用于治疗鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症的信使RNA疗法的制作方法

文档序号：16812356发布日期：2019-02-10 13:49阅读：492来源：国知局

本专利申请要求2016年6月13日提交的美国临时申请序列号62/349,331、以及于2017年5月22日提交的美国临时申请序列号62/509,568的优先权，所述美国临时申请的公开内容在此以引用的方式并入。

序列表

本说明书参考了(于2017年6月13日以电子方式作为命名为“sl_mrt-1243us”的.txt文件提交的序列表。.txt文件于2017年6月13日生成，并且大小为22,141字节。序列表的全部内容以引用的方式并入本文。

背景技术：

鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)缺乏症是x连锁遗传病症，其特征在于otc基因中的突变。otc基因中的突变消除或减少otc酶催化来自氨基甲酰磷酸盐和鸟氨酸的瓜氨酸合成(在肝脏和小肠中)的能力。因此，过量的氮以氨的形式在血液中累积，并且传播到神经系统，导致与otc缺乏症相关的症状。取消otc活性的突变完全导致严重的新生儿发病形式，而导致otc活性降低的突变导致迟发型表型。

otc缺乏症是最常见的尿素循环障碍类型，并且该疾病的发病率介于大约1/56,500和1/77,000活产婴儿之间。具有严重的新生儿发病型的男性在出生时是正常的，但在几天后发展吸吮不良、张力减退和昏睡，迅速进展为嗜睡和昏迷。癫痫发作和过度换气也可能存在。如果未经治疗，则发展严重的脑病，伴随高死亡风险。具有较温和形式的患者可在任何年龄呈现。在婴儿中，当从母乳转换为全脂乳时，可诱发症状。在儿童和成人中，环境应激因子(即禁食、高蛋白饮食、妊娠和产后期、并发疾病、手术)可触发高氨血症性脑病的发作，连同恶心、呕吐、头痛、不稳定行为、谵妄和好斗。这些发作也可导致高氨血症性昏迷。高氨血症性昏迷的神经系统并发症包括发育迟缓和(有时)严重的认知损害。许多女性携带者是无症状的；然而，如果疾病等位基因的x-失活程度是不利的，则她们可受到与男性相同程度的影响。凝血病在代谢失代偿期间经常发现，并且有时演变成急性肝衰竭。

目前，otc缺乏症无法治愈，并且长期治疗涉及蛋白质摄入的终生限制和氮清除剂疗法(使用苯乙酸钠或苯丁酸钠和/或苯甲酸钠)。在患有严重的新生儿发病的otc缺乏症(通常到6个月大时执行)或频繁高氨血症发作的患者中，也可考虑肝移植。

技术实现要素：

本发明尤其提供了基于mrna疗法，用于治疗鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)缺乏症的改进方法和组合物。本发明涵盖以下观察：包封在脂质体内的编码人otc蛋白的mrna的施用导致体内高效且持续的蛋白质产生，以及例如尿中的乳清酸水平(临床相关疾病标记物)的成功减少。

在一个方面，本发明提供了治疗鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)缺乏症的方法，其包括以有效剂量和施用间隔向需要治疗的受试者施用包含编码鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)蛋白的mrna的组合物，使得otc缺乏症的至少一种症状或特征在强度、严重性或频率方面减少或者已延迟发作。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna是密码子优化的。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna包含与seqidno:3、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9或seqidno:10至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的多核苷酸序列。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna包含seqidno:3。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna包含seqidno:6。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna包含seqidno:7。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna包含seqidno:8。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna包含seqidno:9。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna包含seqidno:10。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna不是seqidno:1。

在一些实施例中，mrna还包含seqidno:11的5'非翻译区(utr)序列。在一些实施例中，mrna还包含seqidno:12或seqidno:13的3'非翻译区(utr)序列。

在一些实施例中，mrna包封在脂质体内。在一些实施例中，脂质体包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和一种或多种peg修饰的脂质。在一些实施例中，一种或多种阳离子脂质包含选自c12-200、mc3、dlindma、dlinkc2dma、ckk-e12、ice(基于咪唑的)、hgt5000、hgt5001、of-02、dodac、ddab、dmrie、dospa、dogs、dodap、dodma和dmdma、dodac、dlendma、dmrie、clindma、cplindma、dmoba、docarbdap、dlindap、dlincarbdap、dlincdap、klin-k-dma、dlin-k-xtc2-dma、hgt4003及其组合的阳离子脂质。在一些实施例中，一种或多种非阳离子脂质选自dspc(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、dppc(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、dope(1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dopc(1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)、dppe(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dmpe(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dopg(2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油))及其组合。在一些实施例中，一种或多种基于胆固醇的脂质是胆固醇和/或peg化胆固醇。

在一些实施例中，脂质体具有小于约100nm的尺寸。

在一些实施例中，mrna以范围为约0.01-5.0mg/kg体重的有效剂量施用。在一些实施例中，mrna以范围为约0.01-3.0mg/kg体重的有效剂量施用。在一些实施例中，mrna以范围为约0.01-1.0mg/kg体重的有效剂量施用。在一些实施例中，mrna以范围为约0.01-0.5mg/kg体重的有效剂量施用。

在一些实施例中，组合物是静脉内施用的。在一些实施例中，组合物每周施用一次。在一些实施例中，组合物每月施用两次。在一些实施例中，组合物每14天施用一次。在一些实施例中，组合物每月施用一次。

在一些实施例中，与对照水平相比，组合物的施用导致受试者的血清中otc蛋白表达或活性水平增加。在一些实施例中，对照水平是治疗前受试者中的基线血清otc蛋白表达或活性水平。在一些实施例中，对照水平是指示没有治疗的otc患者中的平均血清otc蛋白表达或活性水平的参考水平。在一些实施例中，与对照乳清酸水平相比，组合物的施用导致受试者中的尿乳清酸水平减少。在一些实施例中，对照乳清酸水平是治疗前受试者中的基线尿乳清酸水平。在一些实施例中，对照乳清酸水平是指示没有治疗的otc患者中的平均尿乳清酸水平的参考水平。在一些实施例中，其中与对照瓜氨酸水平相比，组合物的施用导致受试者的血清中的瓜氨酸水平增加。在一些实施例中，对照瓜氨酸水平是治疗前受试者中的基线血清瓜氨酸水平。在一些实施例中，对照瓜氨酸水平是指示没有治疗的otc患者中的平均血清瓜氨酸水平的参考水平。

在一些实施例中，mrna包含一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施例中，一种或多种经修饰的核苷酸包含假尿苷、n-1-甲基-假尿苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、o(6)-甲基鸟嘌呤和/或2-硫代胞苷。

在一些实施例中，mrna是未经修饰的。

在一个方面，本发明提供了用于治疗鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)缺乏症的药物组合物，其包含编码鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)蛋白的mrna，并且其中编码otc蛋白的mrna包含与seqidno:3、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9或seqidno:10至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的多核苷酸序列。

在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna包含seqidno:3。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna包含seqidno:6。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna包含seqidno:7。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna包含seqidno:8。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna包含seqidno:9。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna包含seqidno:10。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna不是seqidno:1。在一些实施例中，mrna还包含seqidno:11的5'非翻译区(utr)序列。在一些实施例中，mrna还包含seqidno:12或seqidno:13的3'非翻译区(utr)序列。

在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna包封在脂质体内。在一些实施例中，脂质体包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和一种或多种peg修饰的脂质。在一些实施例中，脂质体具有小于约100nm的尺寸。

在下述详细描述、附图和权利要求中，本发明的其它特征、目的和优点是显而易见的。然而，应该理解，详细描述、附图和权利要求虽然指出了本发明的实施例，但仅以说明性方式而非限制性方式给出。在本发明的范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图说明

附图仅用于说明性目的而不是用于限制。

图1描绘了在单个0.5mg/kg剂量的负载hotcmrna的脂质纳米颗粒后，经过两周时期，通过蛋白质印迹的人otc蛋白的示例性免疫组织化学检测。

图2a描绘了在单个0.5mg/kg剂量的负载hotcmrna的脂质纳米颗粒后，经过两周时期，小鼠中的示例性瓜氨酸产生。

图2b描绘了在单个0.5mg/kg剂量的负载hotcmrna的脂质纳米颗粒后，经过两周时期，作为野生型活性的百分比在小鼠中的示例性hotc蛋白活性。

图3a描绘了在单个0.5mg/kg剂量的负载hotcmrna的脂质纳米颗粒后，通过蛋白质印迹的人otc蛋白的示例性免疫组织化学检测。

图3b描绘了在单个0.5mg/kg剂量的负载hotcmrna的脂质纳米颗粒后，通过蛋白质印迹的人otc蛋白的示例性免疫组织化学检测。使用的脂质纳米颗粒与图3a中使用的那些不同。

图4描绘了在单个0.5mg/kg剂量的负载hotcmrna的脂质纳米颗粒后24小时，小鼠中的示例性瓜氨酸产生。在用无义突变的mrna脂质纳米颗粒(stop)处理的小鼠中未观察到hotc活性。

图5描绘了在单个0.5mg/kg剂量的负载hotcmrna的脂质纳米颗粒后，小鼠的尿中的示例性乳清酸水平。

图6a描绘了涉及氨攻击的spf^ash小鼠中的示例性给药和测试方案。

图6b描绘了在用nh4cl的氨攻击后，用负载hotcmrna的脂质纳米颗粒处理后，spf^ash小鼠中的示例性血浆氨水平。

图7描绘了在用负载hotcmrna的脂质纳米颗粒处理后，作为野生型活性的百分比在spf^ash小鼠的肝脏中的示例性瓜氨酸产生。

图8描绘了在用负载hotcmrna的脂质纳米颗粒处理后，经过8周，如通过瓜氨酸产生测量的，作为野生型活性的百分比在spf^ash小鼠的肝脏中的示例性hotc活性。

图9a描绘了在用负载hotcmrna的脂质纳米颗粒每周处理后，经过一个月，如通过瓜氨酸产生测量的，spf^ash小鼠中的示例性hotc活性。

图9b描绘了在用负载hotcmrna的脂质纳米颗粒每周给药(1.0mg/kg)后，通过蛋白质印迹的人otc蛋白质的示例性免疫组织化学检测。

定义

为了使本发明更容易理解，首先在下文定义了某些术语。下述术语和其他术语的另外定义在说明书各处阐述。本文引用的出版物和其它参考材料描述本发明的背景且提供关于其实践的其它细节，在此以引用的方式并入。

烷基：如本文使用的，“烷基”指具有1至15个碳原子的直链或支链饱和烃基的原子团(“c1-15烷基”)。在一些实施例中，烷基具有1至3个碳原子(“c1-3烷基”)。c1-3烷基的例子包括甲基(c1)、乙基(c2)、正丙基(c3)和异丙基(c3)。在一些实施例中，烷基具有8至12个碳原子(“c8-12烷基”)。c8-12烷基的例子包括但不限于正辛基(c8)、正壬基(c9)、正癸基(c10)、正十一烷基(c11)、正十二烷基(c12)等等。前缀“n-”(正)指未分支的烷基。例如，n-c8烷基指-(ch2)7ch3，n-c10烷基指-(ch2)9ch3等。

氨基酸：如本文使用的，术语“氨基酸”，在其最广泛的意义上，指可掺入多肽链内的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，氨基酸具有一般结构h2n–c(h)(r)–cooh。在一些实施例中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”指天然存在的肽中常见的二十种标准l-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”指除标准氨基酸外的任何氨基酸，无论它是合成制备的还是从天然源获得的。如本文使用的，“合成氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)和/或取代。氨基酸，包括肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，可通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基团和/或用其它化学基团的取代来修饰，所述其它化学基团可改变肽的循环半衰期，而不会不利地影响其活性。氨基酸可参与二硫键。氨基酸可包括一个或翻译后修饰，例如与一个或多个化学实体(例如，甲基、乙酸基、乙酰基、磷酸基、甲酰基部分、类异戊二烯基团、硫酸基、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)结合。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用，并且可指肽的游离氨基酸和/或氨基酸残基。从其中使用该术语的上下文中显而易见它是指游离氨基酸还是肽的残基。

动物：如本文使用的，术语“动物”指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以为转基因动物、基因工程改造的动物和/或克隆。

大约或约：如本文使用的，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”指落入所述值任一方向(大于或小于)中的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的一系列值，除非另有说明或从上下文中另外显而易见的(除非该数字超过可能值的100％)。

生物活性的：如本文使用的，短语“生物活性的”指在生物系统中，且特别是在生物体中具有活性的任何试剂的特征。例如，当施用于生物时，对该生物体具有生物效应的试剂视为生物活性的。

递送：如本文使用的，术语“递送”涵盖局部递送和全身递送两者。例如，mrna的递送涵盖其中将mrna递送至靶组织并且编码的蛋白质在靶组织内表达且保留的情况(也称为“局部分布”或“局部递送”)，以及其中将mrna递送至靶组织并且编码的蛋白质表达且分泌到患者的循环系统(例如血清)内，并且全身分布且被其它组织吸收的情况(也称为“全身分布”或“全身递送”)。

表达：如本文使用的，核酸序列的“表达”指mrna翻译成多肽，将多个多肽组装成完整蛋白质(例如酶)和/或多肽或完全组装的蛋白质(例如酶)的翻译后修饰。在本专利申请中，术语“表达”和“产生”以及语法等价物可互换使用。

功能性：如本文使用的，“功能性”生物分子是以其中它显示出通过其表征的性质和/或活性的形式的生物分子。

半衰期：如本文使用的，术语“半衰期”指一定数量例如核酸或蛋白质浓度或活性降至如在时间段开始时测量的其值的一半所需的时间。

改善、增加或减少：如本文使用的，术语“改善”、“增加”或“减少”或语法等价物指示相对于基线测量的值，所述基线测量例如在本文所述的治疗开始之前相同个体中的测量，或在不存在本文所述的治疗的情况下在对照受试者(或多个对照受试者)中的测量。“对照受试者”是患有与正在接受治疗的受试者相同形式的疾病的受试者，其与正在接受治疗的受试者大约相同的年龄。

体外：如本文使用的，术语“体外”指在人造环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养等中，而不是在多细胞生物体内发生的事件。

体内：如本文使用的，术语“体内”指在多细胞生物内，例如人和非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的背景下，该术语可用于指在活细胞内(与例如体外系统相反)发生的事件。

分离的：如本文使用的，术语“分离的”指(1)在最初生产时(无论在自然界中和/或在实验环境中)，已与它结合的至少一些组分分开，和/或(2)通过人为产生、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可与它们最初结合的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的其他组分分开。在一些实施例中，分离的试剂是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯的。如本文使用的，如果物质基本上不含其它组分，则它是“纯的”。如本文使用的，分离的物质和/或实体的纯度百分比的计算不应包括赋形剂(例如缓冲液、溶剂、水等)。

局部分布或递送：如本文使用的，术语“局部分布”、“局部递送”或语法等价物指组织特异性递送或分布。通常，局部分布或递送需要由mrna编码的蛋白质(例如酶)在细胞内或伴随有限分泌被翻译且表达，其避免进入患者的循环系统。

信使rna(mrna)：如本文使用的，术语“信使rna(mrna)”指编码至少一种多肽的多核苷酸。如本文使用的，mrna涵盖经修饰的rna和未经修饰的rna两者。mrna可含有一个或多个编码和非编码区。mrna可从天然源纯化，使用重组表达系统产生且任选地纯化，体外转录，化学合成等。适当时，例如，在化学合成的分子的情况下，mrna可包含核苷类似物，例如具有化学修饰的碱基或糖、主链修饰等的类似物。除非另有说明，否则mrna序列以5'至3'方向呈现。在一些实施例中，mrna是或包含天然核苷(例如腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、o(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物学修饰的碱基(例如甲基化碱基)；插入碱基；经修饰的糖(例如2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸基(例如硫代磷酸酯和5'-n-亚磷酰胺键)。

核酸：如本文使用的，术语“核酸”在其最广泛的意义上，指掺入或可掺入多核苷酸链内的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是经由磷酸二酯键掺入或可掺入多核苷酸链内的化合物和/或物质。在一些实施例中，“核酸”指个别核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施例中，“核酸”指包含个别核酸残基的多核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”涵盖rna以及单链和/或双链dna和/或cdna。

患者：如本文使用的，术语“患者”或“受试者”指所提供的组合物可施用于其的任何生物，例如用于实验、诊断、预防、美容和/或治疗目的。典型的患者包括动物(例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和/或人)。在一些实施例中，患者是人。人包括出生前和出生后形式。

药学可接受的:如本文使用的，术语“药学可接受的”指这样的物质，在合理的医学判断范围内，所述物质适用于与人类和动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应、或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

药学可接受的盐：药学可接受的盐是本领域众所周知的。例如，s.m.berge等人在j.pharmaceuticalsciences(1977)66:1-19中详细描述了药学可接受的盐。本发明化合物的药学可接受的盐包括源自合适的无机和有机酸和碱的那些盐。药学可接受的、无毒的酸加成盐的例子是与无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或者有机酸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸，或者通过使用本领域中使用的其它方法如离子交换形成的氨基的盐。其它药学可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等等。源自适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和n⁺(c1-4烷基)4盐。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等等。进一步的药学可接受的盐包括(适当时)无毒铵盐、季铵盐和使用抗衡离子形成的胺阳离子，例如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、磺酸盐和芳基磺酸盐。进一步的药学可接受的盐包括使用适当的亲电子试剂(例如卤代烷)的胺季铵化形成的盐，以形成季铵化的烷基化氨基盐。

全身分布或递送：如本文使用的，术语“全身分布”、“全身递送”或语法等价物指影响整个身体或整个生物的递送或分布机制或方法。通常，全身分布或递送经由身体的循环系统例如血流来完成。与“局部分布或递送”的定义相比。

受试者：如本文使用的，术语“受试者”指人或任何非人动物(例如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方案中，受试者是人类。受试者可以为患者，其指提供给医疗提供者用于疾病的诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可患有或易患疾病或病症，但可表现出或可不表现出疾病或病症的症状。

基本上：如本文使用的，术语“基本上”指显示出目的特征或性质的总体或接近总体程度或范围的定性条件。生物领域的普通技术人员应理解，生物学现象和化学现象很少(如果有的话)完成和/或进行至完成或达到或避免绝对结果。术语“基本上”因此在本文中用于捕获许多生物学现象和化学现象固有的潜在缺乏的完整性。

靶组织：如本文使用的，术语“靶组织”指受待治疗疾病影响的任何组织。在一些实施例中，靶组织包括展示疾病相关病理学、症状或特征的那些组织。

治疗有效量：如本文使用的，术语治疗剂的“治疗有效量”意指当施用于患有或易患疾病、病症和/或状况的受试者时，足以治疗、诊断、预防和/或延迟疾病、病症和/或状况的症状发作的量。本领域普通技术人员应了解，治疗有效量通常经由包含至少一个单位剂量的给药方案施用。

治疗：如本文使用的，术语“治疗”指用于部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、预防、延迟以下的发作、减少以下的严重性和/或减少以下的发生率：特定疾病、病症和/或状况的一种或多种症状或特征。治疗可施用于未表现出疾病征兆和/或仅表现出疾病早期征兆的受试者，用于降低与疾病相关病理发展的风险。

具体实施方式

本发明尤其提供了基于mrna疗法，用于治疗鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)缺乏症的方法和组合物。特别地，本发明提供了通过以下治疗otc缺乏症的方法：以有效剂量和给药间隔向需要治疗的受试者施用包含编码鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)的mrna的组合物，使得otc缺乏症的至少一种症状或特征在强度、严重性或频率方面减少或者具有延迟的发作。本发明还提供了治疗otc缺乏症的方法，其包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的包含编码酸性otc的mrna的组合物，使得受试者中的高氨血症得到治疗。在一些实施例中，mrna包封在一种或多种脂质体内。如本文使用的，术语“脂质体”指任何层状、多层或固体纳米颗粒囊泡。通常，如本文使用的，脂质体可通过混合一种或多种脂质或者通过混合一种或多种脂质和聚合物来形成。因此，如本文使用的，术语“脂质体”涵盖基于脂质和聚合物两者的纳米颗粒。在一些实施例中，适合于本发明的脂质体含有阳离子或非阳离子脂质、基于胆固醇的脂质和peg修饰的脂质。

鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)缺乏症

本发明可用于治疗患有或易患鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)缺乏症的受试者。otc缺乏症是x连锁遗传病症，其特征在于酶鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)基因中的突变。otc酶也称为鸟氨酸氨基甲酰转移酶，线粒体。otc基因也称为：mgc129967、mgc129968、octd、鸟氨酸氨基甲酰转移酶前体、鸟氨酸转氨甲酰酶和otc_human。在otc基因中已鉴定了多于300种引起otc缺乏症的突变。otc基因中的许多突变很可能影响所得到的蛋白质的结构并且降低其活性。

本文所述的组合物和方法可用于治疗otc缺乏症的至少一种症状或特征。特别地，本文所述的组合物和方法可用于治疗高氨血症。

otc基因中的突变消除或减少otc酶催化来自氨基甲酰磷酸盐和鸟氨酸的瓜氨酸合成(在肝脏和小肠中)的能力。因此，过量的氮以氨的形式在血液中累积，并且传播到神经系统，导致与otc缺乏症相关的症状。氨的积累可导致脑损伤和死亡。取消otc活性的突变完全导致严重的新生儿发病形式，而导致otc活性降低的突变导致迟发型表型。

鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)

在一些实施例中，本发明提供了用于将编码otc的mrna递送至受试者用于治疗otc缺乏症的方法和组合物。合适的otcmrna编码otc蛋白的任何全长、片段或部分，其可取代天然存在的otc蛋白活性和/或减少与otc缺乏症相关的一种或多种症状的强度、严重性和/或频率。

在一些实施例中，合适的mrna序列是编码人otc蛋白的mrna序列。天然存在的人otcmrna编码序列和相应的氨基酸序列显示于表1中：

表1.人otc

在一些实施例中，合适的mrna是序列的野生型人otcmrna(seqidno:1)。在一些实施例中，合适的mrna可为密码子优化的hotc序列。在一些实施例中，合适的密码子优化的mrna可编码表1中显示为seqidno:5的otc氨基酸序列，或者与seqidno:5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。示例性的合适的密码子优化的mrna序列在下文描述。

在一些实施例中，合适的mrna可为如seqidno:3中所示的密码子优化的序列：

augcuguucaaccuucggaucuugcugaacaacgcugcguuccggaauggucacaacuucaugguccggaacuucagaugcggccagccgcuccagaacaaggugcagcucaaggggagggaccuccucacccugaaaaacuucaccggagaagagaucaaguacaugcuguggcugucagccgaccucaaauuccggaucaagcagaagggcgaauaccuuccuuugcugcagggaaagucccuggggaugaucuucgagaagcgcagcacucgcacuagacugucaacugaaaccggcuucgcgcugcugggaggacaccccugcuuccugaccacccaagauauccaucugggugugaacgaaucccucaccgacacagcgcgggugcugucguccauggcagacgcgguccucgcccgcguguacaagcagucugaucuggacacucuggccaaggaagccuccauuccuaucauuaauggauuguccgaccucuaccaucccauccagauucuggccgauuaucugacucugcaagaacauuacagcucccugaaggggcuuacccuuucguggaucggcgacggcaacaacauucugcacagcauuaugaugagcgcugccaaguuuggaaugcaccuccaagcagcgaccccgaagggauacgagccagacgccuccgugacgaagcuggcugagcaguacgccaaggagaacggcacuaagcugcugcucaccaacgacccucucgaagccgcccacgguggcaacgugcugaucaccgauaccuggaucuccaugggacaggaggaggaaaagaagaagcgccugcaagcauuucagggguaccaggugacuaugaaaaccgccaaggucgccgccucggacuggaccuucuugcacugucugcccagaaagcccgaagagguggacgacgagguguucuacagcccgcggucgcuggucuuuccggaggccgaaaacaggaaguggacuaucauggccgugauggugucccugcugaccgauuacuccccgcagcugcagaaaccaaaguucuga(seqidno:3)

在一些实施例中，合适的mrna可为如seqidno:6中所示的密码子优化的序列。

augcuuuucaaccugagaauucugcugaacaacgcagccuuccgcaacggacacaacuucaugguccggaacuucagaugcggacaaccgcugcagaacaagguccagcucaagggucgggaccuguugacucuuaagaauuucaccggagaagaaaucaaguacaugcuguggcuguccgccgaccugaaguuucgcaucaagcagaagggggaguaccucccccugcugcaaggaaagucccugggaaugauuuucgagaagcgcuccacccgcacuagacuuuccaccgaaaccggcuucgcucugcugggcggacauccuugcuuucugacgacucaggacauccaccucggagugaacgaaucccucaccgauaccgccagggugcugagcagcauggccgacgcugugcuggcucggguguacaagcaguccgaccucgacacccuggccaaggaagccucgaucccuaucaucaauggccugucagaccuguaccacccaauccagauucuggccgacuaccugacucuccaagagcacuacagcagccucaaggggcucacauuguccuggaucggcgacggcaacaacauccuucacuccauuaugaugucggccgccaaauucgggaugcaucugcaggcagccaccccuaagggauacgagcccgaugccuccgugaccaagcucgccgaacaguaugcgaaggagaacggcaccaagcuccugcucacuaacgauccguuggaagcugcccacggcggaaacgugcugauuaccgacaccuggaucagcauggggcaggaagaagagaagaagaagcggcugcaggcguuucaggguuaccaagucaccaugaaaacugccaaagucgcggcauccgacuggacuuuccugcacugucugccgaggaaaccagaggaaguggaugacgaaguguucuacucaccccggucgcugguguucccggaagcggagaaccggaaguggaccaucauggccgugauggugucgcugcucaccgauuacucuccgcaacugcagaagcccaaguucuga(seqidno:6)

在一些实施例中，合适的mrna可为如seqidno:7中所示的密码子优化的序列。

augcuguuuaaccugagaauucugcugaacaacgccgcguucaggaacggccacaauuucaugguccgcaacuuuagaugcggacagccucuccaaaacaagguccagcucaaggggcgggacuugcugacccuuaagaacuuuaccggcgaagagaucaaguacaugcugugguugucagcggaccugaaguuccgcaucaagcagaaaggggaguaucugccgcugcuccaaggaaagucgcucggcaugaucuucgagaagcgcucgaccagaacccggcuguccacugaaacugguuucgcccuucuggguggacacccuuguuuccugacaacccaggacauccaucugggcgugaacgaaagccucacugacaccgccagggugcugagcuccauggccgacgcuguccuugcccggguguacaagcaguccgaucuggacacucuggccaaggaagcguccaucccgaucauuaacggacuguccgaccuguaccacccgauccagauucuggccgacuaccugaccuugcaagagcacuacagcucacugaagggcuugacccugagcuggaucggcgacggaaacaacauucugcauucgaucaugauguccgcggccaaguucggaaugcaucugcaggccgcaacucccaagggauacgaaccugaugcguccgugacuaagcuggccgagcaguacgcaaaggaaaacggcaccaagcugcugcugaccaacgacccgcucgaagcugcccacggagggaacgugcucauuaccgacacuuggaucuccauggggcaggaagaagagaagaagaagcggcuccaggcauuccaggguuaccaggucaccaugaaaacggccaaaguggccgcuucggauuggacuuuccuccacugccuuccccgcaaaccugaggaaguggaugaugaaguguucuacuccccacgcucccucguguuccccgaggccgagaaucggaaguggaccauuauggccgugauggugucacugcugaccgacuacagcccccaacugcaaaagccgaaguucuga(seqidno:7)

在一些实施例中，合适的mrna可为如seqidno:8中所示的密码子优化的序列。

augcuguucaaccuccggauccuccucaacaacgccgcguuccgcaacggccacaacuucaugguccggaauuuccgaugcggacagccacugcagaacaagguccagcugaagggccgggacuugcugacucucaagaacuuuaccggggaagaaaucaaguacaugcuguggcuuuccgccgaccugaaguucagaaucaagcagaagggcgaauaucucccccugcugcaaggaaagagccugggcaugauuuucgagaagagaucgacacgcacccggcuguccaccgagacuggguuugcccugcugggaggacacccguguuuccugaccacccaagauauccaucucggagugaacgaaucccuuacugacacugcccgcguguuguccuccauggcugaugcagugcucgcucggguguacaagcagagcgaccuggacacucuggcgaaggaagccucaauuccuaucauuaacgggcugucggaccuguaccacccgauccagauucuggccgacuaccugacccugcaagaacacuacucaagccugaagggucuuacccuguccuggaucggcgacggcaacaacauccugcacuccaucaugaugucggccgcgaaguucggaaugcaccuccaagcagcgacuccgaaggguuacgagccagaugccuccgugaccaagcuggcggagcaguacgcuaaggaaaacggaaccaagcugcugcucacuaacgacccguuggaagccgcccaugguggaaaugugcugaucacggauaccuggaucagcaugggccaggaggaagagaagaagaaaaggcuccaggccuuccaaggguaccaggucaccaugaaaaccgccaaagucgccgcauccgauuggaccuuccuccacugccugccucggaagccugaagaggucgacgacgaaguguucuacucuccccgcucccuuguguuccccgaggccgagaacaggaaguggaccauuauggccgugauggugucgcuccugaccgacuacagcccgcagcugcagaagcccaaguucuga(seqidno:8)

在一些实施例中，合适的mrna可为如seqidno:9中所示的密码子优化的序列。

augcuguucaaucuucggauccugcugaacaacgccgccuuucggaacgggcacaacuucaugguccgcaacuuccgcuguggacagccgcugcagaacaagguccagcuuaagggccgggaucuccugacccugaagaacuuuaccggagaagaaaucaaguacaugcucuggcugagcgccgaccucaaguuccggauuaagcagaagggggaguaccucccgcugcuucaaggaaagucccuggggaugaucuucgagaagcggagcacuaggaccaggcugucgaccgaaacgggcuuugcacugcuggguggacacccaugcuuccugaccacccaagauauucaucucggcgugaacgaauccuugacugacacugcgcgcguccucucaucgauggcugaugccguguuggcuagaguguacaagcagucagaccuggacacucuggcuaaggaagccuccauuccgaucaucaacggccuguccgaccuguaccacccgauucagauucuggccgacuaccugacccugcaagagcacuauucgagccuuaaaggguugacccuguccuggaucggcgacggaaacaauaucuugcacuccauuaugauguccgccgccaaguucggcaugcaucuccaagccgcgacuccuaaggguuacgagcccgacgcauccgugacaaaacuggccgagcaguacgcgaaggaaaacgguaccaagcuccugcugaccaaugauccucucgaggcugcgcacggaggaaacgugcucaucaccgacaccuggaucagcaugggacaggaagaggaaaagaaaaagcgccugcaggcauuccagggcuaccaagucacuaugaaaaccgccaaaguggccgccucggauuggaccuuccuucacugccugccaagaaagccugaggaaguggacgacgaaguguucuacuccccccgcucucucguguuccccgaggccgagaaccggaaguggaccaucauggccgugauggugucacugcucacugacuacagcccgcagcugcagaagcccaaguucuaa(seqidno:9)

在一些实施例中，合适的mrna可为如seqidno:10中所示的密码子优化的序列。

augcuguucaaccuccggauucugcugaacaacgccgcuuuccgcaacggccacaauuucaugguccggaacuucagaugcggccagccguugcagaacaagguccagcuuaagggacgcgaucugcugacccugaagaacuucaccggagaggaaaucaaguauaugcuguggcucucggccgaccugaaguucaggaucaagcagaagggggaguaccucccgcuguugcaaggaaagucccugggcaugauuuucgagaagcgcucaacucgcaccaggcucuccaccgaaacugguuuugcccuucugggcggucauccuugcuuucugacgacccaggacauucaccucggagugaaugagagccugaccgacacugccagagugcuguccuccauggcggaugcaguguuggcgcggguguacaagcagucagaccuggacacccuggcgaaggaagcgucaauccccaucauuaacggacugagcgaccuguaccacccgauccagauccucgccgacuaccugacucuccaagaacacuacucgucccugaaagggcugaccuugagcuggaucggcgacggcaacaacauccugcauuccaucaugaugagcgccgccaaguucggaaugcaccuucaagccgcaacaccgaagggcuacgagccggaugccucggugaccaagcuggccgagcaguacgccaaggaaaacgggaccaagcugcugcucacuaacgacccucuggaagcugcucacgggggaaacgugcugaucaccgacaccuggauuuccaugggacaggaagaagagaaaaagaagcggcuucaggcguuccaggguuaccaagucaccaugaaaaccgccaaaguggcagccagcgacuggacuuuccugcauugucucccucggaagccugaggaaguggaugacgaaguguuuuacucuccccgcucccugguguuccccgaggccgagaaccggaaguggacuaucauggccgugauggugucccuccugaccgauuacuccccacaacugcagaagcccaaguucuga(seqidno:10)

另外的示例性mrna序列在下文实例部分中描述，例如，seqidno:4、seqidno:14和seqidno:15，所有这些都包括构成密码子优化的otc编码mrna的5'和3'非翻译区。

在一些实施例中，合适的mrna序列可为人otc蛋白的mrna序列的同源物或类似物。例如，人otc蛋白的同源物或类似物可为经修饰的人otc蛋白，与野生型或天然存在的人otc蛋白相比，其含有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留基本的otc蛋白活性。在一些实施例中，适合于本发明的mrna编码与seqidno:5至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源的氨基酸序列。在一些实施例中，适合于本发明的mrna编码与人otc蛋白基本上相同的蛋白质。在一些实施例中，适合于本发明的mrna编码与seqidno:5至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施例中，适合于本发明的mrna编码人otc蛋白的片段或部分。在一些实施例中，适合于本发明的mrna编码人otc蛋白的片段或部分，其中所述蛋白质的片段或部分仍保持与野生型蛋白的那种类似的otc活性。在一些实施例中，适合于本发明的mrna具有与seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:14或seqidno:15至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的核苷酸序列。

在一些实施例中，合适的mrna编码融合蛋白，所述融合蛋白包含与另一种蛋白质融合的otc蛋白的全长、片段或部分(例如，n或c末端融合物)。在一些实施例中，与编码otc蛋白的全长、片段或部分的mrna融合的蛋白质编码信号序列或细胞靶向序列。

递送媒介物

根据本发明，如本文所述的编码otc蛋白(例如，otc蛋白的全长、片段或部分)的mrna可作为裸露rna(未包装的)或经由递送媒介物递送。如本文使用的，术语“递送媒介物”、“转移媒介物”、“纳米颗粒”或语法等价物可互换使用。

在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna可经由单一递送媒介物递送。在一些实施例中，编码otc蛋白的mrna可经由各自具有不同组成的一种或多种递送媒介物递送。根据各种实施例，合适的递送媒介物包括但不限于基于聚合物的载体，例如聚乙烯亚胺(pei)、脂质纳米颗粒和脂质体、纳米脂质体、含神经酰胺的纳米脂质体、蛋白脂质体、天然和合成衍生的外来体两者、天然的、合成和半合成板层体、纳米颗粒、磷酸钙-硅酸盐纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米晶颗粒、半导体纳米颗粒、聚(d-精氨酸)、溶胶-凝胶、纳米树枝状聚合物、淀粉基递送系统、胶束、乳液、类脂质体(noisome)、多结构域嵌段聚合物(乙烯基聚合物、聚丙基丙烯酸聚合物、动态聚缀合物)、干粉制剂、质粒、病毒、磷酸钙核苷酸、适体、肽和其它载体标签。

脂质体递送媒介物

在一些实施例中，合适的递送媒介物是脂质体递送媒介物，例如脂质纳米颗粒。如本文使用的，脂质体递送媒介物，例如脂质纳米颗粒，通常表征为微观囊泡，其具有通过一个或多个双层膜与外部介质隔离的内部水性空间。脂质体的双层膜通常由两亲分子形成，所述两亲分子例如合成或天然源的脂质，其包含空间上分离的亲水和疏水结构域(lasic,trendsbiotechnol.,16:307-321,1998)。脂质体的双层膜也可由两亲聚合物和表面活性剂(例如，聚合物囊泡(polymerosome)、类脂质体等)形成。在本发明的上下文中，脂质体递送媒介物通常作用于将所需mrna转运至靶细胞或组织。

阳离子脂质

在一些实施例中，脂质体可包含一种或多种阳离子脂质。如本文使用的，短语“阳离子脂质”指许多脂质物质中的任一种，其在选择的ph(例如生理ph)下具有净正电荷。在文献中已描述了几种阳离子脂质，其中许多是商购可得的。用于本发明的组合物和方法中的特别合适的阳离子脂质包括国际专利公开wo2010/053572(且特别是，在段落[00225]处描述的ci2-200)和wo2012/170930中描述的那些，所述两个专利均以引用的方式并入本文。在某些实施例中，本发明的组合物和方法采用脂质纳米颗粒，其包含于2012年3月29日提交的美国临时专利申请61/617,468(以引用的方式并入本文)中描述的可电离的阳离子脂质，例如(15z,18z)-n,n-二甲基-6-(9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(hgt5000)、(15z,18z)-n,n-二甲基-6-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15,18-三烯-1-胺(hgt5001)和(15z,18z)-n,n-二甲基-6-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(hgt5002)。

在一些实施例中，提供的脂质体包括于2012年10月26日提交的wo2013/063468、以及于2014年3月14日提交的美国临时申请61/953,516中描述的阳离子脂质，所述两个专利均以引用的方式并入本文。

在一些实施例中，阳离子脂质包含式i-c1-a的化合物：

或其药学可接受的盐，其中：

每个r²独立地为氢或c1-3烷基；

每个q独立地为2至6；

每个r'独立地为氢或c1-3烷基；

并且每个r^l独立地为c8-12烷基。

在一些实施例中，每个r²独立地为氢、甲基或乙基。在一些实施例中，每个r²独立地为氢或甲基。在一些实施例中，每个r²为氢。

在一些实施例中，每个q独立地为3至6。在一些实施例中，每个q独立地为3至5。在一些实施例中，每个q为4。

在一些实施例中，每个r'独立地为氢、甲基或乙基。在一些实施例中，每个r'独立地为氢或甲基。在一些实施例中，每个r'独立地为氢。

在一些实施例中，每个r^l独立地为c8-12烷基。在一些实施例中，每个r^l独立地为n-c8-12烷基。在一些实施例中，每个r^l独立地为c9-11烷基。在一些实施例中，每个r^l独立地为n-c9-11烷基。在一些实施例中，每个r^l独立地为c10烷基。在一些实施例中，每个r^l独立地为n-c10烷基。

在一些实施例中，每个r²独立地为氢或甲基；每个q独立地为3至5；每个r'独立地为氢或甲基；并且每个r^l独立地为c8-12烷基。

在一些实施例中，每个r²为氢；每个q独立地为3至5；每个r'为氢；并且每个r^l独立地为c8-12烷基。

在一些实施例中，每个r²为氢；每个q为4；每个r'为氢；并且每个r^l独立地为c8-12烷基。

在一些实施例中，阳离子脂质包含式i-g的化合物：

或其药学可接受的盐，其中每个r^l独立地为c8-12烷基。在一些实施例中，每个r^l独立地为n-c8-12烷基。在一些实施例中，每个r^l独立地为c9-11烷基。在一些实施例中，每个r^l独立地为n-c9-11烷基。在一些实施例中，每个r^l独立地为c10烷基。在一些实施例中，每个r^l是n-c10烷基。

在特定实施例中，提供的脂质体包括阳离子脂质ckk-e12、或(3,6-双(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮)。ckk-e12的结构显示于下文：

另外的示例性阳离子脂质包括式i的那些：

及其药学可接受的盐，

其中，

r是(“of-00”)，

r是(“of-01”)，

r是(“of-02”)，或

r是(“of-03”)

(参见例如，fenton,owens.等人"bioinspiredalkenylaminoalcoholionizablelipidmaterialsforhighlypotentinvivomrnadelivery."advancedmaterials(2016))。

在一些实施例中，一种或多种阳离子脂质可为n-[l-(2,3-二油氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵或“dotma”(feigner等人(proc.nat'lacad.sci.84,7413(1987)；美国专利号4,897,355)。dotma可单独配制，或者可与中性脂质、二油酰磷脂酰乙醇胺或“dope”或其它阳离子或非阳离子脂质组合到脂质体转移媒介物或脂质纳米颗粒内，并且此类脂质体可用于增强核酸进入靶细胞内的递送。其它合适的阳离子脂质包括例如5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺或“dogs”、2,3-二油氧基-n-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-n,n-二甲基-l-丙胺(propanaminium)或“dospa”(behr等人，proc.nat.'lacad.sci.86,6982(1989)；美国专利号5,171,678；美国专利号5,334,761)、l,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷或“dodap”、l,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷或“dotap”。

另外的示例性阳离子脂质还包括1,2-二硬脂氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷或“dsdma”、1,2-二油氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷或“dodma”、1,2-二亚油氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷或“dlindma”、1,2-二亚油烯氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷或“dlendma”、n-二油基-n,n-二甲基氯化铵或“dodac”、n,n-二硬脂基-n,n-二甲基溴化铵或“ddab”、n-(1,2-二肉豆蔻氧基丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羟乙基溴化铵或“dmrie”、3-二甲氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧丁-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷或“clindma”、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基]-3-二甲基l-l-(顺式,顺式-9',l-2'-十八碳二烯氧基)丙烷或“cplindma”、n,n-二甲基-3,4-二油氧基苄胺或“dmoba”、1,2-n,n'-二油酰基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“docarbdap”、2,3-二亚油酰氧基-n,n-二甲基丙胺或“dlindap”、l,2-n,n'-二亚油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“dlincarbdap”、l,2-二亚油酰基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“dlincdap”、2,2-二亚油酰基-4-二甲基氨基甲基-[l,3]-二氧戊环或“dlin--dma”、2,2-二亚油酰基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环或"dlin-k-xtc2-dma"、以及2-(2,2-二((9z,12z)-十八碳-9,l2-二烯-1-基)-1,3-二氧戊环-4-基)-n,n-二甲基乙胺(dlin-kc2-dma))(参见，wo2010/042877；semple等人，naturebiotech.28:172-176(2010))、或其混合物。(heyes,j.等人，jcontrolledrelease107:276-287(2005)；morrissey,dv.等人，nat.biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；pct公开wo2005/121348a1)。在一些实施例中，一种或多种阳离子脂质包含咪唑、二烷基氨基或胍鎓部分中的至少一种。

在一些实施例中，一种或多种阳离子脂质可选自xtc(2,2-二亚油酰基-4-二甲基氨基乙基-1-[1,3]-二氧戊环)、mc3(((6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯)、alny-100((3ar,5s,6as)-n,n-二甲基-2,2-二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢-3ah-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺))、nc98-5(4,7,13-三(3-氧代-3)-(十一烷基氨基)丙基)-n1,n16-双十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺)、dodap(1,2-二油基-3-二甲基铵丙烷)、hgt4003(wo2012/170889，其教导以引用的方式整体并入本文)、ice(wo2011/068810，其教导以引用的方式整体并入本文)、hgt5000(美国临时专利申请号61/617,468，其教导以引用的方式整体并入本文)或hgt5001(顺式或反式)(临时专利申请号61/617,468)、氨基醇类脂质如wo2010/053572中公开的那些、dotap(1,2-二油基-3-三甲基铵丙烷)、dotma(1,2-二-o-十八烯基-3-三甲基铵丙烷)、dlindma(heyes,j.；palmer,l.；bremner,k.；maclachlan,i.“cationiclipidsaturationinfluencesintracellulardeliveryofencapsulatednucleicacids”j.contr.rel.2005,107,276-287)、dlin-kc2-dma(semple,s.c.等人“rationaldesignofcationiclipidsforsirnadelivery”naturebiotech.2010,28,172-176)、c12-200(love,k.t.等人“lipid-likematerialsforlow-doseinvivogenesilencing”pnas2010,107,1864-1869)。

在一些实施例中，脂质体中阳离子脂质的百分比可大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％或大于70％。在一些实施例中，阳离子脂质构成按重量计约30-50％(例如，约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％、或约35-40％的脂质体。在一些实施例中，阳离子脂质(例如，ckk-e12)构成按摩尔比计约30％、约35％、约40％、约45％或约50％的脂质体。

非阳离子/辅助脂质

在一些实施例中，提供的脂质体含有一种或多种非阳离子(“辅助”)脂质。如本文使用的，短语“非阳离子脂质”指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文使用的，短语“阴离子脂质”指在选择的ph，例如生理ph下携带净负电荷的许多脂质物质中的任一种。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰磷脂酰甘油(dopg)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(pope)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-羧酸酯(dope-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(dspe)、16-o-单甲基pe、16-o-二甲基pe、18-1-反式pe、l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(sope)、或其混合物。

在一些实施例中，此类非阳离子脂质可单独使用，但优选与其它赋形剂例如阳离子脂质组合使用。在一些实施例中，非阳离子脂质可包含脂质体中存在的总脂质的约5％至约90％、或约10％至约70％的摩尔比。在一些实施例中，非阳离子脂质是中性脂质，即在其下配制和/或施用组合物的条件下不携带净电荷的脂质。在一些实施例中，脂质体中非阳离子脂质的百分比可大于5％、大于10％、大于20％、大于30％或大于40％。

基于胆固醇的脂质

在一些实施例中，提供的脂质体包含一种或多种基于胆固醇的脂质。例如，合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括例如dc-choi(n,n-二甲基-n-乙基甲酰胺基胆固醇)、l,4-双(3-n-油基氨基-丙基)哌嗪(gao等人biochem.biophys.res.comm.179,280(1991)；wolf等人biotechniques23,139(1997)；美国专利号5,744,335)或ice。在一些实施例中，基于胆固醇的脂质可包含脂质体中存在的总脂质的约2％至约30％、或约5％至约20％的摩尔比。在一些实施例中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可大于5％、10％、大于20％、大于30％或大于40％。

peg化脂质

在一些实施例中，提供的脂质体包含一种或多种peg化脂质。例如，聚乙二醇(peg)修饰的磷脂和衍生的脂质，例如衍生的神经酰胺(peg-cer)，包括n-辛酰基-鞘氨醇-l-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](c8peg-2000神经酰胺)的使用也由本发明考虑与一种或多种阳离子组合，并且在一些实施例中，连同包含脂质体的其它脂质一起。考虑的peg-修饰的脂质包括但不限于长度高达5kda的聚乙二醇链，其与具有c6-c20长度的烷基链的脂质共价附着。在一些实施例中，peg修饰的或peg化的脂质是peg化的胆固醇或peg-2k。此类组分的添加可防止复杂的聚集，并且还可提供用于增加循环寿命和增加脂质-核酸组合物对靶细胞的递送的手段(klibanov等人(1990)febsletters,268(1):235-237)，或者它们可选择为在体内快速更换制剂(参见美国专利号5,885,613)。

在一些实施例中，特别有用的可交换脂质是具有较短酰基链(例如，c14或c18)的peg-神经酰胺。本发明的peg修饰的磷脂和衍生的脂质可包含脂质体中存在的总脂质的约0％至约15％、约0.5％至约15％、约1％至约15％、约4％至约10％、或约2％的摩尔比。

根据各种实施例，包含脂质纳米颗粒的阳离子脂质、非阳离子脂质和/或peg修饰的脂质的选择，以及这些脂质与彼此的相对摩尔比基于所选择的脂质的特征、预期靶细胞的性质、待递送的mrna的特征。另外的考虑包括例如烷基链的饱和度，以及所选择的脂质的大小、电荷、ph、pka、融合性和毒性。因此，可相应地调节摩尔比。

聚合物

在一些实施例中，使用聚合物作为载体，单独或与包括本文所述的各种脂质的其它载体组合，配制合适的递送媒介物。因此，在一些实施例中，如本文使用的，脂质体递送媒介物还涵盖含有聚合物的纳米颗粒。合适的聚合物可包括例如聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、海藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、鱼精蛋白、peg化鱼精蛋白、pll、peg化pll和聚乙烯亚胺(pei)。当存在pei时，它可为分子量范围为10至40kda的支化pei，例如25kda支化pei(sigma#408727)。

用于本发明的合适脂质体可包括以各种比率的本文所述的任何阳离子脂质、非阳离子脂质、胆固醇脂质、peg化脂质和/或聚合物中的一种或多种。作为非限制性例子，合适的脂质体制剂可包括选自ckk-e12、dope、胆固醇和dmg-peg2k；c12-200、dope、胆固醇和dmg-peg2k；hgt4003、dope、胆固醇和dmg-peg2k；或ice、dope、胆固醇和dmg-peg2k的组合。

在各种实施例中，阳离子脂质(例如，ckk-e12、c12-200、ice和/或hgt4003)构成按摩尔比计约30-60％(例如，约30-55％、约30-50％、约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％、或约35-40％)的脂质体。在一些实施例中，阳离子脂质(例如，ckk-e12、c12-200、ice和/或hgt4003)的百分比为或大于按摩尔比计约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％的脂质体。

在一些实施例中，阳离子脂质/非阳离子脂质/基于胆固醇的脂质/peg化脂质的比率可分别在约30-60:25-35:20-30:1-15之间。在一些实施例中，阳离子脂质/非阳离子脂质/基于胆固醇的脂质/peg化脂质的比率分别为大约40:30:20:10。在一些实施例中，阳离子脂质/非阳离子脂质/基于胆固醇的脂质/peg化脂质的比率分别为大约40:30:25:5。在一些实施例中，阳离子脂质/非阳离子脂质/基于胆固醇的脂质/peg化脂质的比率分别为大约40:32:25:3。在一些实施例中，阳离子脂质/非阳离子脂质/基于胆固醇的脂质/peg化脂质的比率为大约50:25:20:5。

mrna的合成

可根据各种已知方法中的任一种合成根据本发明的mrna。例如，可经由体外转录(ivt)合成根据本发明的mrna。简言之，ivt通常用含有启动子的线性或环状dna模板、核糖核苷酸三磷酸库、可包括dtt和镁离子的缓冲系统、以及适当的rna聚合酶(例如，t3、t7或sp6rna聚合酶)、dna酶i、焦磷酸酶和/或rna酶抑制剂执行。确切条件将根据具体应用而改变。

在一些实施例中，为了制备根据本发明的mrna，在体外转录dna模板。合适的dna模板通常具有用于体外转录的启动子，例如t3、t7或sp6启动子，随后为所需mrna的所需核苷酸序列和终止信号。

经修饰的mrna

在一些实施例中，根据本发明的mrna可合成为未经修饰或经修饰的mrna。通常，修饰mrna以增强稳定性。mrna的修饰可包括例如mrna的核苷酸的修饰。因此，根据本发明的经修饰的mrna可包括例如主链修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施例中，mrna可由天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(经修饰的核苷酸)合成，包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g))或嘧啶(胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)、尿嘧啶(u))，以及作为嘌呤和嘧啶的经修饰的核苷酸类似物或衍生物，例如1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-n-6-异戊烯基-腺嘌呤、n6-甲基-腺嘌呤、n6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-(羧基羟甲基)-尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、n-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、q核苷、β-d-甘露糖基-q核苷、wybutoxosine和氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。这些类似物的制备是本领域技术人员已知的，例如根据美国专利号4,373,071、美国专利号4,401,796、美国专利号4,415,732、美国专利号4,458,066、美国专利号4,500,707、美国专利号4,668,777、美国专利号4,973,679、美国专利号5,047,524、美国专利号5,132,418、美国专利号5,153,319、美国专利号5,262,530和5,700,642，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入。

在一些实施例中，mrna(例如，编码otc的mrna)可含有rna主链修饰。通常，主链修饰是其中包含在mrna中的核苷酸主链的磷酸酯进行化学修饰的修饰。示例性的主链修饰通常包括但不限于来自甲基膦酸酯、甲基氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(例如胞苷5'-o-(1-硫代磷酸酯))、硼烷磷酸酯、带正电荷的胍基团等的修饰，其意指通过其它阴离子、阳离子或中性基团替换磷酸二酯键。

在一些实施例中，mrna(例如，编码otc的mrna)可含有糖修饰。典型的糖修饰是其包含的核苷酸的糖的化学修饰，包括但不限于选自以下的糖修饰：2'-脱氧-2'-氟-寡核糖核苷酸(2'-氟-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氟-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)、2'-脱氧-2'-脱胺-寡核糖核苷酸(2'-氨基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氨基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)、2'-o-烷基寡核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-c-烷基寡核糖核苷酸(2'-o-甲基胞苷5'-三磷酸、2'-甲基尿苷5'-三磷酸)、2'-c-烷基寡核糖核苷酸及其异构体(2'-阿糖胞苷5'-三磷酸、2'-阿糖尿苷5'-三磷酸)或叠氮三磷酸(2'-叠氮基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-叠氮基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)。

在一些实施例中，mrna(例如，编码otc的mrna)可含有核苷酸碱基的修饰(碱基修饰)。含有碱基修饰的经修饰的核苷酸也称为碱基修饰的核苷酸。此类碱基修饰的核苷酸的例子包括但不限于2-氨基-6-氯嘌呤核苷5'-三磷酸、2-氨基腺苷5'-三磷酸、2-硫代胞苷5'-三磷酸、2-硫代尿苷5'-三磷酸、4-硫代尿苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷5'-三磷酸、5-溴胞苷5'-三磷酸、5-溴尿苷5'-三磷酸、5-碘胞苷5'-三磷酸、5-碘尿苷5'-三磷酸、5-甲基胞苷5'-三磷酸、5-甲基尿苷5'-三磷酸、6-氮杂胞苷5'-三磷酸、6-氮杂尿苷5'-三磷酸、6-氯嘌呤核苷5'-三磷酸、7-脱氮腺苷5'-三磷酸、7-脱氮鸟苷5'-三磷酸、8-氮杂腺苷5'-三磷酸、8-叠氮基腺苷5'-三磷酸、苯并咪唑核苷5'-三磷酸、n1-甲基腺苷5'-三磷酸、n1-甲基鸟苷5'-三磷酸、n6-甲基腺苷5'-三磷酸、o6-甲基鸟苷5'-三磷酸、假尿苷5'-三磷酸、嘌呤霉素5'-三磷酸或黄苷5'-三磷酸。

通常，mrna合成包括在n末端(5')末端上添加“帽”和在c末端(3')末端上添加“尾”。帽的存在对于提供对大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性是重要的。“尾”的存在作用于保护mrna免于核酸外切酶降解。

因此，在一些实施例中，mrna(例如，编码otc的mrna)包括5'帽结构。5'帽通常如下添加：首先，rna末端磷酸酶从5'核苷酸中去除一个末端磷酸基，留下两个末端磷酸盐；然后经由鸟苷酸转移酶将鸟苷三磷酸(gtp)加入末端磷酸盐中，产生5'5'5三磷酸键；然后通过甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮甲基化。帽结构的例子包括但不限于m7g(5')ppp(5'(a,g(5')ppp(5')a和g(5')ppp(5')g。

在一些实施例中，mrna(例如，编码otc的mrna)包括3'多聚(a)尾结构。mrna的3'末端上的多聚a尾通常包含约10至300个腺苷核苷酸(例如，约10至200个腺苷核苷酸、约10至150个腺苷核苷酸、约10至100个腺苷核苷酸、约20至70个腺苷核苷酸、或约20至60个腺苷核苷酸)。在一些实施例中，mrna包括3'多聚(c)尾结构。mrna的3'末端上合适的多聚c尾通常包括约10至200个胞嘧啶核苷酸(例如，约10至150个胞嘧啶核苷酸、约10至100个胞嘧啶核苷酸、约20至70个胞嘧啶核苷酸、约20至60个胞嘧啶核苷酸、或约10至40个胞嘧啶核苷酸)。多聚c尾可加入多聚a尾中或可取代多聚a尾。

在一些实施例中，mrna包括5'和/或3'非翻译区。在一些实施例中，5'非翻译区包括影响mrna的稳定性或翻译的一种或多种元件，例如铁应答元件。在一些实施例中，5'非翻译区可为长度约50至500个核苷酸。

在一些实施例中，3'非翻译区包括多腺苷酸化信号、影响mrna在细胞中的定位稳定性的蛋白质的结合位点、或mirna的一个或多个结合位点中的一种或多种。在一些实施例中，3'非翻译区可为长度50至500个核苷酸或更长。

帽结构

在一些实施例中，mrna包括5'帽结构。5'帽通常如下添加：首先，rna末端磷酸酶从5'核苷酸中去除一个末端磷酸基，留下两个末端磷酸盐；然后经由鸟苷酸转移酶将鸟苷三磷酸(gtp)加入末端磷酸盐中，产生5'5'5三磷酸键；然后通过甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮甲基化。帽结构的例子包括但不限于m7g(5')ppp(5'(a,g(5')ppp(5')a和g(5')ppp(5')g。

天然存在的帽结构包含7-甲基鸟苷，其经由三磷酸桥连接至第一转录核苷酸的5'末端，导致m⁷g(5')ppp(5')n的二核苷酸帽，其中n是任何核苷。在体内，帽是酶促添加的。将帽加入核中且由酶鸟苷酰转移酶催化。帽对rna的5'末端的添加在转录起始后立即发生。末端核苷通常是鸟苷，并且与所有其它核苷酸相反定向，即g(5')ppp(5')gpnpnp。

通过体外转录产生的mrna的常见帽是m⁷g(5')ppp(5')g，其已用作在体外使用t7或sp6rna聚合酶的转录中的二核苷酸帽，以获得在其5’末端中具有帽结构的mrna。用于体外合成加帽的mrna的流行方法采用预形成的二核苷酸形式m⁷g(5')ppp(5')g(“m⁷gpppg”)作为转录起始子。

迄今为止，在体外翻译实验中使用的通常形式的合成二核苷酸帽是抗反向帽类似物(“arca”)或经修饰的arca，其一般是经修饰的帽类似物，其中2'或3”oh基团被替换为-och3。

另外的帽类似物包括但不限于选自以下的化学结构：m⁷gpppg、m⁷gpppa、m⁷gpppc；未甲基化的帽类似物(例如，gpppg)；二甲基化的帽类似物(例如，m^2,7gpppg)、三甲基化的帽类似物(例如，m^2,2^,7gpppg)、二甲基化的对称帽类似物(例如，m⁷gpppm⁷g)、或抗反向帽类似物(例如，arca；m⁷,^2'omegpppg、m⁷²'^dgpppg、m^7,3'omegpppg、m^7,3'dgpppg及其四磷酸盐衍生物)(参见例如，jemielity,j.等人，“novel‘anti-reverse’capanalogswithsuperiortranslationalproperties”,rna,9:1108-1122(2003))。

在一些实施例中，合适的帽是7-甲基鸟苷酸(“m⁷g”)，其经由三磷酸桥连接至第一转录核苷酸的5'末端，导致m⁷g(5')ppp(5')n，其中n是任何核苷。在本发明的实施例中利用的m⁷g帽的优选实施例是m⁷g(5')ppp(5')g。

在一些实施例中，帽是帽0结构。帽0结构缺少与碱基1和2连接的核糖的2'-o-甲基残基。在一些实施例中，帽是帽1结构。帽1结构在碱基2处具有2'-o-甲基残基。在一些实施例中，帽是帽2结构。帽2结构具有与碱基2和3两者附着的2'-o-甲基残基。

本领域已知各种m⁷g帽类似物，其中许多是商购可得的。这些包括上述m⁷gpppg，以及arca3'-och3和2'-och3帽类似物(jemielity,j.等人，rna,9:1108-1122(2003))。用于本发明的实施例中的另外帽类似物包括n7-苄化的二核苷四磷酸类似物(在grudzien,e.等人，rna,10:1479-1487(2004)中描述)、硫代磷酸酯帽类似物(在grudzien-nogalska,e.等人，rna,13:1745-1755(2007)中描述)、以及以引用的方式并入本文的美国专利号8,093,367和8,304,529中描述的帽类似物(包括生物素化的帽类似物)。

尾结构

通常，“尾”的存在作用于保护mrna免于核酸外切酶降解。多聚a尾视为稳定自然信使和合成感知mrna。因此，在某些实施例中，可将长多聚a尾加入mrna分子中，因此致使mrna更稳定。多聚a尾可使用各种领域公认的技术添加。例如，可使用多聚a聚合酶将长多聚a尾加入合成或体外转录的rna中(yokoe等人naturebiotechnology.1996；14:1252-1256)。转录载体也可编码长多聚a尾。另外，多聚a尾可通过直接从pcr产物转录而加入。多聚a也可用rna连接酶连接到有义rna的3'末端(参见例如，molecularcloningalaboratorymanual，第2版，由sambrook、fritsch和maniatis编辑(coldspringharborlaboratorypress：1991版))。

在一些实施例中，mrna包括3'多聚(a)尾结构。通常，多聚a尾的长度可为至少约10、50、100、200、300、400、至少500个核苷酸。在一些实施例中，mrna的3'末端上的多聚a尾通常包括约10至300个腺苷核苷酸(例如，约10至200个腺苷核苷酸、约10至150个腺苷核苷酸、约10至100个腺苷核苷酸、约20至70个腺苷核苷酸、或约20至60个腺苷核苷酸)。在一些实施例中，mrna包括3'多聚(c)尾结构。mrna的3'末端上合适的多聚c尾通常包括约10至200个胞嘧啶核苷酸(例如，约10至150个胞嘧啶核苷酸、约10至100个胞嘧啶核苷酸、约20至70个胞嘧啶核苷酸、约20至60个胞嘧啶核苷酸、或约10至40个胞嘧啶核苷酸)。多聚c尾可加入多聚a尾中或可取代多聚a尾。

在一些实施例中，调节多聚a或多聚c尾的长度，以控制本发明的经修饰的有义mrna分子的稳定性，并且因此控制蛋白质的转录。例如，因为多聚a尾的长度可影响有义mrna分子的半衰期，所以可调节多聚a尾的长度，以修饰mrna对核酸酶的抗性水平，且从而控制靶细胞中的多核苷酸表达和/或多肽产生的时间过程。

5'和3'非翻译区

示例性的3'和/或5’utr序列可源自稳定的mrna分子(例如，珠蛋白、肌动蛋白、gapdh、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)，以增加感觉mrna分子的稳定性。例如，5’utr序列可包括cmv立即早期1(ie1)基因的部分序列或其片段，以改善核酸酶抗性和/或改善多核苷酸的半衰期。还考虑了将编码人生长激素(hgh)或其片段的序列包括在多核苷酸(例如mrna)的3'末端或非翻译区，以进一步稳定多核苷酸。一般地，这些修饰相对于其未修饰的对应物改善了多核苷酸的稳定性和/或药代动力学性质(例如，半衰期)，并且包括例如为改善此类多核苷酸对体内核酸酶消化的抗性而进行的修饰。

脂质体的形成

用于本发明的组合物中的脂质体转移媒介物可通过本领域目前已知的各种技术制备。用于所提供的组合物中的脂质体可通过本领域目前已知的各种技术制备。例如，多层囊泡(mlv)可根据常规技术制备，例如通过将脂质溶解在合适的溶剂中，将所选择的脂质沉积在合适的器皿或容器的内壁上，然后蒸发溶剂以在容器的内部上留下薄膜或喷雾干燥。然后可用涡旋运动将水相加入容器中，这导致mlv的形成。然后可通过多层囊泡的均质化、超声处理或挤出来形成单层囊泡(ulv)。另外，可通过去污剂去除技术形成单层囊泡。

在某些实施例中，提供的组合物包含脂质体，其中mrna在脂质体的两个表面上结合且包封在相同脂质体内。例如，在本发明的组合物的制备过程中，阳离子脂质体可通过静电相互作用与mrna结合。例如，在本发明的组合物的制备过程中，阳离子脂质体可通过静电相互作用与mrna结合。

在一些实施例中，本发明的组合物和方法包含包封在脂质体中的mrna。在一些实施例中，一种或多种mrna物种可包封在相同的脂质体中。在一些实施例中，一种或多种mrna物种可包封在不同的脂质体中。在一些实施例中，mrna包封在一种或多种脂质体中，所述脂质体在其脂质组成、脂质组分的摩尔比、大小、电荷(ζ电位)、靶向配体和/或其组合方面不同。在一些实施例中，一种或多种脂质体可具有不同组成的阳离子脂质、中性脂质、peg修饰的脂质和/或其组合。在一些实施例中，一种或多种脂质体可具有不同摩尔比的用于产生脂质体的阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和peg修饰的脂质。

将所需mrna掺入脂质体内的过程经常称为“加载”。示例性方法在lasic等人，febslett.,312:255-258,1992中描述，所述参考文献以引用的方式并入本文。掺入脂质体的核酸可完全或部分地位于脂质体的内部空间中、脂质体的双层膜内、或者与脂质体膜的外表面结合。将核酸掺入脂质体内在本文中也称为“包封”，其中核酸完全包含在脂质体的内部空间内。将mrna掺入转移媒介物(例如脂质体)内的目的经常是保护核酸免于环境，所述环境可能含有降解核酸的酶或化学物质和/或促使核酸快速排泄的系统或受体。相应地，在一些实施例中，合适的递送媒介物能够增强其中包含的mrna的稳定性和/或促进mrna递送至靶细胞或组织。

脂质体大小

根据本发明的合适的脂质体可以各种大小制备。在一些实施例中，提供的脂质体可制备得小于先前已知的包封mrna的脂质体。在一些实施例中，脂质体的尺寸降低与更有效的mrna递送相关。适当脂质体大小的选择可考虑到靶细胞或组织的位点，以及在某种程度上对于其制备脂质体的应用。

在一些实施例中，选择合适大小的脂质体以促进由mrna编码的多肽的全身分布。在一些实施例中，可能期望限制mrna对某些细胞或组织的转染。例如，为了靶向肝细胞，脂质体的大小可设定为使得其尺寸小于肝脏中衬里肝血窦的内皮层的开窗；在这种情况下，脂质体可容易地穿透这种内皮开窗以到达靶肝细胞。

可替代地或另外地，脂质体的大小可设定为使得脂质体的尺寸具有足够的直径，以限制或明确地避免分布到某些细胞或组织内。例如，脂质体的大小可设定为使得其尺寸大于衬里肝血窦的内皮层的开窗，从而限制脂质体对肝细胞的分布。

在一些实施例中，脂质体的大小由脂质体颗粒的最大直径的长度确定。在一些实施例中，合适的脂质体具有的大小不大于约250nm(例如，不大于约225nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm或50nm)。在一些实施例中，合适的脂质体具有的大小范围为约10-250nm(例如，范围为约10–225nm、10–200nm、10–175nm、10–150nm、10-125nm、10–100nm、10–75nm或10–50nm)。在一些实施例中，合适的脂质体具有的大小范围为约100-250nm(例如，范围为约100–225nm、100–200nm、100–175nm、100–150nm)。在一些实施例中，合适的脂质体具有的大小范围为约10-100nm(例如，范围为约10–90nm、10–80nm、10–70nm、10–60nm或10–50nm)。在一个特定实施例中，合适的脂质体具有小于约100nm的尺寸。

本领域已知的各种替代方法可用于测定脂质体群体的大小。一种这样的尺寸测定方法在美国专利号4,737,323中描述，所述专利以引用的方式并入本文。通过浴或探针超声处理对脂质体悬浮液进行超声处理产生渐进的尺寸减少，降至直径小于约0.05微米的小ulv。均质化是依靠剪切能量将大脂质体断裂成较小脂质体的另一种方法。在典型的均质化程序中，mlv通过标准乳液均化器再循环，直到观察到选择的脂质体大小，通常在约0.1至0.5微米之间。脂质体的大小可通过准电光散射(qels)进行测定，如以引用的方式并入本文的bloomfield,ann.rev.biophys.bioeng.,10:421-150(1981)中所述。通过所形成的脂质体的超声处理可减少平均脂质体直径。间歇性超声处理循环可与qels评价交替，以指导有效的脂质体合成。

药物组合物

为了促进mrna在体内的表达，可将递送媒介物如脂质体与一种或多种另外的核酸、载体、靶向配体或稳定剂组合，或在药理学组合物中配制，在所述药理学组合物中它与合适的赋形剂混合。用于配制和施用药物的技术可在"remington'spharmaceuticalsciences,"mackpublishingco.,easton,pa.，最新版本中找到。

所提供的脂质体包封的或结合的mrna，以及含有其的组合物，可根据当前的医学实践施用且给药，考虑到受试者的临床状况、施用部位和施用方法、施用的时间安排、受试者的年龄、性别、体重以及与本领域普通技术人员相关的其它因素。用于本文目的的“有效量”可通过如实验临床研究、药理学、临床和医学领域的普通技术人员已知的此类相关考虑来确定。在一些实施例中，所施用的量有效实现如本领域技术人员选择作为疾病进展、退化或改善的适当测量的症状和其它指标的至少一些稳定、改善或消除。例如，合适的量和给药方案是引起至少瞬时蛋白质(例如酶)产生的那种。

合适的施用途径包括例如经口、直肠、阴道、透粘膜、肺部包括气管内或吸入、或肠内施用；肠胃外递送，包括皮内、透皮(局部)、肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内或鼻内。在特定实施例中，肌内施用针对选自骨骼肌、平滑肌和心肌的肌肉。在一些实施例中，施用导致mrna递送至肌细胞。在一些实施例中，施用导致mrna递送至肝细胞(即肝脏细胞)。在一个特定实施例中，肌内施用导致mrna递送至肌细胞。

可替代地或另外地，本发明的脂质体包封的mrna和组合物可以局部而不是全身方式施用，例如，经由将药物组合物直接注射到靶组织内，优选以持续释放制剂。根据要靶向的组织，局部递送可以各种方式受到影响。例如，可吸入含有本发明的组合物的气溶胶(用于鼻、气管或支气管递送)；例如，可将本发明的组合物注射到损伤、疾病表现或疼痛部位内；组合物可在用于经口、气管或食道应用的锭剂中提供；可以用于施用于胃或肠的液体、片剂或胶囊形式供应，可以用于直肠或阴道应用的栓剂形式供应；或者甚至可通过使用乳膏、滴剂或甚至注射剂递送到眼。含有与治疗分子或配体复合的所提供的组合物的制剂甚至可通过外科手术施用，例如与可允许组合物从植入部位扩散到周围细胞的聚合物或其它结构或物质结合。可替代地，它们可通过外科手术施用，而无需使用聚合物或支持物。

本发明的方法考虑了本文所述的治疗剂(例如，编码otc蛋白的mrna)的治疗有效量的单次施用以及多次施用。治疗剂可以规则间隔施用，取决于受试者状况(例如，otc缺乏症)的性质、严重性和程度。在一些实施例中，本发明的治疗剂(例如，编码otc蛋白的mrna)的治疗有效量可以规则间隔(例如，每年一次、每六个月一次、每五个月一次、每三个月一次、双月(每两个月一次)、每月(每月一次)、每两周(每两周一次)、每月两次、每30天一次、每28天一次、每14天一次、每10天一次、每7天一次、每周、每周两次、每天或连续)定期鞘内施用。

在一些实施例中，提供的脂质体和/或组合物被配制成使得它们适合于其中包含的mrna的延长释放。此类延长释放的组合物可以延长的给药间隔方便地施用于受试者。例如，在一个实施例中，本发明的组合物每天两次、每天或每隔一天施用于受试者。在一个优选实施例中，本发明的组合物每周两次、每周一次、每7天一次、每10天一次、每14天一次、每28天一次、每30天一次、每两周一次、每三周一次、或更优选每四周一次、每月一次、每月两次、每六周一次、每八周一次、每隔一个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每六个月一次、每八个月一次、每九个月一次或每年一次施用于受试者。还考虑了配制用于贮存施用(例如，肌内、皮下、玻璃体内)的组合物和脂质体，以经过延长的时间段递送或释放mrna。优选地，所采用的延长释放手段与对mrna进行的修饰组合，以增强稳定性。

如本文使用的，术语“治疗有效量”在很大程度上基于本发明药物组合物中包含的治疗剂的总量来确定。一般地，治疗有效量足以实现对受试者有意义的益处(例如，治疗、调节、治愈、预防和/或改善otc缺乏症)。例如，治疗有效量可为足以实现所需疗效和/或预防效果的量。一般地，施用于有此需要的受试者的治疗剂(例如，编码otc蛋白的mrna)的量将取决于受试者的特征。这些特征包括受试者的状况、疾病严重性、一般健康状况、年龄、性别和体重。本领域普通技术人员将能够容易地根据这些和其他相关因素确定适当剂量。另外，可任选地采用客观和主观测定来确定最佳剂量范围。

治疗有效量通常以可包含多个单位剂量的给药方案施用。对于任何特定的治疗性蛋白，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可例如根据施用途径、与其他药物试剂的组合而变。另外，用于任何特定患者的特定治疗有效量(和/或单位剂量)可取决于各种因素，包括待治疗的病症和病症的严重性；所采用的特定药物试剂的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；所采用的特定蛋白质的施用时间、施用途径和/或排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及医学领域中众所周知的相似因素。

在一些实施例中，治疗有效剂量范围为约0.005mg/kg体重至500mg/kg体重，例如约0.005mg/kg体重至400mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至300mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至200mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至100mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至90mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至80mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至70mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至60mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至50mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至40mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至30mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至25mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至20mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至15mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至10mg/kg体重。

在一些实施例中，治疗有效剂量大于约0.1mg/kg体重、大于约0.5mg/kg体重、大于约1.0mg/kg体重、大于约3mg/kg体重、大于约5mg/kg体重、大于约10mg/kg体重、大于约15mg/kg体重、大于约20mg/kg体重、大于约30mg/kg体重、大于约40mg/kg体重、大于约50mg/kg体重、大于约60mg/kg体重、大于约70mg/kg体重、大于约80mg/kg体重、大于约90mg/kg体重、大于约100mg/kg体重、大于约150mg/kg体重、大于约200mg/kg体重、大于约250mg/kg体重、大于约300mg/kg体重、大于约350mg/kg体重、大于约400mg/kg体重、大于约450mg/kg体重、大于约500mg/kg体重。在一个特定实施例中，治疗有效剂量为1.0mg/kg。在一些实施例中，肌内或静脉内施用1.0mg/kg的治疗有效剂量。

本文还考虑了包含本文公开的一种或多种脂质体的冻干药物组合物和使用此类组合物的相关方法，如例如在于2012年6月8日提交的国际专利申请pct/us12/41663中公开的，所述美国临时申请的教导以引用的方式整体并入本文。例如，根据本发明的冻干药物组合物可在施用前重构或可在体内重构。例如，冻干的药物组合物可配制成适当的剂型(例如皮内剂型，例如圆盘、棒或膜)，并且这样施用使得剂型通过个体的体液在体内随着时间过去再水合。

提供的脂质体和组合物可施用于任何所需组织。在一些实施例中，通过提供的脂质体或组合物递送的otcmrna在其中施用脂质体和/或组合物的组织中表达。在一些实施例中，递送的mrna在与其中施用脂质体和/或组合物的组织不同的组织中表达。递送的mrna可在其中递送和/或表达的示例性组织包括但不限于肝脏、肾脏、心脏、脾、血清、脑、骨骼肌、淋巴结、皮肤和/或脑脊髓液。

在一些实施例中，与治疗前的基线表达水平相比，施用所提供的组合物导致来自受试者的生物样品中的otcmrna表达水平增加。通常，在治疗前立即测量基线水平。生物样品包括例如全血、血清、血浆、尿和组织样品(例如肌肉、肝脏、皮肤成纤维细胞)。在一些实施例中，与紧在治疗前的基线水平相比，施用所提供的组合物导致otcmrna表达水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，与未治疗的受试者中的otcmrna表达水平相比，施用所提供的组合物导致otcmrna表达水平增加。

根据本发明，与治疗前的基线otc蛋白表达或活性水平相比，当定期施用时，所提供的组合物的治疗有效剂量导致受试者中的otc蛋白表达或活性水平增加。通常，otc蛋白质表达或活性水平在从受试者获得的生物样品中测量，所述生物样品例如血液、血浆或血清、尿或固体组织提取物。在治疗前立即测量基线水平。在一些实施例中，与治疗前的基线水平相比，施用所提供的组合物导致生物样品(例如，血浆/血清或尿)中的otc蛋白表达或活性水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，与治疗前至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、或至少15天的基线水平相比，施用所提供的组合物导致生物样品(例如，血浆/血清或尿)中的otc蛋白表达或活性水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。

根据各种实施例，可调整递送的mrna的表达时机，以适应特定的医学需要。在一些实施例中，由递送的mrna编码的蛋白质的表达在所提供的脂质体施用后1、2、3、6、12、24、48、72、96小时、1周、2周或1个月是可检测的。

在一些实施例中，与治疗前的基线瓜氨酸产生相比，当定期施用时，所提供的组合物的治疗有效剂量导致受试者中的瓜氨酸产生增加。通常，治疗之前或治疗之后的瓜氨酸水平可在从受试者获得的生物样品中测量，所述生物样品例如血液、血浆或血清、尿或固体组织提取物。在一些实施例中，与基线瓜氨酸水平相比，根据本发明的治疗导致生物样品(例如，血浆、血清或尿)中分别为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍或3倍的瓜氨酸水平增加。

根据本发明，当定期施用时，所提供的组合物的治疗有效剂量导致otc缺乏症的至少一种症状或特征在强度、严重性或频率方面减少或者已延迟发作。在一些实施例中，与治疗前的基线乳清酸水平相比，当定期施用时，所提供的组合物的治疗有效剂量导致受试者中的乳清酸水平减少。在一些实施例中，与治疗前的基线氨水平相比，当定期施用时，所提供的组合物的治疗有效剂量导致受试者中的氨水平减少。在一些实施例中，与治疗前的基线谷氨酰胺水平相比，当定期施用时，所提供的组合物的治疗有效剂量导致受试者中的谷氨酰胺水平减少。

通常，治疗之前或治疗之后的乳清酸、氨或谷氨酰胺水平可在从受试者获得的生物样品中测量，所述生物样品例如血液、血浆、血清、尿或固体组织提取物。在治疗前立即测量基线乳清酸、氨或谷氨酰胺水平。在一些实施例中，与基线乳清酸、氨或谷氨酰胺水平相比，根据本发明的治疗导致从受试者获得的生物样品(例如，血液、血清或尿)中的乳清酸、氨或谷氨酰胺水平分别减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，当定期施用时，所提供的组合物的治疗有效剂量导致血浆氨水平减少至小于约500μmol/l、400μmol/l、300μmol/l、200μmol/l、150μmol/l或100μmol/l。在一些实施例中，当定期施用时，所提供的组合物的治疗有效剂量导致血浆谷氨酰胺水平减少至小于约800μmol/l、700μmol/l或600μmol/l。在一些实施例中，当定期施用时，所提供的组合物的治疗有效剂量导致尿乳清酸水平减少至小于约20μmol/mmol肌酸酐、15μmol/mmol肌酸酐或10μmol/mmol肌酸酐。

在一些实施例中，与治疗前的基线水平相比，施用所提供的组合物导致受试者的肝脏中的otc蛋白水平增加。通常，在治疗前立即测量基线水平。在一些实施例中，与治疗前的基线水平相比，施用所提供的组合物导致肝脏中的otc蛋白质水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，与未治疗的受试者的肝脏中的otc蛋白质水平相比，施用所提供的组合物导致肝脏中的otc蛋白质水平增加。

在一些实施例中，与治疗前的基线水平相比，施用所提供的组合物导致受试者的肝脏细胞(例如肝细胞)中的otc蛋白水平增加。通常，在治疗前立即测量基线水平。在一些实施例中，与治疗前的基线水平相比，施用所提供的组合物导致肝脏细胞中的otc蛋白质水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，与未治疗的受试者的肝脏细胞中的otc蛋白质水平相比，施用所提供的组合物导致肝脏细胞中的otc蛋白质水平增加。

在一些实施例中，与治疗前的基线水平相比，施用所提供的组合物导致受试者的血浆或血清中的otc蛋白水平增加。通常，在治疗前立即测量基线水平。在一些实施例中，与治疗前的基线水平相比，施用所提供的组合物导致血浆或血清中的otc蛋白质水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，与未治疗的受试者的血浆或血清中的otc蛋白质水平相比，施用所提供的组合物导致血浆或血清中的otc蛋白质水平增加。

在一些实施例中，与治疗前的基线水平相比，施用所提供的组合物导致来自受试者的生物样品中的otc酶活性增加。通常，在治疗前立即测量基线水平。生物样品包括例如全血、血清、血浆、尿和组织样品(例如肝脏)。在一些实施例中，与紧在治疗前的基线水平相比，施用所提供的组合物导致otc酶活性增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，与未治疗的受试者中的otc酶活性相比，施用所提供的组合物导致otc酶活性增加。

根据各种实施例，可调整递送的mrna的表达时机，以适应特定的医学需要。在一些实施例中，由递送的mrna编码的蛋白质的表达在所提供的脂质体和/或组合物施用后1、2、3、6、12、24、48、72和/或96小时是可检测的。在一些实施例中，由递送的mrna编码的蛋白质的表达在施用后1周、2周和/或1个月是可检测的。

实例

虽然已根据某些实施例特异性地描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但下述实例仅作用于说明本发明的化合物，而不是预期限制其。

实例1.用于otcmrna递送和表达的示例性脂质体制剂

该实例提供了用于在体内有效递送和表达otcmrna的示例性脂质体制剂。

脂质材料

本文描述的制剂包括采用设计为包封编码otc蛋白的mrna的一种或多种阳离子脂质、辅助脂质(例如，非阳离子脂质和/或基于胆固醇的脂质)和peg化脂质的不同比率的多组分脂质混合物。阳离子脂质可包括(但不限于)dotap(1,2-二油基-3-三甲基铵丙烷)、dodap(1,2-二油基-3-二甲基铵丙烷)、dotma(1,2-二-o-十八烷基-3-三甲基铵丙烷)、dlindma(heyes,j.；palmer,l.；bremner,k.；maclachlan,i.“cationiclipidsaturationinfluencesintracellulardeliveryofencapsulatednucleicacids”j.contr.rel.2005,107,276-287)、dlin-kc2-dma(semple,s.c.等人“rationaldesignofcationiclipidsforsirnadelivery”naturebiotech.2010,28,172-176)、c12-200(love,k.t.等人“lipid-likematerialsforlow-doseinvivogenesilencing”pnas2010,107,1864-1869)、ckk-e12(3,6-双(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮)、hgt5000、hgt5001、hgt4003、ice、of-02、基于二烷基氨基的、基于咪唑的、基于胍的等。辅助脂质可包括(但不限于)dspc(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、dppc(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、dope(1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dopc(1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)、dppe(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dmpe(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dopg(2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油))、胆固醇等。聚乙二醇化的脂质可包括(但不限于)共价附着到具有c6-c20长度的烷基链的脂质、长度高达5kda的聚(乙)二醇链。

通过体外转录从编码该基因的质粒dna模板合成密码子优化的人鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)信使rna，其随后为5'帽结构(帽1)(fechter,p.；brownlee,g.g.“recognitionofmrnacapstructuresbyviralandcellularproteins”j.gen.virology2005,86,1239-1249)和如通过凝胶电泳测定的长度大约250个核苷酸的3'聚(a)尾的添加。存在于每种mrna产物中的5'和3'非翻译区分别表示为x和y，并且如所述的定义(见下文)。

示例性密码子优化的人鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)mrna

构建体设计：

x–seqidno:3–y

x–seqidno:7–y

5'和3'utr序列

x(5'utr序列)＝

ggacagaucgccuggagacgccauccacgcuguuuugaccuccauagaagacaccgggaccgauccagccuccgcggccgggaacggugcauuggaacgcggauuccccgugccaagagugacucaccguccuugacacg(seqidno:11)

y(3’utr序列)＝

cggguggcaucccugugaccccuccccagugccucuccuggcccuggaaguugccacuccagugcccaccagccuuguccuaauaaaauuaaguugcaucaagcu(seqidno:12)

或

ggguggcaucccugugaccccuccccagugccucuccuggcccuggaaguugccacuccagugcccaccagccuuguccuaauaaaauuaaguugcaucaaagcu(seqidno:13)

示例性密码子优化的人otcmrna序列包括如详述节段中所述的seqidno:3或seqidno:7。

示例性的全长密码子优化的人鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)信使rna序列显示于下文：

ggacagaucgccuggagacgccauccacgcuguuuugaccuccauagaagacaccgggaccgauccagccuccgcggccgggaacggugcauuggaacgcggauuccccgugccaagagugacucaccguccuugacacgaugcuguucaaccuucggaucuugcugaacaacgcugcguuccggaauggucacaacuucaugguccggaacuucagaugcggccagccgcuccagaacaaggugcagcucaaggggagggaccuccucacccugaaaaacuucaccggagaagagaucaaguacaugcuguggcugucagccgaccucaaauuccggaucaagcagaagggcgaauaccuuccuuugcugcagggaaagucccuggggaugaucuucgagaagcgcagcacucgcacuagacugucaacugaaaccggcuucgcgcugcugggaggacaccccugcuuccugaccacccaagauauccaucugggugugaacgaaucccucaccgacacagcgcgggugcugucguccauggcagacgcgguccucgcccgcguguacaagcagucugaucuggacacucuggccaaggaagccuccauuccuaucauuaauggauuguccgaccucuaccaucccauccagauucuggccgauuaucugacucugcaagaacauuacagcucccugaaggggcuuacccuuucguggaucggcgacggcaacaacauucugcacagcauuaugaugagcgcugccaaguuuggaaugcaccuccaagcagcgaccccgaagggauacgagccagacgccuccgugacgaagcuggcugagcaguacgccaaggagaacggcacuaagcugcugcucaccaacgacccucucgaagccgcccacgguggcaacgugcugaucaccgauaccuggaucuccaugggacaggaggaggaaaagaagaagcgccugcaagcauuucagggguaccaggugacuaugaaaaccgccaaggucgccgccucggacuggaccuucuugcacugucugcccagaaagcccgaagagguggacgacgagguguucuacagcccgcggucgcuggucuuuccggaggccgaaaacaggaaguggacuaucauggccgugauggugucccugcugaccgauuacuccccgcagcugcagaaaccaaaguucuga

cggguggcaucccugugaccccuccccagugccucuccuggcccuggaaguugccacuccagugcccaccagccuuguccuaauaaaauuaaguugcaucaagcu(seqidno:14).

在另一个例子中，全长密码子优化的人鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)信使rna序列显示于下文：

ggguggcaucccugugaccccuccccagugccucuccuggcccuggaaguugccacuccagugcccaccagccuuguccuaauaaaauuaaguugcaucaaagcu(seqidno:15).

在另一个例子中，全长密码子优化的人鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)信使rna序列显示于下文：

ggacagaucgccuggagacgccauccacgcuguuuugaccuccauagaagacaccgggaccgauccagccuccgcggccgggaacggugcauuggaacgcggauuccccgugccaagagugacucaccguccuugacacgaugcuguuuaaccugagaauucugcugaacaacgccgcguucaggaacggccacaauuucaugguccgcaacuuuagaugcggacagccucuccaaaacaagguccagcucaaggggcgggacuugcugacccuuaagaacuuuaccggcgaagagaucaaguacaugcugugguugucagcggaccugaaguuccgcaucaagcagaaaggggaguaucugccgcugcuccaaggaaagucgcucggcaugaucuucgagaagcgcucgaccagaacccggcuguccacugaaacugguuucgcccuucuggguggacacccuuguuuccugacaacccaggacauccaucugggcgugaacgaaagccucacugacaccgccagggugcugagcuccauggccgacgcuguccuugcccggguguacaagcaguccgaucuggacacucuggccaaggaagcguccaucccgaucauuaacggacuguccgaccuguaccacccgauccagauucuggccgacuaccugaccuugcaagagcacuacagcucacugaagggcuugacccugagcuggaucggcgacggaaacaacauucugcauucgaucaugauguccgcggccaaguucggaaugcaucugcaggccgcaacucccaagggauacgaaccugaugcguccgugacuaagcuggccgagcaguacgcaaaggaaaacggcaccaagcugcugcugaccaacgacccgcucgaagcugcccacggagggaacgugcucauuaccgacacuuggaucuccauggggcaggaagaagagaagaagaagcggcuccaggcauuccaggguuaccaggucaccaugaaaacggccaaaguggccgcuucggauuggacuuuccuccacugccuuccccgcaaaccugaggaaguggaugaugaaguguucuacuccccacgcucccucguguuccccgaggccgagaaucggaaguggaccauuauggccgugauggugucacugcugaccgacuacagcccccaacugcaaaagccgaaguucuga

cggguggcaucccugugaccccuccccagugccucuccuggcccuggaaguugccacuccagugcccaccagccuuguccuaauaaaauuaaguugcaucaagcu(seqidno:4)

示例性配制方案

ckk-e12

将ckk-e12、dope、胆固醇和dmg-peg2k的50mg/ml乙醇溶液的等分试样混合，并且用乙醇稀释至3ml最终体积。分开地，从1mg/ml原液制备otcmrna的水性缓冲溶液(10mm柠檬酸盐/150mmnacl，ph4.5)。将脂质溶液快速注入水性mrna溶液中且振荡，以得到20％乙醇中的最终悬浮液。将所得到的纳米颗粒悬浮液过滤，用1xpbs(ph7.4)渗滤，浓缩并且贮存于2-8℃下。测定otc包封的mrna的最终浓度、zave、dv(50)和dv(90)。

b.c12-200

将c12-200、dope、胆固醇和dmg-peg2k的50mg/ml乙醇溶液的等分试样混合，并且用乙醇稀释至3ml最终体积。分开地，从1mg/ml原液制备otcmrna的水性缓冲溶液(10mm柠檬酸盐/150mmnacl，ph4.5)。将脂质溶液快速注入水性mrna溶液中且振荡，以得到20％乙醇中的最终悬浮液。将所得到的纳米颗粒悬浮液过滤，用1xpbs(ph7.4)渗滤，浓缩并且贮存于2-8℃下。测定otc包封的mrna的最终浓度、zave、dv(50)和dv(90)。

c.hgt4003

将hgt4003、dope、胆固醇和dmg-peg2k的50mg/ml乙醇溶液的等分试样混合，并且用乙醇稀释至3ml最终体积。分开地，从1mg/ml原液制备otcmrna的水性缓冲溶液(10mm柠檬酸盐/150mmnacl，ph4.5)。将脂质溶液快速注入水性mrna溶液中且振荡，以得到20％乙醇中的最终悬浮液。将所得到的纳米颗粒悬浮液过滤，用1xpbs(ph7.4)渗滤，浓缩并且贮存于2-8℃下。测定otc包封的mrna的最终浓度、zave、dv(50)和dv(90)。

d.ice

将ice、dope、胆固醇和dmg-peg2k的50mg/ml乙醇溶液的等分试样混合，并且用乙醇稀释至3ml最终体积。分开地，从1mg/ml原液制备otcmrna的水性缓冲溶液(10mm柠檬酸盐/150mmnacl，ph4.5)。将脂质溶液快速注入水性mrna溶液中且振荡，以得到20％乙醇中的最终悬浮液。将所得到的纳米颗粒悬浮液过滤，用1xpbs(ph7.4)渗滤，浓缩并且贮存于2-8℃下。测定otc包封的mrna的最终浓度、zave、dv(50)和dv(90)。

e.hgt5001

将hgt5001、dope、胆固醇和dmg-peg2k的50mg/ml乙醇溶液的等分试样混合，并且用乙醇稀释至3ml最终体积。分开地，从1mg/ml原液制备otcmrna的水性缓冲溶液(10mm柠檬酸盐/150mmnacl，ph4.5)。将脂质溶液快速注入水性mrna溶液中且振荡，以得到20％乙醇中的最终悬浮液。将所得到的纳米颗粒悬浮液过滤，用1xpbs(ph7.4)渗滤，浓缩并且贮存于2-8℃下。测定otc包封的mrna的最终浓度、zave、dv(50)和dv(90)。

f.hgt5000

将hgt5000、dope、胆固醇和dmg-peg2k的50mg/ml乙醇溶液的等分试样混合，并且用乙醇稀释至3ml最终体积。分开地，从1mg/ml原液制备otcmrna的水性缓冲溶液(10mm柠檬酸盐/150mmnacl，ph4.5)。将脂质溶液快速注入水性mrna溶液中且振荡，以得到20％乙醇中的最终悬浮液。将所得到的纳米颗粒悬浮液过滤，用1xpbs(ph7.4)渗滤，浓缩并且贮存于2-8℃下。测定otc包封的mrna的最终浓度、zave、dv(50)和dv(90)。

g.dlinkc2dma

将dlinkc2dma、dope、胆固醇和dmg-peg2k的50mg/ml乙醇溶液的等分试样混合，并且用乙醇稀释至3ml最终体积。分开地，从1mg/ml原液制备otcmrna的水性缓冲溶液(10mm柠檬酸盐/150mmnacl，ph4.5)。将脂质溶液快速注入水性mrna溶液中且振荡，以得到20％乙醇中的最终悬浮液。将所得到的纳米颗粒悬浮液过滤，用1xpbs(ph7.4)渗滤，浓缩并且贮存于2-8℃下。测定otc包封的mrna的最终浓度、zave、dv(50)和dv(90)。

h.dodap

将dodap、dope、胆固醇和dmg-peg2k的50mg/ml乙醇溶液的等分试样混合，并且用乙醇稀释至3ml最终体积。分开地，从1mg/ml原液制备otcmrna的水性缓冲溶液(10mm柠檬酸盐/150mmnacl，ph4.5)。将脂质溶液快速注入水性mrna溶液中且振荡，以得到20％乙醇中的最终悬浮液。将所得到的纳米颗粒悬浮液过滤，用1xpbs(ph7.4)渗滤，浓缩并且贮存于2-8℃下。测定otc包封的mrna的最终浓度、zave、dv(50)和dv(90)。

i.dodma

将dodma、dope、胆固醇和dmg-peg2k的50mg/ml乙醇溶液的等分试样混合，并且用乙醇稀释至3ml最终体积。分开地，从1mg/ml原液制备otcmrna的水性缓冲溶液(10mm柠檬酸盐/150mmnacl，ph4.5)。将脂质溶液快速注入水性mrna溶液中且振荡，以得到20％乙醇中的最终悬浮液。将所得到的纳米颗粒悬浮液过滤，用1xpbs(ph7.4)渗滤，浓缩并且贮存于2-8℃下。测定otc包封的mrna的最终浓度、zave、dv(50)和dv(90)。

实例2.负载otcmrna的脂质体纳米颗粒的静脉内施用

该实例示出了施用负载otcmrna的脂质体纳米颗粒的示例性方法和用于分析体内各种靶组织中的otcmrna的方法。

所有研究都使用spf^ash小鼠执行。通过单次推注尾静脉注射0.5mg/kg剂量，用负载人otcmrna的基于ckk-e12的脂质纳米颗粒处理小鼠。在24小时、72小时、8天、11天和15天时，处死小鼠并且用盐水灌注。

收获每只小鼠的组织，例如肝脏，分配成分开的份，并且贮存于10％中性缓冲福尔马林中或快速冷冻且贮存于-80℃下用于分析。

小鼠肝脏匀浆物中的otc蛋白的蛋白质印迹检测

使用hepes裂解缓冲液将样品匀浆化，并且冷冻/解冻两次以确保总细胞裂解。将碎片形成团块并且通过bca测定评价匀浆物的总蛋白定量。将具有nupage还原剂和上样染料的10ng总蛋白在95℃下温育5分钟，随后为在8-16％tris/甘氨酸sds-page凝胶上的蛋白质分离。将蛋白质转移到pvdf膜上，用pbst中的2％i-block溶液封闭，然后与有专利权的抗otc抗体(22a03)一起温育。将凝胶洗涤，与hrp缀合的第二抗体一起温育，再次洗涤并且使用ecl-prime底物在konikaminoltasrx-101a膜处理器上显色。

小鼠肝脏匀浆物中的otc蛋白的elisa定量

使用hepes裂解缓冲液将样品匀浆化，并且冷冻/解冻两次以确保总细胞裂解。将碎片形成团块并且收集上清液用于测定。将有专利权的抗otc抗体(25d11)以1μg/ml在nuncmaxisorb板上在50mm碳酸氢钠溶液，ph9.6中包被1小时。使用dpbs和tween-20洗涤缓冲液洗涤板，然后用surmodics酪蛋白封闭缓冲液封闭1小时。再次洗涤板，然后一式两份加入样品和标准，并且再温育一小时。洗涤板，然后将hrp-缀合的检测ab(21c02)以1:5500稀释度加入板中且温育1小时。最后一次洗涤后，使用surmodicstmb底物使板显色，用1nhcl终止并且在分光光度计上在450nm减去650nm处读数。

使用小鼠肝脏匀浆物的瓜氨酸活性测定

如先前所述制备小鼠肝脏匀浆物。将匀浆物在1xdpbs中稀释至所需浓度，然后加入96孔板中的ultrapure水内。瓜氨酸标准以预定量加入，以充当校准物。向每个孔中加入含有氨基甲酰磷酸、鸟氨酸和三乙醇胺的反应混合物，并且允许反应在37℃下进行30分钟。用磷酸和硫酸的混合物终止反应，并且向每个孔中加入二乙酰一肟。使板在85℃下温育30分钟，短暂冷却，并且在分光光度计上在490nm处读数。

小鼠尿中的乳清酸定量

使用离子交换柱经由超高效液相色谱(uplc)执行来自动物尿样品的乳清酸的定量。简言之，使用不含rna酶的水将尿样品稀释两倍，并且将一部分加载到thermoscientific100x柱上。包含乙腈和25mm乙酸铵的流动相提供乳清酸的分离和定量，其中检测基于在280nm处的吸光度。

小鼠血浆中的氨定量

将全血的等分试样收集到肝素锂血浆管内且加工为血浆。使用idexxcatalystdx分析仪分析新鲜血浆样品。

结果

使用免疫组织化学方法(例如蛋白质印迹)实现经处理的小鼠的肝脏中otc蛋白的检测。如图1中证实的，在24小时、72小时、8天、11天和15天时，检测到外源人otc蛋白。

另外，mrna衍生的hotc蛋白还显示为酶促活性的，如通过使用定制的离体活性测定测量瓜氨酸产生水平所证实的。在单个0.5mg/kg剂量的负载hotcmrna的脂质纳米颗粒后，经过两周时期，通过负载hotcmrna的脂质纳米颗粒在小鼠中产生的hotc蛋白是活性的(图2a)。如图2b中证实的，单个0.5mg/kg剂量的负载hotcmrna的脂质纳米颗粒导致hotc蛋白活性高于正常活性10-15％的最小治疗靶范围。此外，在施用后两周时证实的活性导致瓜氨酸水平超过背景水平大约3倍。

当使用多种hotcmrna脂质纳米颗粒制剂时，在spf^ash小鼠中也产生mrna衍生的hotc蛋白(图3a和图3b)。使用如上所述的方法制备两种分开的制剂，其包封具有不同量脂质的co-hotcmrna。n:p4利用的总脂质是n:p2制剂的两倍。另外，当施用于spf^ash时，掺入无义突变的hotcmrna的类似对照制剂(stopn:p2和stopn:p4)不产生任何可检测的hotc蛋白。分开地，盐水在该实验中用作另一种对照处理。将分离的肝脏匀浆化，并且如上所述测定hotc蛋白质的产生和活性。图3a和图3b描绘了来自每组的代表性小鼠肝脏的免疫印迹分析。对于含有hotcmrna的两种制剂均观察到人otc蛋白的阳性检测。对于基于无义mrna的对照组或盐水处理的(未经处理的)小鼠，未观察到hotc蛋白。

图4显示了由每组观察到的hotc活性。与盐水处理的(未经处理的)小鼠相比，在用hotcmrnalnp处理的两组中均观察到显著的hotc活性，而在无义突变的mrna对照组中没有测量到活性中的增加。该活性可归于源自lnp递送的hotcmrna的成功活性蛋白质产生。图4证实hotcmrna产生能够产生瓜氨酸的活性hotc蛋白，而不产生可检测的hotc蛋白的对照制剂并未显示超过背景水平的任何瓜氨酸产生活性。

此外，通过使经处理的小鼠的尿中的乳清酸水平标准化，在该疾病模型中证实了功效。具体地，在所有制剂(和盐水对照，“未经处理的”)施用后24小时获得尿样品，并且测量乳清酸定量。通过监测乳清酸(otc缺乏症的已知生物标记物)来确定spf^ash小鼠中mrna衍生的hotc蛋白的活性(图5)。在用负载hotcmrna的脂质纳米颗粒处理的小鼠中观察到尿中乳清酸水平的明显降低，而当小鼠施用包含无义突变的hotcmrna的对照制剂时，未观察到乳清酸中的显著降低。

在分开的研究中，用两种不同hotcmrnalnp制剂(n/p＝2、n/p＝4)以两个剂量水平(0.50mg/kg、1.0mg/kg)处理spf^ash小鼠。测试物品作为单个静脉内剂量施用。如图6a所示，在24小时后(施用后)，小鼠呈现有氨攻击，其中腹膜内施用氯化铵(nh4cl)的推注注射。这为了表示患有otc缺乏症的患者可经历的高氨血症发作而执行。在nh4cl攻击后40分钟监测血浆氨水平。

图6b比较了经处理的小鼠的血浆氨水平与未经处理的spf^ash小鼠以及野生型小鼠的血浆氨水平。当针对野生型(未经处理的)氨水平标准化时，在施用hotcmrnalnp制剂的所有剂量下实现高氨血症发作的完全保护。未经处理的spf^ash小鼠在相同条件下显示血浆氨中的显著升高。为了证实这是由于在这些小鼠的肝脏中活性hotc蛋白的存在，收获肝脏并且分析otc活性(图7)。与野生型活性水平相比，施用的所有剂量产生范围为35％-103％正常活性的活性水平。

实例3.负载otcmrna的脂质体纳米颗粒的多剂量施用

该实例示出了经过延长的时间段施用负载otcmrna的脂质体纳米颗粒的示例性方法，以及用于分析体内各种靶组织中的otcmrna的方法。

该研究使用spf^ash小鼠执行。如实例2中所述处理小鼠，但以多剂量形式。具体地，在spf^ash小鼠中进行多剂量研究，其需要以0.60mg/kg静脉内施用的8个每周剂量的负载hotcmrna的lnp。每周处死小鼠群组，并且分析肝脏的hotc活性且与野生型otc活性水平进行比较。对于所有剂量，测试物品是良好耐受的并且肝脏酶保持在正常范围内。图8显示了作为野生型水平的百分比在这些经处理的小鼠中产生的人otc活性。对于给药的所有8周维持野生型至少大约36％的水平。

如实例2中所述进行另外的多剂量研究，但给动物施用4个每周剂量的1.0mg/kg负载hotcmrna的lnp。图9a显示了作为用1.0mg/kg剂量的负载hotcmrna的lnp每周给药的spf^ash小鼠中野生型水平的百分比，在这些经处理的小鼠中产生的人otc活性。多剂量方案在otc缺陷小鼠中产生治疗水平的活性hotc蛋白超过三周。如图9b中证实的，在第1天、第8天、第15天和第22天时，检测到外源人otc蛋白。

等价方案

本领域的技术人员将认识到，或者使用不超出常规的实验就能够确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等价方案。本发明的范围无意限于以上说明书，而是如以下权利要求书所阐述。

序列表

<110>川斯勒佰尔公司

<120>用于治疗鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症的信使rna疗法

<130>mrt-1243wo

<150>62/349,331

<151>2016-06-13

<150>62/509,568

<151>2017-05-22

<160>15

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1065

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的核苷酸

<400>1

augcuguuuaaucugaggauccuguuaaacaaugcagcuuuuagaaauggucacaacuuc60

augguucgaaauuuucgguguggacaaccacuacaaaauaaagugcagcugaagggccgu120

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的核苷酸

<400>2

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<210>3

<211>1065

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的核苷酸

<400>3

augcuguucaaccuucggaucuugcugaacaacgcugcguuccggaauggucacaacuuc60

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cugcugaccgauuacuccccgcagcugcagaaaccaaaguucuga1065

<210>4

<211>1310

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成的核苷酸

<400>4

ggacagaucgccuggagacgccauccacgcuguuuugaccuccauagaagacaccgggac60

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