨和4gl^-1苏氨酸的基础培养基中在含有n-乙酰葡糖胺、n-乙酰半乳糖胺、葡萄糖、乳糖和半乳糖时生长。在补充有16gl^-1胰蛋白胨和4gl^-1苏氨酸的基础培养基中，含有l-岩藻糖、d-纤维二糖或d-果糖时不生长。使用同样的补充有16gl^-1胰蛋白胨和4gl^-1苏氨酸的基础培养基的20a(biomérieux，法国)鉴定条，观察到pyt^t菌株在含有d-葡萄糖、d-麦芽糖时生长，在含有d-乳糖时弱生长，但在含有d-甘露醇、d-蔗糖、水杨苷、d-木糖、l-阿拉伯糖、甘油、d-纤维二糖、d-甘露糖、d-松三糖、d-棉子糖、d-山梨糖醇、l-鼠李糖、d-海藻糖时没有观察到生长。过氧化氢酶活性为阳性。吲哚和脲酶形成为阴性，明胶和七叶苷水解为阳性。能够使用黏蛋白作为唯一的碳源、能源和氮源。不需要维生素就能生长。dna的g+c含量为58.2摩尔％。主要的细胞脂肪酸是前异构支链脂肪酸(anteiso)-c15:0、c15:0和c16:0。在荷兰瓦赫宁恩从网纹蟒粪便中分离。菌株类型为pyt^t(＝dsm100705＝cip110913t)。