原种事件EE-GH7以及用于在生物样品中鉴定该事件的方法和试剂盒与流程
本发明涉及新型核酸和转基因棉花植物、植物材料和种子，其特征在于在棉花基因组的特定位置具有特定的转化事件，特别是存在编码赋予除草剂耐受性的蛋白的基因。本发明的棉花植物将除草剂耐受性表型与不同遗传背景中的农艺性能、遗传稳定性和功能性组合，所述遗传背景与不存在除草剂情况下相应的未转化棉花的遗传背景相当。本发明进一步提供用于在生物样品中鉴定包含特别是转化事件ee-gh7的植物材料的存在的方法和试剂盒。
背景技术：
植物中转基因的表型表达由该基因(一个或多个)本身的结构以及它或它们在植物基因组中的位置决定。同时，转基因或“外源dna”在基因组不同位置的存在将以不同方式影响植物的整体表型。通过遗传操作在植物中农业上或工业上成功地引入商业上感兴趣的性状，是依赖于多种不同因素的漫长过程。遗传转化植物的实际转化和再生只是一系列选择步骤中的第一步，该一系列选择步骤包括广泛的遗传表征、基因渗入和田间试验评估，最终导致选择原种事件(eliteevent)。
鉴于有关新食品/饲料、gmo和非-gmo产品分离、以及专利材料鉴定方面的讨论，对原种事件的明确鉴定变得越来越重要。理想地，这种鉴定方法要既快速又简单，不需要广泛的实验室设置。此外，该方法应该提供无需专家解释也能够明确确定原种事件的结果，且该结果在必要时经得起专家审查。本文描述了用于在生物样品中鉴定原种事件ee-gh7的特定工具。
在本发明中，ee-gh7已经在除草剂耐受性棉花(陆地棉(gossypiumhirsutum))的开发中自一群转基因棉花植物中被鉴定为原种事件，所述原种事件包含编码草甘膦(glyphosate)耐受性的基因与赋予对4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)抑制剂耐受性的基因的组合，各基因在植物可表达启动子的控制下。
种植双除草剂耐受性的棉花ee-gh7品种为种植者提供了使用异
本领域已经公开了包含除草剂耐受性基因的棉花植物。wo2007/017186描述了包含epsps基因的草甘膦耐受性棉花原种事件。wo2013/026740描述了包含在温室和田间赋予耐受性的hppd和epsps基因的棉花植物。wo2013/026740还描述了包含hppd和epsps基因的棉花植物，这两个基因被引入wo2008/151780中描述的包含昆虫抗性基因的原种事件的3'侧翼区。然而，现有技术公开的内容都没有教导或暗示这样的原种事件，所述原种事件包含编码草甘膦耐受性的基因和赋予对hppd抑制剂耐受性的基因组合，且可以以具有或不具有昆虫抗性基因的灵活方式使用。
本领域已知，在具有可接受的农艺性能(agronomicperformance)的棉花植物中获得商业除草剂耐受性原种转化事件，并且确定地对2种不同类别的除草剂提供足够的除草剂耐受性，决不是容易之事。
本发明优选实施方案的概述
本发明涉及转基因棉花植物或其种子、细胞或组织，其包含稳定整合到其基因组中的表达盒，所述表达盒包含含有2mepsps基因编码序列的除草剂耐受性基因和含有hppdpf-w336-1pa基因编码序列的另一除草剂耐受性基因(二者如本文实施例1.1中所述，并如seqidno1中所示)，所述转基因棉花植物耐受草甘膦和hppd抑制剂除草剂(如异
根据本发明，所述棉花植物或其种子、细胞或组织包含原种事件ee-gh7。
更具体地，本发明涉及转基因棉花植物、其种子、细胞或组织，其基因组dna的特征在于，当使用分别针对ee-gh7的5'或3'侧翼区和包含除草剂耐受性基因的外源dna的两个引物，在如本文所述的pcr鉴定方案中分析时，产生特异于ee-gh7的片段。引物可以分别针对seqidno：1中的3'侧翼区和包含除草剂耐受性基因的外源dna。引物也可分别针对seqidno：1中的5'侧翼区和包含除草剂耐受性基因的外源dna，例如引物可以包含或(基本上)由seqidno：3和seqidno：4的核苷酸序列组成，或包含或(基本上)由seqidno.5和seqidno.：6的核苷酸序列组成，并产生50-1000bp的dna片段，如约126bp或约120bp的片段。
包含本发明原种事件的参考种子已经以保藏号pta-122856保藏在atcc。本发明的一个实施方案是保藏号为pta-122856的包含原种事件ee-gh7的种子，其将生长为耐受除草剂的棉花植物，特别是耐受草甘膦和/或hppd抑制剂如异
本发明进一步涉及鉴定包含原种事件ee-gh7的转基因植物或其细胞或组织的方法，该方法基于鉴定转基因植物、细胞或组织中表征性dna序列或由这些dna序列编码的氨基酸的存在。根据本发明的一个优选实施方案，这种表征性dna序列是15bp或至少15bp、优选20bp或至少20bp、最优选30bp或更长的序列，其包含事件的插入位点，即，包含除草剂耐受性基因的插入的外源dna的一部分和与其连续的(5'或3'侧翼区)棉花基因组部分，以允许特异性鉴定原种事件。本发明还涉及如本文鉴定的包含事件ee-gh7的植物。
本发明进一步涉及鉴定生物样品中原种事件ee-gh7的方法，该方法基于特异性识别ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的5'和/或3'侧翼序列的引物或探针。本文还包括鉴定ee-gh7(例如鉴定其特异性的特征性序列)的任何其他方法，如全部或部分(定向的)基因组测序。
更具体地，本发明涉及一种方法，其包括使用至少两个引物和聚合酶链反应扩增生物样品中存在的核酸序列，其中至少两个引物之一识别ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的5'或3'侧翼区，另一个识别包含除草剂耐受性基因的外源dna内的序列，优选扩增以获得50-1000bp的dna片段。引物可分别识别ee-gh7的5'侧翼区(seqidno.1的1位至1217位)内的序列或ee-gh7的3'侧翼区(seqidno1的8033位至9328位的互补序列)内的序列、和含有除草剂耐受性基因的外源dna(seqidno1的1218位至8032位或其互补序列)内的序列。识别5'侧翼区的引物可包含seqidno.3或seqidno.5的核苷酸序列，识别包含除草剂耐受性基因的外源dna内的序列的引物可包含本文所述的seqidno.4或seqidno.6的核苷酸序列。本发明还涉及特异性引物和使用这些引物扩增的特异性dna，如本文所述。
本发明更具体地涉及鉴定生物样品中原种事件ee-gh7的方法，该方法包括使用两个引物和聚合酶链反应扩增生物样品中存在的核酸序列，其中两个引物分别包含或(基本上)由seqidno.3和seqidno.4的核苷酸序列组成，以获得约126bp的dna片段，或其中两个引物分别包含或(基本上)由seqidno.5和seqidno.6的核苷酸序列组成，以获得约120bp的dna片段。包含如此鉴定的原种事件ee-gh7的植物也包括在本发明中。
本发明进一步涉及本文所述的ee-gh7的特异性侧翼序列，其可用于开发在生物样品中特异性鉴定ee-gh7的方法。这种特异性侧翼序列也可用作鉴定测定法中的参考对照材料。更具体地，本发明涉及ee-gh7的5'和/或3'侧翼区，其可用于开发如本文进一步描述的特异性引物和探针。也适合作为参考材料的是，包含可通过如下引物扩增的序列的核酸分子，优选约150-850bp，其中所述引物包含或(基本上)由seqidno.3和seqidno.4的核苷酸序列组成、或包含或(基本上)由seqidno.5和seqidno.6的核苷酸序列组成。
本发明还涉及基于使用这种特异性引物或探针鉴定生物样品中存在ee-gh7的方法。引物可以包含、由或基本上由17至约200个连续核苷酸的核苷酸序列组成，其中所述核苷酸序列选自seqidno1的核苷酸1至核苷酸1217的核苷酸序列、或seqid1的核苷酸8033至核苷酸9328的核苷酸序列的互补物；所述引物可以组合包含、由或基本上由17至约200个连续核苷酸的核苷酸序列组成的引物，其中所述核苷酸序列选自seqidno1的核苷酸序列，例如，选自以下的17至约200个连续核苷酸的核苷酸序列：seqidno1的核苷酸1218至核苷酸8032的核苷酸序列的互补物，或seqidno1的核苷酸1218至核苷酸8032的核苷酸序列。引物也可以包含位于其3'末端的这些核苷酸序列，并且还包含不相关的序列或衍生自所述核苷酸序列但包含错配的序列。
本发明还涉及用于鉴定生物样品中原种事件ee-gh7的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个引物或探针，其特异性识别ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的5'或3'侧翼区。
除了特异性识别ee-gh7的5'或3'侧翼区的引物外，本发明的试剂盒还可包含特异性识别ee-gh7的包含除草剂耐受性基因的外源dna内的序列的第二引物，用于pcr鉴定方案。本发明的试剂盒可包含至少两个特异性引物，其中之一识别ee-gh7的5'侧翼区内的序列或ee-gh7的3'侧翼区内的序列，另一个识别包含除草剂耐受性基因的外源dna内的序列。识别5'侧翼区的引物可以包含seqidno.3的核苷酸序列，识别转基因或包含除草剂耐受性基因的外源dna的引物可以包含seqidno.4的核苷酸序列；或识别5'侧翼区的引物可以包含seqidno.5的核苷酸序列，识别转基因或包含除草剂耐受性基因的外源dna的引物可以包含seqidno.6的核苷酸序列，或本发明的试剂盒可包含如本文所述的任何其他引物或引物组合。所述试剂盒可以进一步包含识别序列的探针，该序列位于识别5'侧翼区的引物和识别外源dna内的序列的引物之间，或该被序列位于识别3'侧翼区的引物和识别外源dna内的序列的引物之间，如包含seqidno.7的序列的探针。
本发明进一步涉及用于鉴定生物样品中原种事件ee-gh7的试剂盒，所述试剂盒包含pcr引物，所述pcr引物包含或(基本上)由seqidno.3和seqidno.4的核苷酸序列组成，或包含或(基本上)由seqidno.5和seqidno.6的核苷酸序列组成，用于本文所述的ee-gh7pcr鉴定方案中。包含以下引物的所述试剂盒，其中所述引物包含或(基本上)由seqidno.5和seqidno.6的核苷酸序列组成，可以进一步包含探针，所述探针包含或(基本上)由seqidno.7的核苷酸序列组成。
本发明还涉及用于鉴定生物样品中原种事件ee-gh7的试剂盒，该试剂盒包含特异性探针，所述特异性探针包含或(基本上)由序列组成，所述序列对应于(或互补于)与ee-gh7的特异性区域具有80％至100％的序列同一性的序列。优选地，探针的序列对应于包含ee-gh7的5'或3'侧翼区的一部分的特异性区域。最优选地，特异性探针包含或(基本上)由序列组成(或互补于所述序列)，所述序列与seqidno1的核苷酸1197至核苷酸1238之间的序列具有80％至100％的序列同一性，或与seqidno.1的核苷酸8012至8053之间的序列具有80％至100％的序列同一性。
根据本发明的另一方面，公开了dna序列，其包含事件的插入位点、和棉花基因组dna及包含除草剂耐受性基因(转基因)的外源dna的足够长度的多核苷酸，从而可用作引物或探针检测ee-gh7，和表征包含事件ee-gh7的植物。所述序列可以包含ee-gh7中分别位于接合位点(junctionsite)两侧的、棉花基因组dna的至少9个核苷酸和包含除草剂耐受性基因的外源dna的类似数目核苷酸。最优选地，所述dna序列可以包含棉花基因组dna的至少9个核苷酸和包含除草剂耐受性基因的外源dna的类似数目核苷酸，这些核苷酸与seqidno：1中的插入位点连续。在本发明的一个方面，提供了包含该特定dna序列的棉花植物。
本发明的方法和试剂盒可用于不同目的，例如但不限于以下：在植物、植物材料或在产品中鉴定ee-gh7的存在或确定ee-gh7的(下限)阈值，所述产品为例如但不限于包含或衍生自植物材料的食品或饲料产品(新鲜或加工的)；另外或可替代地，本发明的方法和试剂盒可用于鉴定转基因植物材料，以用于转基因和非转基因材料的分离；另外或可替代地，本发明的方法和试剂盒可用于确定包含ee-gh7的植物材料的质量(即纯物质百分比)。
本发明还涉及ee-gh7的5'和/或3'侧翼区以及从ee-gh7的5'和/或3'侧翼序列开发的特异性引物和探针。
本发明还涉及从包含原种事件ee-gh7的植物获得的基因组dna。这种基因组dna可用作本文所述鉴定测定法中的参考对照材料。
本文还提供了转基因除草剂耐受性棉花植物、或其细胞、部分、种子或后代，其分别包含至少一个原种事件，所述原种事件包含外源dna，所述外源dna包含：
i)第一嵌合基因，其包含来自玉米(zeamays)的修饰的epsps基因，该epsps基因在植物可表达的启动子控制下编码草甘膦耐受的epsps酶，和
ii)第二嵌合基因，其包含来自荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)的修饰的hppd基因，该hppd基因在植物可表达的启动子控制下编码hppd抑制剂除草剂耐受性酶。
在一个实施方案中，所述原种事件包含在所述外源dna的紧上游并与所述外源dna连续的seqidno1的核苷酸1至1217，和在所述外源dna的紧下游并与所述外源dna连续的seqidno1的核苷酸8033至9328。
在进一步的实施方案中，所述原种事件可通过培育从包含所述事件的参考种子生长的棉花植物获得，所述参考种子已经以保藏号pta-122856保藏在atcc。
在另一个实施方案中，当使用分别包含seqidno3和seqidno4的核苷酸序列的两个引物和用于所述原种事件的原种事件鉴定方案进行分析时，所述棉花植物、或其细胞、部分、种子或后代的基因组dna产生(约)126bp的dna片段。
本文还提供了用于在生物样品中鉴定耐受草甘膦和/或hppd抑制剂除草剂(如异
本文还提供了用于生物样品中鉴定耐受草甘膦和/或hppd抑制剂除草剂(如异
在本发明的一个实施方案中，如本文所用，原种事件ee-gh7的外源dna包含seqidno1的核苷酸1218至核苷酸8032的核苷酸序列或其互补序列，或包含与seqidno1的核苷酸位置1218至核苷酸位置8032的核苷酸序列或其互补序列具有至少95、98、99或99.5％序列同一性的序列。
本文还提供了在其基因组中包含核酸分子的棉花植物、植物细胞、组织或种子，所述核酸分子包含与seqidno1的核苷酸位置1218至核苷酸位置8032的核苷酸序列或其互补序列具有至少97、98、或至少99％序列同一性的核苷酸序列，或与seqidno.1或其互补序列具有至少97、98或至少99％序列同一性的核苷酸序列。
本发明的一个实施方案提供在其基因组中包含核酸分子的棉花植物、植物细胞、组织或种子，所述核酸分子与seqidno1的核苷酸位置1218至核苷酸位置8032的核苷酸序列或其互补序列杂交，或与seqidno.1的核苷酸序列或其互补序列杂交。
本文还提供了分离的核酸分子，其包含与seqidno.1的核苷酸位置1218至核苷酸位置8032的核苷酸序列或其互补序列具有至少99％序列同一性的核苷酸序列，或与seqidno.1或其互补序列具有至少99％序列同一性的核苷酸序列；或分离的核酸分子，其包含与seqidno.1的核苷酸位置1218至核苷酸位置8032的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列，或与seqidno.1或其互补序列杂交的核苷酸序列。
根据本发明的其他实施方案总结在以下段落中：
1.一种核酸分子，其包含与seqidno.1的核苷酸1207至核苷酸1228或seqidno.1的核苷酸8022至8043、或所述序列的互补序列基本上类似的核苷酸序列。
2.一种核酸分子，其包含与seqidno.1的核苷酸1197至核苷酸1238或seqidno.1的核苷酸8012至8053、或所述序列的互补序列基本上类似的核苷酸序列。
3.一种核酸分子，其包含与seqidno.1或所述序列的互补序列基本上类似的核苷酸序列。
4.一种核酸分子，其包含与seqidno.1的核苷酸序列或其互补序列具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。
5.一种核酸分子，其包含与seqidno.1的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
6.棉花基因组dna，其包含段落1至5中任一的核酸分子。
7.包含原种事件ee-gh7的棉花基因组dna。
8.包含外源dna的嵌合dna，其中所述外源dna的序列由seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的序列组成，侧翼为5'和3'侧翼区，其中在所述外源dna的紧邻上游并与所述外源dna连续的5'侧翼区的特征在于由seqidno.1的核苷酸1至核苷酸1217的序列组成的序列，并且其中在所述外源dna的紧邻下游并与所述外源dna连续的3'侧翼区的特征在于由seqidno.1的核苷酸8033至核苷酸9328的序列组成的序列。
9.段落1至8中任一段的核酸分子、或基因组dna、或嵌合dna，其是分离的核酸分子、或分离的基因组dna、或分离的嵌合dna。
10.棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，其包含段落1至5中任一的核酸分子或段落8的嵌合dna。
11.转基因棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，其各自在其基因组中包含原种事件ee-gh7，包含所述事件的参考种子已经以保藏号pta-122856保藏在atcc。
12.段落11的转基因棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，当使用分别包含seqid3和seqid4的核苷酸序列的两个引物和针对ee-gh7的原种事件鉴定方案进行分析时，其基因组dna产生约126bp的dna片段。
13.包含原种事件ee-gh7的种子或其衍生物，所述种子以保藏号pta-122856保藏在atcc。
14.包含原种事件ee-gh7的棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，其可从段落13的种子获得。
15.在其基因组中包含原种事件ee-gh7的棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，该棉花植物可通过繁殖和/或培育从保藏在atcc的保藏号pta-122856的种子生长的棉花植物获得。
16.包含原种事件ee-gh7的棉花种子，其中包含所述事件的参考种子已经以保藏号pta-122856保藏在atcc。
17.包含原种事件ee-gh7的转基因棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，其可从段落16的种子获得。
18.在其基因组中包含原种事件ee-gh7的棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，其中所述原种事件是包含插入的外源dna和直接围绕所述插入的外源dna的5'和3'侧翼序列的遗传基因座，其中所述外源dna含有嵌合hppdw336蛋白的编码基因和嵌合2mepsps蛋白的编码基因，所述5'和3'侧翼序列为在保藏在atcc的保藏号pta-122856的参考种子中存在的5'和3'侧翼序列。
19.在其基因组中包含事件ee-gh7的转基因棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，所述事件的特征在于包含与seqidno.1的核苷酸1207至核苷酸1228基本上类似的核苷酸序列的核酸分子、和包含与seqidno.1的核苷酸8022至8043的序列或所述序列的互补序列基本上类似的核苷酸序列的核酸分子。
20.棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，其包含ee-gh7，并且在其细胞的基因组中包含与seqidno.1的核苷酸1197至核苷酸1238具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的核酸序列、和与seqidno.1的核苷酸8012至8053的序列或所述序列的互补序列具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的核酸序列。
21.根据段落10至12、14、15和17至20中任一的棉花植物，其耐受异
22.根据段落10至21中任一的棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，其还包含
-包含草铵膦耐受性和cry1ab基因的事件t304-40，如wo2008/122406中所述；
-包含草铵膦耐受性和cry2ae基因的事件ghb119，如wo2008/151780中所述；和/或
-包含vip3a基因的事件cot102，如wo2004/039986中所述。
23.根据段落10至12、14、15和17至22中任一的棉花植物细胞，其是非繁殖植物细胞。
24.一种生产包含原种事件ee-gh7的棉花植物或种子的方法，包括将根据段落10至12、14、15和17至22中任一段的植物与另一棉花植物杂交，并种植从所述杂交获得的种子。
25.一种生产耐受hppd抑制剂除草剂和草甘膦的棉花植物的方法，包括：通过将缺少hppdw336的编码基因且缺少2mepsps的编码基因的第一棉花植物与段落10至12、14、15和17至22中任一的棉花植物杂交，并选择耐受hppd抑制剂除草剂和/或草甘膦的后代植物，将hppd抑制剂除草剂和草甘膦的耐受性引入棉花植物的基因组中。
26.根据段落25的方法，其中通过用hppd抑制剂除草剂和/或用草甘膦处理生长的植物来选择耐受hppd抑制剂除草剂和/或草甘膦的所述后代植物。
27.一种棉产品，其由段落10至22中任一的棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代生产。
28.段落27的棉产品，其包含纤维、棉绒(linter)、种子、种子粉或种子油。
29.段落27或28的棉产品，其中所述棉产品包含产生诊断事件ee-gh7或特异于事件ee-gh7的扩增子的核酸。
30.一种生产棉产品的方法，包括获得段落10至22中任一的棉花植物、其细胞、部分、组织、种子或后代，并从中生产这种棉产品。
31.段落30的方法，其中所述棉产品是或包含纤维、棉绒、种子、种子粉或种子油。
32.段落30或31的方法，其中所述棉产品包含产生诊断事件ee-gh7或特异于事件ee-gh7的扩增子的核酸。
33.一种控制杂草的方法，包括在棉花植物出苗之前但在种子播种之后，用hppd抑制剂除草剂处理播种了段落10至22中任一的棉花种子的田地。
34.一种控制杂草的方法，包括在棉花植物出苗之后用hppd抑制剂除草剂处理段落10至12、14、15和17至22中任一的棉花植物。
35.一种保护段落10至12、14、15和17至22中任一的出苗棉花植物免受杂草竞争的方法，包括在棉花植物种植或种子播种之前，用hppd抑制剂除草剂处理待种植所述棉花植物的田地，然后在所述预处理的田地中种植或播种所述棉花植物或种子。
36.根据段落33至35中任一的方法，还包括用草甘膦处理棉花植物。
37.段落33至36中任一段的方法，其中所述hppd抑制剂除草剂是异
38.一种控制杂草的方法，包括在棉花植物出苗后用草甘膦处理段落10至12、14、15和17至22中任一段的棉花植物。
39.段落10至22中任一段的植物、其种子、部分、细胞或后代用于生产棉纤维的用途。
40.段落10至11中任一段的棉花植物或种子用于生长hppd抑制剂除草剂耐受性和/或草甘膦耐受性棉花植物的用途。
41.段落10至22中任一段的棉花种子用于获得棉产品的用途，其中所述棉产品是或包含纤维、棉绒、种子、种子粉或种子油。
42.一种在生物样品中鉴定原种事件ee-gh7的方法，该方法包括用特异性引物对或探针检测ee-gh7特异性区域，所述特异性引物对或探针特异性识别ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的5'或3'侧翼区、以及与所述5'或3'侧翼区连续的外源dna部分。
43.段落42的方法，所述方法包括使用至少两个引物和聚合酶链反应从所述生物样品中存在的核酸扩增50至1000bp的dna片段，其中第一引物识别ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的5'侧翼区，所述5'侧翼区包含seqidno.1的核苷酸1至核苷酸1217的核苷酸序列，或其中第一引物识别ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的3'侧翼区，所述3'侧翼区包含seqidno.1的核苷酸8033至核苷酸9328的互补核苷酸序列，并且其中第二引物识别外源dna内的序列，所述外源dna包含seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的核苷酸序列，或其互补序列。
44.段落43的方法，其中识别5'侧翼区的所述第一引物包含17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自seqidno.1的核苷酸1至核苷酸1217的核苷酸序列；或识别ee-gh7的3'侧翼区的所述第一引物包含17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自seqidno.1的核苷酸8033至核苷酸9328的互补核苷酸序列；并且识别外源dna内的序列的所述第二引物包含17至200个连续核苷酸，其选自seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的核苷酸序列，或其互补序列。
45.段落43的方法，其中识别5'侧翼区的所述第一引物在其3'末端包含至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自seqidno.1的核苷酸1至核苷酸1217的核苷酸序列；或识别ee-gh7的3'侧翼区的所述第一引物在其3'末端包含至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自seqidno.1的核苷酸8033至核苷酸9328的互补核苷酸序列；并且识别外源dna内的序列的所述第二引物在其3'末端包含至少17个连续核苷酸，其选自seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的核苷酸序列，或其互补序列。
46.段落45的方法，其中所述引物分别包含seqidno.3和seqidno.4的序列，或分别包含seqidno.5和seqidno.6的序列，或分别包含seqidno.11和seqidno.13的序列。
47.段落46的方法，其中所述引物在其3'末端分别包含seqidno.3和seqidno.4的序列，或在其3'末端分别包含seqidno.5和seqidno.6的序列，或在其3'末端分别包含seqidno.11和seqidno.13的序列。
48.段落46或47的方法，其中所述引物分别由seqidno.3和seqidno.4的序列组成，或分别由seqidno.5和seqidno.6的序列组成，或分别由seqidno.11和seqidno.13的序列组成。
49.段落46至48中任一段的方法，该方法包括使用ee-gh7pcr鉴定方案扩增约126或120bp的片段。
50.段落43至49中任一段的方法，其进一步包括用特异性针对所述至少两个引物扩增的dna片段的探针进行杂交的步骤。
51.段落50的方法，其中所述探针识别所述5'侧翼区的部分和与其连续的外源dna的部分，或其中所述探针识别所述3'侧翼区的部分和与其连续的外源dna的部分。
52.段落51的方法，其中所述引物分别包含seqidno.5和seqidno.6的序列，并且其中所述探针包含seqidno.7的序列。
53.一种试剂盒，其包含识别ee-gh7中的包含除草剂耐受性基因的外源dna的5'侧翼区的第一引物，所述5'侧翼区包含seqidno.1的核苷酸1至核苷酸1217的核苷酸序列；或识别ee-gh7中的包含除草剂耐受性基因的外源dna的3'侧翼区的第一引物，所述3'侧翼区包含seqidno.2的核苷酸8033至核苷酸9328的互补核苷酸序列；和识别外源dna内的序列的第二引物，所述外源dna包含seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的核苷酸序列，或其互补序列。
54.如段落53的试剂盒，其中识别5'侧翼区的所述第一引物包含17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自seqidno.1的核苷酸1至核苷酸1217的核苷酸序列；或识别ee-gh7的3'侧翼区的所述第一引物包含17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自seqidno.1的核苷酸8033至核苷酸9328的互补核苷酸序列；并且识别外源dna内的序列的所述第二引物包含17至200个连续核苷酸，其选自seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的核苷酸序列，或其互补序列。
55.如段落53的试剂盒，其中识别5'侧翼区的所述第一引物在其3'末端包含至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自seqidno.1的核苷酸1至核苷酸1217的核苷酸序列；或识别ee-gh7的3'侧翼区的所述第一引物在其3'末端包含至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自seqidno.1的核苷酸8033至核苷酸9328的互补核苷酸序列；并且识别外源dna内的序列的所述第二引物在其3'末端包含至少17个连续核苷酸，其选自seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的核苷酸序列，或其互补序列。
56.段落53的试剂盒，其包含：包含seqidno.3的序列的引物和包含seqidno.4的序列的引物；或其包含：包含seqidno.5的序列的引物和包含seqidno.6的序列的引物；或其包含：包含seqidno.11的序列的引物和包含seqidno.13的序列的引物。
57.段落53的试剂盒，其进一步包含探针，所述探针识别位于识别5'侧翼区的引物和识别外源dna内的序列的引物之间的序列，或识别位于识别3'侧翼区的引物和识别外源dna内的序列的引物之间的序列。
58.段落57的试剂盒，其中所述探针识别所述5'侧翼区的部分和与其连续的外源dna的部分，或其中所述探针识别所述3'侧翼区的部分和与其连续的外源dna的部分。
59.段落58的试剂盒，其中所述引物包含seqidno.5和seqidno.6的序列，并且其中所述探针包含seqidno.7的序列。
60.适用于ee-gh7特异性检测的引物，其包含在优化的检测条件下特异性识别ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的5'或3'侧翼区内的序列的序列，所述5'侧翼区包含seqidno.1的核苷酸1至核苷酸1217的核苷酸序列，所述3'侧翼区包含seqidno.1的核苷酸8033至核苷酸9328的互补核苷酸序列。
61.一种引物，其在3'末端包含seqidno.3的序列、或seqidno.5的序列、或seqidno.11的序列。
62.引物对，其包含识别ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的5'侧翼区的第一引物，所述5'侧翼区包含seqidno.1的核苷酸1至核苷酸1217的核苷酸序列；或识别ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的3'侧翼区的第一引物，所述3'侧翼区包含seqidno.1的核苷酸8033至核苷酸9328的互补核苷酸序列；和识别外源dna内的序列的第二引物，所述外源dna内的序列包含seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的核苷酸序列，或其互补序列。
63.根据段落62的引物对，其中识别5'侧翼区的所述第一引物包含17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自seqidno.1的核苷酸1至核苷酸1217的核苷酸序列；或识别ee-gh7的3'侧翼区的所述第一引物包含17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自seqidno.1的核苷酸8033至核苷酸9328的互补核苷酸序列；和识别外源dna内的序列的所述第二引物包含17至200个连续核苷酸，其选自seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的核苷酸序列，或其互补序列。
64.根据段落62的引物对，其中识别5'侧翼区的所述第一引物在其3'末端包含至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自seqidno.1的核苷酸1至核苷酸1217的核苷酸序列；或识别ee-gh7的3'侧翼区的所述第一引物在其3’末端包含至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自seqidno.1的核苷酸8033至核苷酸9328的互补核苷酸序列；和识别外源dna内的序列的所述第二引物在其3'末端包含至少17个连续核苷酸，其选自seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的核苷酸序列，或其互补序列。
65.引物对，其包含：包含seqidno.3的序列的第一引物和包含seqidno.4的序列的第二引物；或其包含：包含seqidno.5的序列的第一引物和包含seqidno.6的序列的第二引物；或其包含：包含seqidno.11的序列的第一引物和包含seqidno.13的序列的第二引物。
66.引物对，其包含在其3'末端包含seqidno.3的序列的第一引物和在其3'末端包含seqidno.4的序列的第二引物；或其包含在其3'末端包含seqidno.5的序列的第一引物和在其3'末端包含seqidno.6的序列的第二引物；或其包含在其3'末端包含seqidno.11的序列的第一引物和在其3'末端包含seqidno.13的序列的第二引物。
67.引物对，其包含由seqidno.3的序列组成的第一引物和由seqidno.4的序列组成的第二引物，或包含由seqidno.5的序列组成的第一引物和由seqidno.6的序列组成的第二引物，或包含由seqidno.11的序列组成的第一引物和由seqidno.13的序列组成的第二引物。
68.段落42的方法，该方法包括用ee-gh7的特异性探针杂交生物样品的核酸。
69.段落68的方法，其中所述特异性探针的序列与以下序列具有至少80％的序列同一性，所述序列包含ee-gh7的5'侧翼序列或3'侧翼序列的一部分和与其连续的外源dna的序列。
70.段落69的方法，其中所述特异性探针的序列与seqidno.1的核苷酸1207至1228或seqidno.1的核苷酸8022至8043、或所述序列的互补序列具有至少80％的序列同一性。
71.段落69的方法，其中所述特异性探针的序列与seqidno.1的核苷酸1197至1238或seqidno.1的核苷酸8012至8053、或所述序列的互补序列具有至少80％的序列同一性。
72.段落71的方法，其中所述探针包含seqidno.7的序列。
73.一种用于生物样品中鉴定原种事件ee-gh7的试剂盒，所述试剂盒包含特异性探针，其能够特异性地与ee-gh7的特异性区域杂交。
74.段落73的试剂盒，其中所述特异性探针的序列与以下序列具有至少80％的序列同一性，所述序列包含ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的5'侧翼序列或3'侧翼序列的一部分、和与其连续的外源dna的序列。
75.段落74的试剂盒，其中所述特异性探针的序列包含与seqidno.1的核苷酸1197至1238或seqidno.1的核苷酸8012至8053、或所述序列的互补序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。
76.一种用于生物样品中鉴定原种事件ee-gh7的特异性探针。
77.段落76的探针，其包含与以下序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，所述序列包含ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的5'侧翼序列或3'侧翼序列的一部分、和与其连续的外源dna的序列，或其互补序列。
78.段落77的探针，其与seqidno.1的核苷酸1207至1228或seqidno.1的核苷酸8022至8043、或所述序列的互补序列具有至少80％的序列同一性。
79.一种特异性探针，其包含与seqidno.1的核苷酸1197至1238或seqidno.1的核苷酸8012至8053、或所述序列的互补序列基本上类似的核苷酸序列。
80.一种特异性探针，其由seqidno.1的核苷酸1197至1238或seqidno.1的核苷酸8012至8053的核苷酸序列、或所述序列的互补序列组成。
81.一种特异性探针，其包含seqidno.7的序列。
82.根据段落60至67和76至81中任一段的引物或引物对或探针，其在5'末端包含无关的核苷酸序列或被标记。
83.一种确认种子纯度的方法，该方法包括：在种子样品中，用特异性引物或探针检测ee-gh7特异性区域，所述特异性引物或探针特异性识别ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的5'或3'侧翼区。
84.段落83的方法，所述方法包括使用至少两个引物和聚合酶链反应从所述生物样品中存在的核酸扩增50至1000bp的dna片段，和用特异于所述至少两个引物扩增的dna片段的探针进行杂交，其中所述引物之一识别ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的5'侧翼区、或ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的3'侧翼区，所述5'侧翼区包含seqidno.1的核苷酸1至核苷酸1217的核苷酸序列，所述3'侧翼区包含seqidno.1的核苷酸8033至核苷酸9328的互补核苷酸序列，且所述引物的另一引物识别包含seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的核苷酸序列或其互补序列的外源dna内的序列。
85.段落84的方法，其包括扩增120bp的dna片段，并且其中所述引物分别包含seqidno.5和seqidno.6的序列，并且其中所述探针包含seqidno.7的序列。
86.一种筛选存在ee-gh7的种子的方法，该方法包括：在种子批的样品中，用特异性引物或探针检测ee-gh7特异性区域，所述特异性引物或探针特异性识别ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的5'或3'侧翼区。
87.段落86的方法，其包括使用至少两个引物和聚合酶链反应从所述生物样品中存在的核酸扩增50至1000bp的dna片段，和用特异针对所述至少两个引物扩增的dna片段的探针进行杂交，其中所述引物之一识别ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的5'侧翼区、或ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的3'侧翼区，所述5'侧翼区包含seqidno.1的核苷酸1至核苷酸1217的核苷酸序列，所述3'侧翼区包含seqidno.1的核苷酸8033至核苷酸9328的互补核苷酸序列，且所述引物的另一引物识别包含seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的核苷酸序列或其互补序列的外源dna内的序列。
88.段落87的方法，其包括扩增120bp的dna片段，并且其中所述引物分别包含seqidno.5和seqidno.6的序列，并且其中所述探针包含seqidno.7的序列。
89.一种确定包含原种事件ee-gh7的植物、植物材料或种子的接合性状态(zygositystatus)的方法，所述方法包括使用至少三个引物和聚合酶链反应从所述生物样品中存在的核酸扩增50至1000bp的dna片段，所述引物中的两个特异性识别插入前的植物dna，如包含seqidno.11的核苷酸序列的引物和包含seqidno.12的核苷酸序列的引物，所述引物中的第三引物识别外源dna内的序列，如seqidno.13的核苷酸序列。
90.一种通过与基本上互补的标记核酸探针杂交来检测生物样品中原种事件ee-gh7的存在的方法，其中通过循环靶核酸序列来放大探针：靶核酸的比例，所述方法包括：
a)所述靶核酸序列与第一核酸寡核苷酸杂交，所述第一核酸寡核苷酸包含seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸1235的核苷酸序列或其互补序列，或所述第一核酸寡核苷酸包含seqidno.1的核苷酸8015至8032的核苷酸序列或其互补序列；
b)所述靶核酸序列与第二核酸寡核苷酸杂交，所述第二核酸寡核苷酸包含seqidno.1的核苷酸1200至核苷酸1217的核苷酸序列或其互补序列，或所述标记的核酸探针包含seqidno.1的核苷酸8033至核苷酸8050的核苷酸序列或其互补序列，其中所述第一和第二寡核苷酸重叠至少一个核苷酸，并且其中所述第一或所述第二寡核苷酸被标记成为所述标记的核酸探针；
c)用酶仅切割探针：靶核酸序列双链体内的标记探针，所述酶引起选择性探针切割，导致双链体解离，留下完整的靶序列；
d)通过重复步骤(a)至(c)，循环靶核酸序列；和
e)检测切割的标记探针，从而确定所述靶核酸序列的存在。
附图说明
以下实施例，不旨在将本发明限制于所描述的具体实施方案，可以结合附图理解，所述附图通过引用并入本文，其中：
图1：述及的核苷酸序列和引物之间关系的示意图。黑色条：外源dna；阴影条：植物来源的dna；灰色条：靶标位点缺失。黑色箭头：寡核苷酸引物，黑色线：寡核苷酸探针。表示seqidno.2和1的条之上或之下的数字代表所述序列中不同遗传元件的核苷酸位置。引物组合之上的数字表示使用这些引物的聚合酶链反应中产生的片段长度。引物旁边的表代表引物在seqidno.2或seqidno.1中的核苷酸位置。注意：该示意图未按比例绘制。
图2：通过针对ee-gh7开发的pcr鉴定方案获得的结果。加载凝胶的顺序：泳道1：分子量标记物(50bp阶梯)；泳道2、3和4：阴性对照(无模板)；泳道5、6和7：来自野生型棉花植物的dna；泳道8、9和10：来自棉花植物的dna样品，所述棉花植物包含转基因事件ee-gh7；泳道11、12和13：阴性对照(无模板)；泳道14：分子量标记物(50bp阶梯)。数字表示标记物片段和ee-gh7特异性片段的大小。
图3：在大批种子中检测ee-gh7的实时pcr测定法的结果。该图显示包含ee-gh7的dna的5倍稀释物的相对荧光(对数刻度)。x轴表示pcr循环。水平条：阈值水平，对于此实验为0.135494。
图4：用于ee-gh7检测的终点taqman的结果。y轴：信号与背景(s/b)的比；x轴：样品编号。标有“a”的白色条：靶标(ee-gh7)；标有“b”的灰色条：内源性对照；标有“1”的水平线：靶标(ee-gh7)的下限阈值；标有“2”的水平线：内源性对照的阈值；标有“3”的水平线：上限阴性对照。样品：a1-a8：包含ee-gh7的样品；a9和a10：来自不包含ee-gh7的野生型棉花植物的样品；a11和a12：阴性对照(无模板)。
图5：通过针对ee-gh7开发的接合性评分pcr方案获得的结果。y轴：信号与背景(s/b)vic；x轴：信号与背景(s/b)fam。黑点：样品。线“a”描绘野生型样品；线“b”描绘ee-gh7的半合子样品；线“c”描绘ee-gh7的纯合样品。“d”：最低s/bvic；“e”最低s/bfam。
本发明优选实施方案的具体描述
在本发明中，在除草剂耐受性棉花(陆地棉(gossypiumhirsutum))的开发中自转基因棉花植物群中已将ee-gh7鉴定为原种事件，其包含编码草甘膦耐受性的基因与赋予对4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)抑制剂耐受性的基因的组合，各基因在植物可表达的启动子的控制下。
重组dna分子在植物基因组中的并入通常由细胞或组织的转化而引起。并入的具体位点通常由随机整合决定。
由重组dna或“转化dna”转化植物细胞或组织而引入植物基因组中并源于此转化dna的dna在下文中称为包含一个或多个“转基因”的“外源dna”。ee-gh7的转基因是草甘膦和hppd抑制剂除草剂耐受性基因。在本发明的上下文中，“植物dna”是指源自所转化植物的dna。植物dna通常存在于相应野生型植物的相同遗传基因座中。外源dna可以通过重组dna分子在植物基因组中并入的位点的位置和构型来表征。已插入重组dna的植物基因组位点也称为“插入位点”或“靶位点”。将重组dna插入植物基因组区域(称为“插入前植物dna”)，可与称为“靶位点缺失”的植物dna缺失相关联。本文所用的“侧翼区”或“侧翼序列”是指与引入的dna不同的至少20bp、优选至少50bp和至多5000bp的dna的序列，优选来自植物基因组的dna的序列，其位于外源dna的紧邻上游并与外源dna连续或位于外源dna的直接下游并与外源dna连续。导致外源dna随机整合的转化步骤将导致具有不同侧翼区的转化体，其对于每个转化体是特征性的和独特的。当通过传统杂交将重组dna引入植物中时，其在植物基因组中的插入位点或其侧翼区通常不会改变。
如本文所用，“分离的核酸(序列或分子)”或“分离的dna(序列或分子)”是指，该核酸或dna(序列或分子)不再存在于其所分离自的天然环境中，例如，在另一种细菌宿主或植物基因组中的核酸序列，或与来自另一来源的dna或核酸融合的核酸或dna，例如包含在植物可表达的启动子控制下的嵌合基因中。本发明的任何核酸或dna，包括任何引物，也可以是非天然存在的，例如，该核酸或dna可以与天然存在的序列具有相同序列但具有标记(在天然存在的对应物中没有标记)，或其序列与天然存在的核苷酸相比具有至少一个核苷酸添加或置换或至少一个内部核苷酸缺失，或其序列具有与天然存在的核酸或dna或其片段低于100％的同一性(不相同)，或可以是具有由不同来源的核苷酸序列(这些序列在自然界中不在一起)组成的序列的核酸或dna(嵌合或杂合dna)，或可以是具有不同于天然核酸或dna或其片段的序列的人造合成的核酸或dna。
“事件”定义为(人工)遗传基因座，其作为基因工程的结果而携带包含至少一个拷贝的(一个或多个)目标基因的外源dna或转基因。事件的典型等位基因状态是存在或不存在该外源dna。事件可以通过转基因的表达在表型上表征。在遗传水平上，事件是植物遗传构成的一部分。在分子水平上，事件可以通过限制性图谱(例如，通过southern印迹确定)、通过转基因的上游和/或下游侧翼序列、分子标记物的位置、和/或转基因的分子构型来表征。通常用包含至少一个目标基因的转化dna转化植物，将导致包含多个独立事件的转化体群，每个事件都是独特的。事件可以通过外源dna和至少一个侧翼序列进行表征。
如本文所用，原种事件是，基于最佳性状功效和优良表达、转基因的稳定性及其与包含其的植物的最佳农艺特征的兼容性，从使用相同的转化dna转化获得的一组事件选择的事件。因此，原种事件选择的标准是以下之一个或多个，优选地两个或更多个，有利地全部：
a)性状功效；
b)外源dna的存在不危害植物的其他所需特征，如与农艺性能或商业价值有关的特征；
c)该事件的特征在于可以稳定遗传的十分明确的分子构型，并且针对该分子构型，可以开发适当工具用于同一性控制(identitycontrol)；
d)目标基因在一系列环境条件下以商业上可接受的水平显示正确、适当和稳定的空间和时间表型表达，所述环境是携带该事件的植物在正常的农艺应用中可能暴露于的环境。
优选，外源dna与植物基因组中允许容易地渐渗进入所需的商业遗传背景中的位置相关。
可以通过在不同相关遗传背景中渐渗原种事件，并观察与一个、两个、三个或所有标准，例如上述a)、b)和c)和d)相符性，来确认事件状态是原种事件。
因此，“原种事件”是指包含外源dna的遗传基因座，其满足上述标准。植物、植物材料或后代如种子可在其基因组中包含一个或多个原种事件。
可以基于原种事件的特定基因组特征，开发用于鉴定原种事件或包含原种事件的植物或植物材料、或含有包含原种事件的植物材料的产品的工具，所述特征例如包含外源dna的基因组区的特定限制性图谱、分子标记物、或外源dna侧翼区(一个或多个)的序列。
一旦对外源dna的一个或两个侧翼区进行了测序，就可以通过分子生物技术开发在样品的核酸(dna或rna)中特异性识别这(这些)序列的引物和探针。例如，可以开发pcr方法来鉴定生物样品(如植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品)中的原种事件。这种pcr可以基于至少两个特异性“引物”，一个识别原种事件的5'或3'侧翼区内的序列，另一个识别外源dna内的序列。引物优选具有15至35个核苷酸的序列，其在优化的pcr条件下分别“特异性识别”原种事件的5'或3'侧翼区内的序列和原种事件的外源dna，从而从包含原种事件的核酸样品中扩增特定的片段(“整合片段”或区分扩增子)。这意味着，在优化的pcr条件下仅扩增靶整合片段，而不扩增植物基因组或外源dna中的其他序列。
适用于本发明的pcr引物可以如下：
-长度为17nt至约200nt的寡核苷酸，其在3'末端包含至少17个连续核苷酸、优选20个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自5'侧翼序列(seqidno.1的核苷酸1至核苷酸1217)中的植物dna(识别5'侧翼序列的引物)；或
-长度为17nt至约200nt的寡核苷酸，其在3'末端包含至少17个连续核苷酸、优选20个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自3'侧翼序列(seqidno.1的核苷酸8033至核苷酸9328的互补序列)中的植物dna(识别3'侧翼序列的引物)；或
-长度为17nt至约200nt的寡核苷酸，其在3'末端包含至少17个连续核苷酸、优选20个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自插入的dna序列(seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的互补序列)(识别外源dna的引物)；或
-长度为17nt至约200nt的寡核苷酸，其在3'末端包含至少17个连续核苷酸、优选20个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自插入的dna序列(seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032)(识别外源dna的引物)；或
-长度为17nt至约200nt的合适的寡核苷酸，其包含至少17个连续核苷酸、优选20个连续核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自插入的dna片段或其互补片段的核苷酸序列(seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032)。
应当理解，识别5'侧翼序列的引物可以与选自seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的互补序列的识别外源dna的引物一起用于pcr反应，而识别3'侧翼序列的引物可以与选自seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的识别外源dna的引物一起用于pcr反应。
当然引物可以比所提及的17个连续核苷酸长，可以是例如20、21、30、35、50、75、100、150、200nt长或甚至更长。引物可以完全由选自所述的侧翼序列和外源dna序列的核苷酸序列的核苷酸序列组成。然而，引物在其5'末端(即位于3'的17个连续核苷酸之外)的核苷酸序列不太重要。因此，引物的5'序列可以包含或由选自侧翼序列或外源dna的核苷酸序列组成，但根据情况，可以包含几个(例如，1、2、5或10个)错配。引物的5'序列甚至可以完全是与侧翼序列或外源dna不相关的核苷酸序列，例如代表一个或多个限制性酶识别位点的核苷酸序列，或者能够结合其他寡核苷酸的核苷酸序列，如标记的寡核苷酸，如fret盒(lgc基因组学；参见semagn等人,2014,molbreeding33:1-14,和us7615620)。这种不相关的序列或具有错配的侧翼dna序列应优选不长于100，更优选不长于50或甚至25个核苷酸。引物也可以用标记如荧光标记修饰。
此外，合适的引物可以在其3'末端包含或(基本上)由跨植物dna来源序列和外源dna序列之间的连接区域(位于seqidno1的核苷酸1217和1218以及seqidno.1的核苷酸8032和8033)的核苷酸序列组成，条件是所提及的位于3'的17个连续核苷酸不是完全来自seqidno.1中的外源dna或植物来源的序列。
本领域技术人员还将立即清楚，正确选择的pcr引物对也不应包含彼此互补的序列。
可以标记根据本发明的引物和探针，例如，用如本文其他地方所述的荧光标记或淬灭剂标记。
根据本发明的引物可以在5'末端具有不相关的序列。根据本发明的探针可以在5'末端和/或3'末端具有不相关的序列。例如，这种不相关的序列可以是设计为与二级引物结合的序列，或者可以是包含限制性位点的序列，或者可以是任何不相关的序列。
为了本发明的目的，“seqidno：x中所示的核苷酸序列的互补序列”是可以从所示的核苷酸序列，根据chargaff规则
合适引物的实例是seqidno3、seqidno5或seqidno.11的寡核苷酸序列(5'侧翼序列识别引物)，或seqidno4、seqidno.6的寡核苷酸序列(外源dna识别引物，与5'侧翼序列识别引物一起使用)。
优选地，扩增片段具有50至500个核苷酸的长度，如50至150个核苷酸的长度。特异性引物可以具有与原种事件的5'或3'侧翼区内的序列和原种事件的外源dna的序列分别具有80％至100％同一性的序列，只要错配仍然允许使用这些引物在优化的pcr条件下进行原种事件的特异性鉴定。然而，可允许的错配的范围可以容易地通过实验确定并且是本领域技术人员已知的。
可以以各种方式进行整合片段的检测，例如，通过凝胶分析后的大小评估。也可以直接测序整合片段。用于检测扩增的dna片段的其他序列特异性方法也是本领域已知的。还可以使用标记序列和标记检测来检测扩增的dna片段。例如，可以在反应混合物中包括特异性结合扩增片段的标记探针。标记的探针(fret杂交探针)可以包含荧光标记和淬灭剂，使得当与pcr产物结合时fret盒不再淬灭并且发出荧光。或者，标记的fret盒，即用荧光标记和淬灭剂标记的寡核苷酸，可以包括在反应混合物中，其特异性结合反应混合物中的引物之一，例如fret盒针对反应混合物中使用的引物的5'延伸(参见，例如，参见semagn等人,2014,molbreeding33:1-14,和us7615620)。可以使用本领域已知的方法测量荧光。可以实时测量荧光，即在pcr反应的每个循环中实时测量荧光。也可以在pcr反应结束时测量荧光。
由于引物的序列及其在基因组中的相对位置对于原种事件是独特的，因此整合片段的扩增将仅发生在包含原种事件(的核酸)的生物样品中。当进行pcr以鉴定未知样品中ee-gh7的存在时，优选包括一组引物对照，利用该组引物可以扩增事件的植物物种的“管家基因”内的片段。管家基因是在大多数细胞类型中表达的基因，其涉及所有细胞共有的基础代谢活动。优选地，从管家基因扩增的片段是比扩增的整合片段大的片段。根据待分析的样品，可以包括其他对照。
本领域中描述了标准pcr方案，如在“pcrapplicationsmanual”(rochemolecularbiochemicals，第2版，1999)和其他参考文献中。在“pcr(或聚合酶链反应)鉴定方案”中针对每个原种事件详细描述了pcr的最佳条件，包括特异性引物的序列。然而，应理解，pcr鉴定方案中的许多参数可能需要调整以符合具体实验室条件，并且可以稍微修改以获得类似的结果。例如，使用不同的dna制备方法时，可能需要调整，例如，所使用的引物的量、聚合酶和退火条件。同样，其他引物的选择可能决定pcr鉴定方案的其他最佳条件。然而，对于本领域技术人员来说，这些调整是显而易见的，并且在目前的pcr应用手册中有进一步详述，如以上所引用的那些手册。
或者，特异性引物可用于扩增整合片段，所述整合片段可用作鉴定生物样品中ee-gh7的“特异性探针”。使生物样品的核酸与探针接触，在允许探针与核酸中其相应的片段杂交的条件下，导致形成核酸/探针杂合体。可以(例如，通过标记核酸或探针)检测该杂合体的形成，由此该杂合体的形成表明存在ee-gh7。这种基于与特异性探针杂交的鉴定方法(在固相载体上或在溶液中)已在本领域中描述。特异性探针优选是在优化条件下与如下区域(下文中称为“特异性区域”)特异性杂交的序列，所述区域为原种事件的5'或3'侧翼区内且优选也包含与其连续的外源dna部分的区域。优选地，特异性探针包含50至500bp、优选100至350bp的序列，其与特异性区域的核苷酸序列至少80％、优选80至85％、更优选85至90％、特别优选90至95％、最优选95％至100％相同(或互补)。优选地，特异性探针将包含与原种事件的特异性区域相同(或互补)的约15至约100个连续核苷酸的序列。
适合作为pcr引物用于检测原种事件ee-gh7的寡核苷酸也可用于开发基于pcr的方案以确定含有原种事件的植物的接合性状态。为此，以以下方式设计识别整合之前的野生型基因座的两个引物：所述两个引物彼此相向并且于两引物之间具有插入位点。这些引物可以是特异性识别seqidno.1中包含的5'和3'侧翼序列的引物。这些引物也可以是特异性识别5'或3'侧翼序列的引物。这组引物，连同与转化dna序列(外源dna)互补的第三引物，允许同时诊断性pcr扩增ee-gh7特异性基因座以及野生型基因座。如果植物对于转基因基因座或相应的野生型基因座是纯合的，则诊断性pcr将产生对于转基因或野生型基因座而言典型的(优选在长度上典型的)单个pcr产物。如果植物对于转基因基因座是半合子，则将出现两个基因座特异性的pcr产物，其反映转基因和野生型基因座二者的扩增。
或者，为了确定含有原种事件的植物的接合性状态，可以按以下方式设计识别整合之前的野生型基因座的两个引物：两个引物彼此相向，并且一个引物特异性识别seqidno.1中包含的5'或3'侧翼序列，而另一个引物特异性识别seqidno.1中包含的3'或5'侧翼序列，或特异性识别靶位点缺失。对于本发明，识别整合之前野生型基因座的特别合适的引物是包含或(基本上)由seqidno11和seqidno.12的核苷酸序列组成的引物。这组引物，连同与转化dna序列(外源dna)互补、或与转化dna序列及与其连续的5'或3'侧翼序列互补的第三引物，允许同时诊断性pcr扩增ee-gh7特异性基因座以及野生型基因座，其中该第三引物朝向特异性识别5'或3'侧翼序列的引物的方向(如包含或(基本上)由seqidno13的核苷酸序列组成的引物，其朝向包含或(基本上)由seqidno11的核苷酸序列组成的引物的方向)。如果植物对于转基因基因座或相应的野生型基因座是纯合的，则诊断性pcr将产生对于转基因或野生型基因座典型的单个pcr产物。如果植物对于转基因基因座是半合子，则将出现两个基因座特异性pcr产物，其反映转基因和野生型基因座二者的扩增。
对野生型和转基因基因座典型的pcr产物的检测，可以基于确定pcr产物长度来进行，所述长度对于野生型和转基因基因座可以是典型的。或者，可以通过修饰对靶位点缺失特异的引物和通过修饰对外源dna特异的引物，以及检测并入pcr产物的修饰引物，来检测野生型和转基因基因座典型的pcr产物。例如，可以使用荧光标记，标记对靶位点缺失特异的引物和对外源dna特异的引物，其中两种引物的标记不同。当引物并入pcr产物时，可以检测到荧光。如果植物对于转基因基因座或相应的野生型基因座是纯合的，则仅可以检测到对外源dna特异的引物的标记或仅可以检测到对靶位点缺失特异的引物的标记。如果植物对于转基因基因座是半合子，则可以检测对外源dna特异的引物的标记和对靶位点缺失特异的引物的标记，其反映转基因和野生型基因座二者的扩增。
或者，对靶位点缺失特异的引物和对外源dna特异的引物可具有5'延伸，其特异性结合标记的fret盒，即用荧光标记和淬灭剂标记的寡核苷酸，其中两种引物的5'延伸和相应的fret盒是不同的(参见，例如，参见semagn等人,2014,molbreeding33:1-14,和us7615620)。当引物并入pcr产物中、以及随后fret盒并入pcr产物中时，可以检测荧光。如果植物对于转基因基因座或相应的野生型基因座是纯合的，则仅可以检测到与外源dna特异性引物特异性结合的fret盒的荧光、或仅可以检测到与靶位点缺失特异性引物特异性结合的fret盒的荧光。如果植物对于转基因基因座是半合子，则可以检测到与外源dna特异性引物特异性结合的fret盒的荧光和与靶位点缺失特异性引物特异性结合的fret盒的荧光，其反映转基因和野生型基因座二者的扩增。
如果植物对于转基因基因座或相应的野生型基因座是纯合的，则诊断性pcr将产生对于转基因或野生型基因座典型的，优选长度典型的，单个pcr产物。如果植物对于转基因基因座是半合子的，则将出现两个基因座特异的pcr产物，其反映转基因和野生型基因座二者的扩增。
或者，为了确定含有原种事件的植物的接合性状态，可以如实施例2.2.2中所述，以定量方式在pcr反应中测定事件的存在。为此，以以下方式设计识别转基因的两个引物：两个引物彼此相向，其中一个引物特异性识别seqidno.1中包含的5'或3'侧翼序列(如包含或(基本上)由seqidno5的核苷酸序列组成的引物)，并且其中一个引物特异性识别seqidno.1中的外源dna(如包含或(基本上)由seqidno6的核苷酸序列组成的引物)。这组引物允许ee-gh7特异性基因座的pcr扩增。可以使用标记的探针定量检测扩增的dna片段，所述标记的探针包含在反应混合物中特异性结合扩增的片段(如包含或(基本上)由seqidno7的核苷酸序列组成的探针)。标记的探针(fret杂交探针)可以包含荧光标记和淬灭剂，使得当与pcr产物结合时fret盒不再淬灭并且发出荧光。可以使用本领域已知的方法实时测量荧光，即在pcr反应的每个循环期间测量荧光。荧光超过某一阈值水平时的pcr循环数是所分析的生物样品中ee-gh7特异性基因座的量的量度，并且可以基于参考纯合和杂合样品计算接合性状态。
或者，还可以使用taqman化学和实时pcr原理，基于拷贝数分析，确定包含ee-gh7的植物的接合性状态。该备选方法典型地包括用于量化ee-gh7拷贝数的ee-gh7特异性反应、以及用于ee-gh7拷贝数归一化的内源基因特异性反应。含有纯合状态的ee-gh7事件的样品将具有比半合子样品高两倍的相对拷贝数。在这种方法中，非接合子(azygous)样品不扩增ee-gh7序列。
此外，还可以使用本文提供的原种事件特异性序列的信息，开发不同于pcr扩增方法的原种事件ee-gh7特异性检测方法。这些备选检测方法包括，基于特定核酸结构的侵入性切割的线性信号放大检测方法，也称为invadertm技术(例如美国专利5,985,557“invasivecleavageofnucleicacids”,6,001,567“detectionofnucleicacidsequencesbyinvaderdirectedcleavage”中所述，其通过引用并入本文)。为此，靶序列与标记的第一核酸寡核苷酸杂交，所述第一核酸寡核苷酸包含seqidno1的核苷酸1218至核苷酸1235的核苷酸序列或其互补序列，或所述标记的核酸探针包含seqidno1的核苷酸8015至8032的核苷酸序列或其互补序列；并且进一步与第二核酸寡核苷酸杂交，所述第二核酸寡核苷酸包含seqidno1的核苷酸1200至核苷酸1217的核苷酸序列或其互补序列，或所述标记的核酸探针包含seqidno1的核苷酸8033至核苷酸8050的核苷酸序列或其互补序列，其中第一和第二寡核苷酸重叠至少一个核苷酸。通过该杂交产生的双链或三链结构允许用酶
如本文所用的“试剂盒”是指，用于实施本发明方法的一组试剂，更特别地，用于鉴定生物样品中的原种事件ee-gh7或确定包含ee-gh7的植物材料的接合性状态的一组试剂。更具体地，本发明试剂盒的一个优选实施方案包含如上所述用于鉴定原种事件的至少一个或两个特异性引物，或如上所述用于确定接合性状态的三个特异性引物、或两个特异性引物和一个特异性探针。任选地，试剂盒可以进一步包含本文所述的pcr鉴定方案或本文所述的用于ee-gh7检测的任何其他方案中的任何其他试剂。或者，根据本发明的另一个实施方案，试剂盒可包含如上所述的特异性探针，其与生物样品的核酸特异性杂交以鉴定其中ee-gh7的存在。任选地，试剂盒可以进一步包含用于使用特异性探针鉴定生物样品中的ee-gh7时的任何其他试剂(如但不限于杂交缓冲液、标记物)。
可以使用本发明的试剂盒，并且出于质量控制(例如，种子批次的纯度)、检测植物材料或包含或衍生自植物材料的材料(如但不限于食品或饲料产品)中原种事件的存在或不存在的目的，可以具体地调整试剂盒的组分。
如本文所用，关于核苷酸序列(dna或rna)，“序列同一性”是指具有相同核苷酸的位置数除以两个序列中较短序列的核苷酸数。通过wilbur和lipmann算法(wilbur和lipmann,1983,proc.nat.acad.sci.usa80:726)进行两个核苷酸序列的比对，使用20个核苷酸的窗口大小、4个核苷酸的字长和4的空位罚分。序列数据(包括如上所述的序列比对)的计算机辅助分析和解释，可以例如使用geneticscomputergroup(gcg,universityofwisconsinbiotechnologycenter)的序列分析软件包方便地进行。当序列具有至少约75％、特别是至少约80％、更特别是至少约85％、特别是至少约90％、尤其是至少约95％、更特别是至少约98％、或至少约99％的序列同一性时，序列表示为“基本类似”。很明显，当称rna序列与dna序列基本类似或具有一定程度的序列同一性时，dna序列中的胸苷(t)被认为与rna序列中的尿嘧啶(u)等同。而且，很明显，随着时间的推移，dna序列中可出现小的差异或突变，并且对于本发明事件特异性的引物或探针，可以允许一些错配，因此在本文中在本发明任何实施方案中，针对任何3'或5'侧翼dna或任何插入或外源dna或本发明任何引物或探针描述的任何dna序列，也包括与本文提供的序列基本类似的序列，如与针对本发明的任何3'或5'侧翼dna、任何引物或探针、或任何插入或外源dna所给出的序列杂交、或与之具有至少90％、95％、96％、97％、98％或至少99％序列同一性的序列。
如本文所用的术语“引物”涵盖能够在模板依赖性方法(如pcr)中引发新生核酸合成的任何核酸。通常，引物是10至30个核苷酸的寡核苷酸，但可以使用更长的序列。引物可以以双链形式提供，尽管优选单链形式。探针可用作引物，但可以被设计用于结合靶dna或rna，并且不需要用于扩增过程。
当提及特异性引物时，本文所用的术语“识别”是指特异性引物在方法所设置的条件(如pcr鉴定方案的条件)下与原种事件中的核酸序列特异性杂交的事实，其中特异性可以由阳性和阴性对照的存在来确定。
当提及特异性探针时，本文所用的术语“杂交”是指探针在标准严谨条件下与原种事件的核酸序列中的特异性区域结合的事实。本文所用的标准严谨条件是指本文所述的杂交条件或sambrook等人,1989(molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,coldspringharborlaboratorypress,ny)中所述的常规杂交条件，例如其可包括以下步骤：1)将植物基因组dna片段固定在滤膜上，2)将滤膜在42℃在50％甲酰胺、5×sspe、2×denhardt试剂和0.1％sds中预杂交1至2小时，或在68℃在6×ssc、2×denhardt试剂和0.1％sds中预杂交1至2小时，3)加入已标记的杂交探针，4)孵育16至24小时，5)在室温下在1×ssc、0.1％sds中洗涤滤膜20分钟，6)将滤膜在68℃在0.2×ssc、0.1％sds中洗涤三次，每次20分钟，和7)在-70℃下用增感屏将滤膜暴露至x-射线胶片24-48小时。
如本文所用，生物样品是植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品。术语“植物”旨在包括任何成熟阶段的棉花(陆地棉(gossypiumhirsutum))植物，以及取自或衍生自任何这种植物的任何细胞、组织或器官，包括但不限于任何种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。如本文所用，“植物材料”是指从植物获得或衍生的材料。包含植物材料的产品涉及食品、饲料、或使用植物材料生产的或可被植物材料污染的其他产品。应当理解，在本发明的上下文中，在该生物样品中检测到ee-gh7特异性核酸的存在，意味着样品中核酸的存在。因此，本文提及的用于鉴定生物样品中原种事件ee-gh7的方法涉及在包含原种事件的核酸的生物样品中的鉴定。
如本文所用，“包含”应解释为表示所述的特征、整数、步骤、试剂或组分的存在，但不排除存在或添加一个或多个特征、整数、步骤或组分、或其组。因此，例如，包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质可包含比实际述及的核苷酸或氨基酸更多的核苷酸或氨基酸，即嵌入更大的核酸或蛋白质中。包含功能上或结构上确定的dna序列的嵌合基因可包含额外的dna序列，如启动子和转录终止序列。
本发明还涉及在包含该事件的棉花植物中开发原种事件ee-gh7，从这些植物中获得包含原种事件ee-gh7的后代植物和种子，以及涉及衍生自包含该事件的植物的植物细胞或植物材料。可以如实施例1中所述获得包含原种事件ee-gh7的植物。本发明还涉及以保藏号pta-122856保藏在atcc的包含原种事件ee-gh7的种子、或自该种子衍生的包含原种事件ee-gh7的衍生物。本文所用的“(种子的)衍生物”是指可以从该种子生长的植物、由杂交或回交产生的其后代、以及植物细胞、器官、部分、组织、细胞培养物、原生质体和植物材料。
可以根据实施例中描述的任一种ee-gh7鉴定方案，鉴定包含ee-gh7的棉花植物或植物材料，包括实施例2.1中描述的针对ee-gh7的pcr鉴定方案、如实施例2.2中描述的实时pcr测定法、或如实施例2.3中描述的终点taqman。简言之，通过pcr扩增生物样品中存在的棉花基因组dna，其中使用特异性识别ee-gh7的5'或3'侧翼序列内的序列的引物，如具有seqidno：3、seqidno.5或seqidno.11的序列的引物，以及识别外源dna中序列的引物，如具有seqidno.4或seqidno.6的序列的引物，或使用识别ee-gh7的5'或3'侧翼序列和与其邻接的外源dna的引物，如具有seqidno.13的序列的引物。扩增内源棉花序列部分的dna引物可用作pcr扩增的阳性对照。如果在pcr扩增时，该材料产生预期大小的片段或产生预期荧光标记的荧光，则该材料含有来自具有原种事件ee-gh7的棉花植物的植物材料。
具有ee-gh7的植物的特征在于它们的草甘膦耐受性、以及它们对hppd抑制剂如异
本发明的一个实施方案提供棉花植物中的原种事件，其可通过在棉花基因组中的特定位置插入2个转基因而获得，该原种事件赋予这种棉花植物对草甘膦和hppd抑制剂除草剂如异
本文还提供了包含事件ee-gh7的棉花植物或其部分，其中包含事件ee-gh7的代表性棉花种子已经以atcc保藏号pta-122856保藏。本文进一步提供了包含该事件的植物的种子、以及由此种子产生的棉产品，其中所述棉产品包含事件ee-gh7。该棉产品可以是棉纤维或包含棉纤维的产品。特别地，棉产品包含可以产生用于诊断事件ee-gh7或特异于事件ee-gh7的扩增子的核酸，该扩增子包含seqidno.3或4。本文还提供用于生产棉产品的方法，其包括获得包含事件ee-gh7的棉花植物或纤维，和由其生产棉产品。
本文还提供了棉花植物，其是任何上述棉花植物的后代，并且包含事件ee-gh7。
本文进一步提供了生产耐受草甘膦和/或异
本文还提供了草甘膦和/或异
本文进一步提供在包含事件ee-gh7的棉花植物的田地中控制杂草、或在待种植该棉花植物的田地中控制杂草的方法，包括用有效量的基于异
本文进一步提供包含seqidno1的序列或包含与其基本类似的序列的dna，以及包含此dna序列的任何(特别是棉花的)植物、细胞、组织或种子，如包含ee-gh7的植物、细胞、组织或种子。本文还包括任何棉花植物、细胞、组织或种子，其包含seqidno.1的dna序列(对于常规棉花植物、种子、组织或细胞是异源的或外源的)、或包含与seqidno.1的序列具有至少99％或99.5％的序列同一性的dna序列。
本发明还描述了包含外源dna的嵌合dna，其中所述外源dna的序列由seqidno.1的核苷酸1218至核苷酸8032的序列组成，该序列的侧翼为5'和3'侧翼区，其中在所述外源dna的紧邻上游并与所述外源dna连续的5'侧翼区的特征在于由seqidno.1的核苷酸1至核苷酸1217的序列组成，并且其中所述外源dna的直接下游并与所述外源dna连续的3'侧翼区的特征在于由seqidno.1的核苷酸8033至核苷酸9328的序列组成。
嵌合dna是指dna序列，其包括在自然界中不存在于一起的调控序列和编码序列。因此，嵌合dna可以包含彼此相邻的dna区域，所述dna区域衍生自不同来源，或者以不同于天然存在的方式排列。嵌合dna可以由seqidno.1的序列组成。
本文还提供，在其基因组中包含事件ee-gh7的转基因棉花植物、植物细胞、组织或种子，其特征在于包含与seqidno.1的核苷酸1207至核苷酸1228基本类似的核苷酸序列的核酸分子、和包含与seqidno.1的核苷酸8022至8043或所述序列的互补序列基本类似的核苷酸序列的核酸分子；以及在其基因组中包含事件ee-gh7的棉花植物、植物细胞、组织或种子，其特征在于包含与seqidno.1或所述序列的互补序列基本类似的核苷酸序列的核酸分子。
本文甚至进一步提供包含ee-gh7的棉花植物、细胞、组织或种子，其特征在于，在其细胞的基因组中包含与seqidno.1的核苷酸1207至核苷酸1228具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的核酸序列、和与seqidno.1的核苷酸8022至8043或所述序列的互补序列具有至少80％、90％、95％或100％序列同一性的核酸序列。
如本文所用，术语“异
在本发明的一个实施方案中，在播种棉花之前，可以用hppd抑制剂除草剂(如异
在本发明的另一个实施方案中，可以在棉花植物出苗之前但在种子播种之后，用hppd抑制剂除草剂(如ift)处理播种了含有ee-gh7事件的种子的田地(可以在播种之前使用其他方法使田地无杂草，通常是传统的耕作方法，如犁耕、凿耕或种床准备)，其中残余活性将使田地保持没有除草剂灭杀的杂草，使得出苗和生长的棉花植物没有杂草竞争(出苗前施用hppd抑制剂除草剂)。一旦棉花植物具有一定的大小并且杂草倾向于重新出现，草甘膦或hppd抑制剂-草甘膦混合物可作为出苗后除草剂施用于植物顶部。
在本发明的另一个实施方案中，可以用hppd抑制剂除草剂(如ift)处理含有ee-gh7事件的植物，施加在从播种的种子出苗的棉花植物的顶部，清除田地中被hppd抑制剂灭杀的杂草，该施用可以与使用草甘膦(作为出苗后除草剂，处理植物顶部)一起(例如，在喷雾罐混合物中)、或者在之前或之后进行(出苗后施用hppd抑制剂除草剂(含或不含草甘膦))。
此外，根据本发明，含有ee-gh7的棉花植物可用下列杀虫剂、除草剂或杀真菌剂处理，或含有ee-gh7的棉花种子可用包含下列杀虫剂、除草剂或杀真菌剂的包衣包被：
棉花除草剂：
唑草酮(carfentrazone)、烯草酮(clethodim)、敌草隆(diuron)、氟禾草灵(fluazifop-butyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、伏草隆(fluometuron)、草铵膦(glufosinate)、草甘膦、异
棉花杀虫剂：
阿维菌素(abamectin)、乙酰甲胺磷(acephate)、啶虫脒(acetamiprid)、涕灭威(aldicarb)、印楝素(azadirachtin)、联苯菊酯(bifenthrin)、氯虫苯甲酰胺(rynaxypyr)、毒死蜱(chlorpyrifos)、噻虫胺(clothianidin)、氰虫酰胺(cyazypyr)、(β-)氟氯氰菊酯(cyfluthrin)、γ-氯氟氰菊酯(cyhalothrin)、λ-氯氟氰菊酯(cyhalothrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、溴氰菊酯(deltamethrin)、丁醚脲(diafenthiuron)、呋虫胺(dinotefuran)、甲氨基阿维菌素-苯甲酸盐(emamectin-benzoate)、氟啶虫酰胺(flonicamid)、氟虫双酰胺(flubendiamide)、fluensulfone、氟吡菌酰胺(fluopyram)、氟吡呋喃酮(flupyradifurone)、imicyafos、吡虫啉(imidacloprid)、茚虫威(indoxacarb)、氰氟虫腙(metaflumizone)、吡蚜酮(pymetrozine)、啶虫丙醚(pyridalyl)、杀虫剂(pyrifluquinazon)、乙基多杀菌素(spinetoram)、多杀菌素(spinosad)、螺甲螨酯(spiromesifen)、螺虫乙酯(spirotetramat)、氟啶虫胺腈(sulfoxaflor)、噻虫啉(thiacloprid)、噻虫嗪(thiamethoxam)、硫双威(thiodicarb)、杀铃脲(triflumuron)、1-(3-氯吡啶-2-基)-n-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2h-四唑-2-基]甲基}-1h-吡唑-5-甲酰胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-n-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1h-四唑-1-基]甲基}-1h-吡唑-5-甲酰胺、1-{2-氟-4-甲基-5-[(2,2,2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺、(1e)-n-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-n'-氰基-n-(2,2-二氟乙基)乙脒、坚强芽孢杆菌(bacillusfirmus)、坚强芽孢杆菌菌株i-1582、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、枯草芽孢杆菌菌株gb03、枯草芽孢杆菌菌株qst713、金龟子绿僵菌(metarhiziumanisopliae)f52。
棉花杀真菌剂：
嘧菌酯(azoxystrobin)、n-[9-(二氯亚甲基)-1,2,3,4-四氢-1,4-亚甲基萘-5-基]-3-(二氟甲基)-1-甲基-1h-吡唑-4-甲酰胺(benzovindiflupyr、benzodiflupyr)、联苯吡菌胺(bixafen)、啶酰菌胺(boscalid)、多菌灵(carbendazim)、百菌清(chlorothalonil)、铜(copper)、环丙唑醇(cyproconazole)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、醚菌胺(dimoxystrobin)、氟环唑(epoxiconazole)、咪唑菌酮(fenamidone)、氟啶胺(fluazinam)、氟吡菌酰胺(fluopyram)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、氟唑菌酰胺(fluxapyroxad)、种菌唑(ipconazole)、异菌脲(iprodione)、吡唑萘菌胺(isopyrazam)、异噻菌胺(isotianil)、代森锰(mancozeb)、锰乃浦(maneb)、精甲霜灵(mefenoxam)、甲霜灵(metalaxyl)、苯氧菌胺(metominostrobin)、戊菌隆(pencycuron)、氟唑菌苯胺(penflufen)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、甲基代森锌(propineb)、丙硫菌唑(prothioconazole)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、五氯硝基苯(quintozene)、氟唑环菌胺(sedaxane)、戊唑醇(tebuconazole)、氟醚唑(tetraconazole)、甲基硫菌灵(thiophanate-methyl)、唑菌醇(triadimenol)、肟菌酯(trifloxystrobin)、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株i-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株gb03、枯草芽孢杆菌菌株qst713。
以下实施例描述了原种事件ee-gh7的开发和鉴定、包含该事件的不同棉花品系的开发、以及用于在生物样品中特异性鉴定原种事件ee-gh7的工具的开发。
除非在实施例中另有说明，否则所有重组技术均按照“sambrookjandrusselldw(编辑)(2001)molecularcloning:alaboratorymanual,3rdedition,coldspringharborlaboratorypress,newyork”和“ausubelfa,brentr,kingstonre,mooredd,seidmanjg,smithjaandstruhlk(eds.)(2006)currentprotocolsinmolecularbiology.johnwiley&sons,newyork”中描述的标准方案进行。
标准材料和参考文献描述于“croyrdd(编辑)(1993)plantmolecularbiologylabfax,biosscientificpublishersltd.,oxfordandblackwellscientificpublications,oxford”andin“brownta,(1998)molecularbiologylabfax,第二版,academicpress,sandiego”。用于聚合酶链反应(pcr)的标准材料和方法可见于“mcphersonmjand
应当理解，以下实施例中任何实验室方案如pcr方案中的许多参数，可能需要根据特定的实验室条件调整，并且可以稍微修改以获得类似的结果。例如，pcr方法中，使用不同的方法制备dna或选择其他引物，可能决定pcr方案的其他最佳条件。然而，这些调整对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且在当前的pcr应用手册中有进一步详述。
包含在“bcs16-2014_st25.txt”文件中的序列表，2万字节(在
在说明书和实施例中，涉及以下序列：
seqidno.1：ee-gh7中外源dna的核苷酸序列和植物侧翼序列
seqidno.2：插入前植物dna序列
seqidno.3：引物prim0728
seqidno.4：引物prim0643
seqidno.5：引物prim0638
seqidno.6：引物prim0639
seqidno.7：探针tm1576
seqidno.8：引物kvm157
seqidno.9：引物kvm158
seqidno.10：探针tm1304
seqidno.11：引物prim0726
seqidno.12：引物prim0733
seqidno.13：引物prim0731
实施例
1.用除草剂耐受性基因转化陆地棉(gossypiumhirsutum)
1.1.描述包含2mepeps和hppdpf-w336-1pa嵌合基因的外源dna
使用含有hppdpf-w336-1pa和2mepsps表达盒的载体ptsih09，通过农杆菌介导的转化，开发ee-gh7棉花。
(i)编码2mepsps蛋白的双突变5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(2mepsps)基因。通过在克隆自玉米(zeamays)的野生型epsps基因的位置102(用异亮氨酸取代苏氨酸)和位置106(用丝氨酸取代脯氨酸)引入点突变，来开发2mepsps编码序列(lebrun等人,1997(wo9704103))。2mepsps蛋白的表达赋予对草甘膦除草剂的耐受性。
(ii)hppdpf-w336-1pa基因编码hppdw336蛋白。通过引入单个点突变，导致源自荧光假单胞菌的野生型hppd基因的氨基酸甘氨酸336被色氨酸置换，来开发hppdpf-w336-1pa编码序列(boudec等人,2001,(美国专利us6245968b1))。hppdw336蛋白的表达赋予对hppd抑制剂除草剂(如异
质粒ptsih09是植物转化载体，其含有嵌合2mepsps基因和嵌合hppdpf-w336-1pa基因位于t-dna右边界(rb)和t-dna左边界(lb)之间。t-dna右和左边界之间包含的遗传元件的描述在下表1中给出。核苷酸序列在seqidno.1中。
表1.在植物基因组中插入的ptsih09的dna的核苷酸位置(seqidno.1的nt1218-8032)
1.2.事件ee-gh7
将t-dna载体ptsih09导入根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)c58c1rif(peha101)中，并根据本领域已知的方法使用壮观霉素和链霉素选择棉花。
根据本领域已知的方法用农杆菌菌株转化棉花品种“coker312”，体外选择对草甘膦(1.0-1.5mm)耐受的转基因植物，然后将转化的植物细胞再生成转基因的可育棉花植物。用环磺酮(tembotrione,hppd抑制剂除草剂)处理t0植物以选择hppdpfw336-1pa基因的表达。然后将存活的植物自花授粉以产生t1种子。随后通过自花授粉产生t2至t7代。用草甘膦喷洒t1和t2植物的子样品以确保2mepsps基因在这些世代中表达。在田间生长的t3至t7代中，用草甘膦喷洒每个自交代以确保2mepsps基因的表达。
1.2.1原种事件ee-gh7的鉴定
基于广泛选择步骤，基于性状功效、除草剂耐受性基因的良好表达和稳定性、以及其与最佳农艺特征的兼容性(所述最佳农艺特征如植物高度、高度比节点、棉铃保留、直立、活力、纤维长度、纤维强度和棉绒产率)，选择原种事件ee-gh7。含有该事件的棉花植物选自使用相同嵌合基因获得的大量不同的转化事件。用于选择该事件的参数是：a)在田间试验中对异
1.2.1.1事件的结构稳定性
在t1、t3、t4、bc1f2和bc2f3世代中使用southern印迹分析测定ee-gh7的结构稳定性。这些southern印迹分析的结果证明在所有测试世代中事件具有结构稳定性。
1.2.1.2事件的遗传
通过pcr分析测试hppdpfw336-1pa和2mepsps基因的基因型，在f2、bc1f2和bc2f2世代中测试外源dna插入的遗传。针对三个世代的ee-gh7棉花测定的分离比率证实，ee-gh7插入序列中包含的hppdpfw336-1pa和2mepsps基因以可预测的方式遗传并且如预期地为单插入。这些数据与孟德尔原则一致，并支持如下结论：ee-gh7事件由整合到棉花核基因组内的单个染色体基因座中的单个插入构成。
1.2.1.3蛋白质表达的稳定性
通过夹心酶联免疫吸附测定法(elisa)，在从三个世代(t4、t5和bc2f4)的ee-gh7棉花收集的叶和具绒毛种子样品中，测定hppdw336和2mepsps蛋白的蛋白质表达水平。
在t4、t5和bc2f4世代中，在4-6叶生长阶段(bbch14-16)，叶中的hppdw336平均表达水平分别为442.73、421.06和410.89μg/gdw。在三个世代中，在成熟生长阶段(bbch83-97)，具绒毛种子中hppdw336的平均表达水平分别为42.83、42.45和34.97μg/gdw。
在t4、t5和bc2f4世代中，在4-6叶生长期(bbch14-16)，叶中的2mepsps的平均表达水平分别为1078.03、1115.46和1498.30μg/gdw。在三个世代(t4、t5和bc2f4)中，在成熟生长阶段(bbch83-97)，具绒毛种子中的2mepsps的平均表达水平分别为163.07、160.49和147.80μg/gdw。
hppdw336和2mepsps分别在三个世代中在叶和具绒毛种子中表现出类似的平均表达水平。因此，证明hppdw336和2mepsps的蛋白质表达在三个世代中是稳定的。
1.2.1.4农艺性能和对异
在农艺学等效性试验中，包含ee-gh7的植物与无效分离子(nullsegregant)和野生型对应物的表现类似。与相应的非转基因植物相比，包含ee-gh7的植物具有正常的农艺学特征。
在田间的不同位置测试包含ee-gh7的植物对ift、草甘膦及其组合的耐受性。包含ee-gh7的植物显示出对单独的ift的良好耐受性，特别是当在出苗前施用ift时。包含ee-gh7的植物对出苗后施用的草甘膦以及对ift和草甘膦的组合(尤其是在出苗前施用ift并且在出苗后施用草甘膦时)，也显示出良好的耐受性。重要的是，包含ee-gh7的植物对草甘膦的耐受性等于或优于wo2007/017186的原种草甘膦耐受事件ee-gh3的草甘膦耐受性。看来目前获得的数据表明，包含ee-gh7的植物的性能至少等于或优于wo2013/026740中所述的包含hppd和epsps嵌合基因的植物的性能。
为了评估ghb811棉花在代表商业栽培的田间条件下的农艺性能，进行了多地点田间评价。农艺评估包括15个地点(一年内进行了7个地点，另一年进行了8个地点)，代表了不同的棉花种植区域。
一个田间地点内的所有地块都经历相同的生长条件和管理(即栽培、灌溉、肥料、维护性杀虫剂处理)。每个田间试验中的每个地块都具有相同的大小。
用性状特异性除草剂处理的ee-gh7棉花地块，接受每种性状特异性除草剂各一次喷雾施用。在出苗前或出苗后不久(bbch00至13)，以每公顷100.3至115.2克活性成分(gai/ha)的比率，进行一次ift施用。在6至9叶生长阶段(bbch16至19)，以1067至1222gai/ha的比率，进行一次gly施用。
在每个田间试验地点，在整个生长季测量以下农艺参数。在每个田间试验中报告每个单独地块的数据。
连续参数：
·早期直立计数
·地面覆盖百分比
·到第一朵花的天数和热量单位(heatunits)
·到第一个吐絮棉铃的天数和热量单位
·吐絮棉铃百分比
·最终直立计数
·棉铃性质
·种子棉产率
·棉绒产率
·link(纤维)性质
分类参数：
·非生物胁迫因子(abioticstressor)评级
·疾病胁迫因子(diseasestressor)评级
·昆虫胁迫因子(insectstressor)评级
·棉铃类型
·植物倒伏
将非gm对应物(coker312)的农艺观察与未用ift和gly处理的ee-gh7棉花进行比较，并且还与用ift和gly处理的ee-gh7棉花进行比较。
在非gm对应物(coker312)和未用性状特异性除草剂处理的ee-gh7棉花之间，在连续参数最终直立计数、种子棉产率、棉绒产率和高度节点比率中，检测到统计学显著差异。在非gm对应物和两种ee-gh7棉花记录(处理和未处理)之间，在棉铃重量上也检测到统计学显著差异。ee-gh7棉花(处理或未经处理)的连续农艺参数的所有平均值均在参考品种的范围内。因此，统计学显著差异被认为是非生物学相关的。
针对分类参数——棉铃类型、植物倒伏、四个昆虫胁迫因子评级、四个疾病胁迫因子评级、和四个非生物胁迫因子评级，进行了统计学结果的组合位点总结。对于十四个分类参数中的十三个，没有检测到由cmh检验p-值<0.05所定义的统计学显著差异。在非gm对应物和两种ee-gh7棉花记录(处理和未处理)之间，观察到对第三个疾病胁迫因子评级的统计学显著差异。在第三个疾病胁迫因子评级中，ee-gh7棉花(处理或未经处理)的所有平均值均落在参考品种的范围内，因此统计学上的显著差异被认为是非生物学相关的。
根据农艺评估，ee-gh7棉花没有表现出与非gm对应物生物学相关的差异，并显示出与非gm参考品种等同的农艺性能。
1.2.2鉴定原种事件ee-gh7的侧翼区和外源dna
ee-gh7原种事件中包含除草剂耐受性基因的外源dna的侧翼区的序列如下确定：
1.2.2.1右侧(5')侧翼区
测序鉴定为包含5'侧翼区的片段，其核苷酸序列在seqidno.1的核苷酸1-1217中给出。
1.2.2.2左侧(3')侧翼区
测序鉴定为包含3'侧翼区的片段，其核苷酸序列在seqidno.1的核苷酸8033-9328中给出。
1.2.2.3ee-gh7的包含除草剂耐受性基因的外源dna
对ee-gh7中外源dna和侧翼dna序列的确认性完整dna测序，产生了seqidno.1中报道的序列。原种事件ee-gh7中包含除草剂耐受性基因的外源dna的序列在seqidno.1的核苷酸1218-8032中给出。seqidno1的核苷酸1至1217的5'侧翼序列在该外源dna之前的紧邻上游并与该外源dna连续，并且seqidno1的核苷酸8033至核苷酸9328的3'侧翼序列在该外源dna之后的紧邻下游并与该外源dna连续。
1.2.2.4插入前植物dna的鉴定
通过pcr扩增插入前植物dna。鉴定了扩增片段的核苷酸序列(seqidno.2)。seqidno.2的核苷酸1218-1230是缺失的ee-gh7转基因基因座(靶位点缺失)。seqidno.2的核苷酸1-1217对应于ee-gh7的5'侧翼序列，seqidno.2的核苷酸1231-2526对应于ee-gh7的3'侧翼序列。
2.开发ee-gh7的鉴定方案
2.1.用于检测ee-gh7事件特异性序列的聚合酶链反应
2.1.1引物
开发了特异性引物，其识别原种事件中的序列。
开发一个引物以识别ee-gh7的5'侧翼区内的序列。然后在外源dna的序列内选择第二引物，使得该两个引物跨越约126个核苷酸的序列。发现以下引物在ee-gh7dna的pcr反应中给出了明确和可重复的结果：
靶向5'侧翼序列的正向引物：
prim0728：5’-ctccgaatagttccatcaattttatca-3’(seqidno.:3)
靶向外源dna的反向引物：
prim0643:5’-tgatcgggccttaattaaccc-3’(seqidno.:4)
优选地，必须在分析的所有样品的相同量的dna上进行适当的分类特异性参考体系反应，以证明样品原则上对于pcr分析是有功能的。这种分类特异性参考体系可以由靶向内源序列的引物组成，这些引物包括在pcr混合物中。这些引物在未知样品和dna阳性对照中用作内部对照。使用内源引物对得到的阳性结果表明，样品原则上对于pcr分析是有功能的，并且在基因组dna制备物中存在足够质量的大量dna可以用于产生pcr产物。
2.1.2扩增的片段
pcr反应中预期的扩增片段是：
对于引物对prim0728-prim0643：126bp(ee-gh7原种事件)
2.1.3模板dna
使用agowasbeadexmaxiplantkit制备模板dna。当使用以其他方法制备的dna时，应该使用不同量的模板进行测试运行。通常50ng的基因组模板dna产生最佳结果。
2.1.4指定的阳性和阴性对照
为了避免假阳性或假阴性，确定在pcr运行中应包括以下阳性和阴性对照：
-无模板对照(dna阴性对照)。这是一种在反应中没有加入dna的pcr。当观察到预期结果——没有pcr产物时，表明pcr混合物未被靶dna污染。
-阳性dna对照(已知含有转基因序列的基因组dna样品)。该阳性对照的成功扩增表明，pcr在允许靶序列扩增的条件下运行。
-阴性dna对照(野生型dna对照)。这是一种提供的模板dna是从非转基因植物制备的基因组dna的pcr。当观察到预期结果，即，没有事件特异性pcr产物的扩增但有内源pcr产物的扩增时，表明在基因组dna样品中没有可检测的转基因背景扩增。
2.1.5pcr条件
在以下条件下获得了最佳结果(在描述最佳结果的各种条件时，意在提供这些条件的实例。显然，本领域技术人员可以改变条件、试剂和参数，如使用其他taq聚合酶，并获得期望的结果)：
-用于25μl反应的pcr混合物包含：
50ng模板dna
5.0μl5x扩增缓冲液(由制造商提供，配有taq聚合酶)
0.25μl20mmdntp
0.7μlprim0728(10皮摩尔/μl)
0.7μlprim0643(10皮摩尔/μl)
0.1μltaqdna聚合酶(5单位/μl)
水至25μl
-获得最佳结果的热循环如下：
2.1.6琼脂糖凝胶分析
为了最佳地可视化pcr结果，确定将约25μlpcr样品上样到3％琼脂糖凝胶上(tris-硼酸盐缓冲液，溴化乙锭染色)，其中使用适当的分子量标记(例如50bpladder)。
2.1.7验证结果
确定来自单个pcr运行和单个pcr混合物的转基因植物dna样品的数据应是不可接受的，除非1)dna阳性对照显示预期的pcr产物(转基因片段，以及如果包括的话，内源片段)，2)dna阴性对照为pcr扩增阴性的(无片段)，和3)野生型dna对照对于转基因片段的pcr扩增是阴性的，并且如果包括的话，对于内源片段是阳性的。
当遵循如上所述的ee-gh7的pcr鉴定方案时，显示可见量的预期大小的转基因pcr产物的泳道表明，用于制备基因组模板dna的相应植物已遗传了ee-gh7原种事件。未显示可见量的转基因pcr产物的泳道表明，用于制备基因组模板dna的相应植物不包含原种事件。
2.1.8使用区分性pcr方案鉴定ee-gh7
在尝试筛选未知样品之前，用所有适当的对照进行测试运行。开发的方案可能需要就实验室之间可能不同的组分(模板dna制备、taqdna聚合酶、引物质量、dntp、热循环仪等)，进行优化。
根据上述方案测试了来自许多棉花植物的叶材料，其中一些棉花植物包含ee-gh7。来自原种事件ee-gh7和来自棉花野生型的样品分别作为阳性和阴性对照。
图2显示了在许多棉花植物样品上用ee-gh7的原种事件pcr鉴定方案获得的结果。泳道2、3、4、11、12和13中的样品代表阴性对照(无模板)；泳道5、6和7含有来自野生型棉花植物的dna。泳道8、9和10包含来自棉花转化事件ee-gh7的样品，泳道1和14是分子量标记(50bpladder)。可以看出，对棉花转化事件ee-gh7特异性地产生了126bp的pcr片段。
2.2.用于检测ee-gh7事件特异性序列的实时pcr测定法
2.2.1用于大批种子中ee-gh7检测的实时pcr测定法
建立实时pcr测定法以检测大批种子中低水平ee-gh7的存在。
以下引物应用于该靶向pcr反应中：
靶向5'侧翼序列的正向引物：
prim06385’–cgaatagttccatcaattttatcatttatg-3’(seqidno.5)
靶向外源dna序列的反向引物：
prim06395’–tcgggccttaattaacccg–3’(seqidno.6)
预期在pcr反应中从这些引物扩增的片段是120bp。
靶向5'侧翼-外源dna接合序列的探针：
tm15765’-agaacaacagtactgggc-3’(seqidno.7)
tm1576探针在5'末端用fam标记，在3'末端用非荧光淬灭剂mgbnfq标记。
在使用agowasbeadexmaxiplantkit制备的约200ng模板dna上进行靶pcr反应。当使用以其他方法制备的dna时，应使用具有已知ee-gh7相对水平的样品进行测试运行。
必须在所有分析样品的相同量的dna上进行适当的分类特异性参考体系反应，以证明样品原则上对于pcr分析是有功能的。
对于未知的测试样品，pcr实验应理想地包括适当的阳性和阴性对照样品，即：
-无模板对照(dna阴性对照)。这是一种反应中没有加入dna的pcr。当对靶标和参考体系反应两者均观察到预期结果(无pcr产物)时，表明pcr混合物未被靶dna污染。
-阳性dna对照(已知含有转基因序列的基因组dna样品)。该阳性对照的成功扩增表明pcr已经在允许靶序列扩增的条件下运行。
-在该pcr中还可以加入阴性dna对照(野生型dna对照)。这是一种提供的模板dna是从非转基因植物制备的基因组dna的pcr。当观察到预期结果，即，没有转基因pcr产物的扩增，但有内源pcr产物的扩增时，表明在基因组dna样品中没有可检测的转基因背景扩增。
使用quantabioscience提供的2xperfectaqpcrfastmixii，lowrox(目录号95120)验证该方案。可以应用任何其他反应缓冲液，但是在分析未知内容的样品之前，需要使用适当的阳性和阴性对照组成功验证该方案。在以下条件下获得最佳结果：
-用于20μl反应的pcr混合物包含：
200ng模板dna
10μl2xperfectaqpcrfastmixii，lowrox(quantabiosciences)
0.5μlprim0638(10皮摩尔/μl)
0.5μlprim0639(10皮摩尔/μl)
0.5μltm1576(10皮摩尔/μl)
加水至20μl
-为获得最佳结果的热循环如下：
通过在60℃，1分钟的步骤中测量fam报告染料来实时测量靶标的扩增。
用于包含ee-gh7的基因组dna的5倍稀释物的ee-gh7实时pcr鉴定方案的结果如图3所示。图3显示在达到阈值水平的pcr循环与包含ee-gh7的dna的稀释度之间存在明显的相关性。
2.2.2ee-gh7拷贝实时pcr测定法用于在单个植物/单个种子上确定事件存在和接合性
建立拷贝实时pcr测定法，以量化单个植物/单个种子中ee-gh7的存在和确定ee-gh7的接合性。
在针对转基因dna序列的该靶pcr反应中应用的引物和探针，与实施例2.2.1中针对大批种子中ee-gh7检测的实时pcr测定法所描述的引物和探针相同。
靶向5'侧翼序列的正向引物：
prim06385’–cgaatagttccatcaattttatcatttatg-3’(seqidno.5)
靶向外源dna序列的反向引物：
prim06395’–tcgggccttaattaacccg–3’(seqidno.6)
预期在pcr反应中自这些引物扩增的片段是120bp。
靶向5'侧翼-外源dna接合序列的探针：
tm15765’-agaacaacagtactgggc-3’(seqidno.7)
tm1576探针在5'末端用fam标记，在3'末端用非荧光淬灭剂mgbnfq标记。
靶向内源序列的以下引物也包括在pcr混合物中。这些引物在未知样品和dna阳性对照中用作内部对照。使用内源引物对的阳性结果(存在74bp的pcr扩增片段)表明，在基因组dna制备物中存在足够质量的大量dna用于产生pcr产物。合适的内源引物可以是经选择以识别棉花中管家基因的引物，如：
靶向内源靶基因序列的正向引物：
kvm157:5’-cacatgacttagcccatctttgc-3’(seqidno.:8)
靶向内源靶基因序列的反向引物：
kvm158:5'-cccacccttttttggtttagc-3'(seqidno.:9)
预期在pcr反应中自这些引物扩增的片段是74bp。
靶向内源靶基因序列的探针：
tm1304:5'-tgcaggttttggtgccactgtgaatg-3'(seqidno.:10)
tm1304探针在5'末端用joe标记，在3'末端用非荧光淬灭剂bhq1标记。
使用quantabioscience提供的2xperfectaqpcrfastmixii，lowrox(目录号95120)验证该方案。可以应用任何其他反应缓冲液，但是在分析未知内容的样品之前，需要使用适当的阳性和阴性对照组成功验证该方案。在以下条件下获得最佳结果：
-用于10μl反应的pcr混合物包含：
10ng模板dna
5μl2xperfectaqpcrfastmixii，lowrox(quantabiosciences)
0.5μlprim0638(10皮摩尔/μl)
0.5μlprim0639(10皮摩尔/μl)
0.5μlkvm157(10皮摩尔/μl)
0.5μlkvm158(10皮摩尔/μl)
0.1μltm1576(10皮摩尔/μl)
0.1μltm1304(10皮摩尔/μl)
加水至10μl
-为获得最佳结果的热循环如下：
在60℃，30秒的步骤中通过测量fam报告染料来实时测量靶标的扩增，并在60℃，30秒的步骤中通过测量joe报告染料来实时测量内源对照的扩增。
为了避免假阳性或假阴性，确定在pcr运行中应包括以下阳性和阴性对照：
-纯合子对照：含有所描述的靶序列的纯合子的基因组dna样品
-半合子对照：含有所描述的靶序列的半合子的基因组dna样品
-野生型对照(dna阴性对照)：不含所述靶序列的基因组dna样品
-无模板对照(ntc)：水样品
使用ddct方法进行数据分析。在该方法中，相对于参考样品，计算每个测试样品的接合性。使用该方法，对于ee-gh7半合子的dna样品，拷贝数计算为1，而对于ee-gh7纯合子的dna样品，拷贝数计算为2，表明该方法可用于确定ee-gh7的接合性状态。
2.3.用于检测ee-gh7事件特异性序列的终点taqman
在用于ee-gh7检测的终点taqman中使用的引物和探针，与实施例2.2.2中描述的用于单个植物/单个种子上检测ee-gh7的拷贝实时pcr测定法的引物和探针相同。
-用于10μl反应的pcr混合物包含：
10ng模板dna
5μl2xperfectaqpcrfastmixii，low(quantabiosciences，目录号95119)
0.5μlprim0638(10皮摩尔/μl)
0.5μlprim0639(10皮摩尔/μl)
0.04μlkvm157(10皮摩尔/μl)
0.04μlkvm158(10皮摩尔/μl)
0.1μltm1576(10皮摩尔/μl)
0.05μltm1304(10皮摩尔/μl)
加水至10μl
-热循环如下：
用于ee-gh7检测的终点taqmanpcr鉴定方案的结果显示在图4中。其表明，包含ee-gh7的样品(样品a1-a8)含有高于阈值的ee-gh7信号以及内源对照信号；含有未转化棉花的样品(样品a9和a10)仅含有内源对照，但不含有高于阈值的ee-gh7信号，无模板对照(样品a11-a12)不含高于阈值的信号。
3.基于pcr确定ee-gh7的接合性状态的方案
3.1.引物
设计识别插入原种事件之前野生型基因座的核苷酸序列的两个引物，使得它们在方向上彼此相向，并且一个引物位于对应于事件的5'或3'侧翼区的区域，以及一个引物针对插入前基因座中的靶位点缺失和3'或5'侧翼区的接合序列。包括第三引物，其靶向转基因基因座中的外源dna和3'或5'侧翼区的接合序列。这三种引物的存在允许ee-gh7特异性序列和野生型序列的同时pcr扩增。
发现以下引物在ee-gh7dna上在接合性评分pcr反应中给出特别明确和可重复的结果：
prim0726:5’-caaactccgaatagttccatcaattt-3’(seqidno.:11)
(靶标：5'侧翼序列的植物dna)
prim07335’-gaaggtcggagtcaacggattgcttacttaagcattgttctgtttcaag-3’(seqidno.:12)
(靶标：5'侧翼_靶位点缺失接合序列(seqidno.12的核苷酸22-49)，具有5'尾延伸(seqidno.12的核苷酸1-21)。
prim07315’–gaaggtgaccaagttcatgctggcccagtactgttgttctgtttc-3’(seqidno.:13)
(靶标：5'侧翼_外源dna接合序列(seqidno.13的核苷酸22-45)，具有5'尾延伸(seqidno.13的核苷酸1-21)。
3.2.扩增的片段
预期pcr反应中的扩增片段是：
对于引物对prim0726-prim0733：76bp(野生型基因座)
对于引物对prim0726-prim0731：71bp(ee-gh7基因座)
3.3.模板dna
使用agowasbeadexmaxiplantkit制备模板dna。当使用其他方法制备的dna时，应该使用不同量的模板进行测试运行。可以使用5至80ng的基因组模板dna。
3.4.指定的阳性和阴性对照
为避免假阳性或假阴性，建议应在pcr运行中包括以下阳性和阴性对照：
-纯合子对照：含有所描述的靶序列的纯合子的基因组dna样品
-半合子对照：含有所描述的靶序列的半合子的基因组dna样品
-野生型对照(dna阴性对照)：不含所述靶序列的基因组dna样品
-无模板对照(ntc)：水样品
3.5.pcr条件
在以下条件下获得最佳结果。显然，可以使用其他taq聚合酶，则条件可以根据供应商的建议而不同。
-用于10μl反应的pcr混合物包含：
xμl模板dna(20ng)
5.0μlkasparv3.0试剂(96-384孔配制)(lgc)
0.14μl测定混合物
水至25μl
100μl测定混合物包含：
12μlprim0731(100皮摩尔/μl)
12μlprim0733(100皮摩尔/μl)
30μlprim0726(100皮摩尔/μl)
水至100μl
kasparv3.0试剂含有对应于prim0733(野生型特异性引物)尾的vic染料标记的fret盒，和对应于prim0731(ee-gh7特异性引物)尾的fam染料标记的fret盒。
-为获得最佳结果的热循环如下：
3.6.数据分析
对于所有样品，针对事件特异性和野生型基因座反应，计算荧光信号与背景的比(s/b)。背景水平由ntc样品确定。
仅在对照样品给出预期结果时，即：
-纯合子对照评分为“纯合子”
-半合子对照评分为“半合子”
-野生型对照评分为“野生型”
-ntc仅显示荧光背景水平，
测试样品的结果有效。
对样品进行评分：
-“纯合子”：如果样品位于纯合簇中且s/b超过最小接受s/b比(即fams/b比)
-“半合子”：如果样品位于半合子簇中且s/b超过最小接受s/b比(即fam和vics/b比)
-“野生型”：如果样品位于野生型簇中且s/b超过最小接受s/b比(即vics/b比)
-“非结论性”：如果样品位于3个簇之间或s/b低于最小接受s/b比。
对于来自ee-gh7纯合系的材料、来自ee-gh7半合子系的材料、和来自野生型系的材料，s/b比的一个例子如图5所示。可以看出，在野生型材料(位于野生型簇中，s/b超过最小接受s/b比)中仅测量到vic，但测量不到fam；在ee-gh7的半合子材料(位于半合子簇中，s/b超过最小接受s/b比)中测量到vic和fam两者，在ee-gh7纯合材料(位于纯合簇中，s/b超过最小接受s/b比)中仅测量到fam。
4.将ee-gh7渐渗入优选的栽培品种
通过反复的回交，将原种事件ee-gh7引入到棉花品种st457中。在田地中在四个不同地点确定st457背景和coker312背景中ee-gh7的农艺性能。出苗前用210gift(2x)处理植物，出苗后早期(e；2-4叶期)用210gift(2x)处理植物，出苗后早期(e；2-4叶期)、中期(m；在现蕾(squaring)前和开花前)和后期(l；开花)用4244grounduppowermax(2x)处理植物，出苗后用210gift+4244grounduppowermax(2x)处理植物，或出苗前用210gift接着出苗后用4244grounduppowermax处理植物。将农艺参数与具有相同背景但不包含ee-gh7的相应未处理植物进行比较。对于仅一次处理，在未处理的对照植物和包含ee-gh7的植物(出苗后210gift+4244grounduppowermax(2x))之间观察到棉绒产率的显著差异。然而，这是由仅在一个位置观察到的差异引起；在其他四个位置，未处理的对照植物与具有相同遗传背景但包含ee-gh7的植物之间没有显著差异。对于所有其他处理，包含ee-gh7的植物中的棉绒产率与未处理的对照植物的棉绒产率没有显著差异。这表明在coker312背景和st547背景中，用不同除草剂组合处理的包含ee-gh7的植物的棉绒产率，高度等同于不包含该事件的未处理对照植物的棉绒产率。
通过在四个地点比较包含ee-gh7的植物与无效分离子和野生型(不包含ee-gh7)植物的不同农艺参数来测试农艺等效性。在st457背景中，长度、pob(吐絮棉铃百分比)、lp(棉绒百分比)、si(种子指数)与野生型和无效分离子均无显著差异。在st457背景中包含ee-gh7的植物的均一性显著高于野生型对照和无效分离子，并且棉绒产率显著高于无效分离子但不高于野生型。在coker312背景中，性能有一些波动，导致与野生型相比略低的棉绒产率和棉绒百分比。然而，与无效分离子相比未观察到这种较低的棉绒产率和棉绒百分比，表明此降低不是由于该事件的存在导致。coker312背景中的所有其他参数没有显著差异。总之，这些数据显示，包含ee-gh7的植物表现出与不包含ee-gh7的等基因植物在多种不同农艺参数上非常类似。
通过反复的回交，将原种事件ee-gh7引入棉花品种05m0201和11a中，其中事件ee-gh7与事件t304-40(包含草铵膦耐受性和cry1ab基因，如wo2008/122406中所述)、ghb119(包含草铵膦耐受性和cry2ae基因，如wo2008/151780中所述)、和cot102(包含vip3a基因，wo2004/039986中所述)堆叠。按以下方式处理植物：出苗前用105gift(1x)，出苗前用210gift(2x)，出苗后用105gift(1x)，出苗后用210gift(2x)，出苗后(e、m和l)用4244grounduppowermax(2x)，出苗前用210gift接着出苗后用4244grounduppowermax(2x)，出苗后(e和m)用1761gliberty(2x)，出苗前用210gift(2x)接着出苗后(e和m)用1761gliberty(2x)，或出苗前用210gift(2x)和出苗后用1761gliberty(2x)。在8个地点将农艺参数与具有相应背景但不包含ee-gh7的植物进行比较。仅对于一种处理和一个参数(出苗前用210gift接着出苗后用4244grounduppowermax(2x)处理的棉绒长度)，棉绒长度显著高于对照。对于任何其他处理，包含ee-gh7的植物和对照植物之间的棉绒长度没有显著差异。对于测试的所有其他参数(棉绒产率、马克隆值、强度和最终植物高度)，对于所有处理，在包含ee-gh7的植物与对照植物之间没有显著差异。这些数据表明，包含ee-gh7的植物在不同的商业背景下表现出与不包含ee-gh7的等基因植物在多种不同农艺参数上非常类似。此外，ee-gh7的存在不影响t304-40和ghb119赋予的对草铵膦(glufosinate,liberty)的耐受性，也不影响bt基因(cry1ab、cry2ae、vip3a)的表达。
通过在4个地点比较包含ee-gh7的植物与无效分离子和不包含ee-gh7的05m0201、11a和04sc095植物的亲本材料的不同农艺参数，测试在棉花品种05m0201m11a和04sc095(都包含如上所述的t304-40、ghb119和cot102)中包含ee-gh7的植物的农艺等效性。发现在农艺等效性试验中，包含ee-gh7的植物与无效分离子表现类似。
通过反复的回交，将原种事件ee-gh7引入到商业棉花栽培品种中，如但不限于fm989,fm958,fm966,fm832,fm5013,fm5015,fm5017,fm958b,fm832b,fm989br,fm991br,fm800br,fm960br,fm5045br,fm960b2r,fm989b2r,fm991b2r,fm800b2r,fm958ll,fm966ll,fm993ll,fm981ll,fm832ll,fm5035ll,fm960b2,fm955llb2,fm965llb2,fm988llb2,fm9063b2f,fm9058f,fm9060f,fm9068f,afd5062ll,afd5065b2f,afd5064f,afd3070f,afd3074f,fm1880b2f,fm1600ll,fm1800ll,fm9150f,fm820f,fm840b2f,fm835llb2,fm1735llb2,fm1740b2f,fm9180b2f,fm1640b2f,fm1840b2f,fm966b,fm9160b2f,fm1845llb2,st4288b2f,st5288b2f,fm1773llb2,fm9101gt,fm9103gt,fm9250gl,fm9170b2f,fm2011gt,fm2989glb2,st4145llb2,fm2484b2f,fm1944glb2,fm8270glb2,st5445llb2,fm1320gl,st4946glb2,st4747glb2,st6448glb2,st5032glt,fm2322gl,fm1830glt,fm2334glt,st5289glt,st6182glt,st5115glt,fm1900glt,fm2007glt,st4949glt,st4848glt,fm1911glt。
据观察，原种事件向这些栽培品种中的渐渗(introgression)不会显著影响这些栽培品种的任何期望的表型或农艺特征(无连锁累赘(linkagedrag))，同时转基因的表达(如通过草甘膦和/或异
原种事件ee-gh7可以有利地与市场上可得的其他原种事件组合。可根据本发明处理的特别有用的转基因植物是含有转化事件或转化事件组合的植物，并且可以是例如列于各国家或地区管理机构的数据库中的那些，包括事件531/pv-ghbk04(描述于wo2002/040677中，棉花、昆虫控制)，事件1143-14a(描述于wo06/128569中，棉花、昆虫控制，未保藏)；事件1143-51b(描述于wo06/128570中，棉花、昆虫控制，未保藏)；事件1445(描述于us-a2002-120964或wo02/034946中，棉花、除草剂耐受性，未保藏)，事件281-24-236(描述于wo05/103266或us-a2005-216969中，棉花、昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为pta-6233)；事件3006-210-23(描述于us-a2007-143876或wo05/103266中，棉花、昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为pta-6233)；事件ce43-67b(描述于us-a2009-217423或wo06/128573中，棉花、昆虫控制，保藏为dsmacc2724)；事件ce44-69d(描述于us-a2010-0024077中，棉花、昆虫控制，未保藏)；事件ce44-69d(描述于wo06/128571中，棉花、昆虫控制，未保藏)；事件ce46-02a(描述于wo06/128572中，棉花、昆虫控制，未保藏)；事件cot102(描述于us-a2006-130175或wo04/039986中，棉花、昆虫控制，未保藏)；事件cot202(描述于us-a2007-067868或wo05/054479中，棉花、昆虫控制，未保藏)；事件cot203(描述于wo05/054480中，棉花、昆虫控制，未保藏)；事件ghb119(描述于wo08/151780中，棉花、昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为atccpta-8398)；事件ghb614(描述于us-a2010-050282或wo07/017186中，棉花、除草剂耐受性，保藏为atccpta-6878)；事件llcotton25(描述于wo03/013224或us-a2003-097687中，棉花、除草剂耐受性，保藏为atccpta-3343)；事件mon15985(描述于us-a2004-250317或wo02/100163中，棉花、昆虫控制，保藏为atccpta-2516)；事件mon88913(描述于wo04/072235或us-a2006-059590中，棉花、除草剂耐受性，保藏为atccpta-4854)；事件mon88701(描述于wo2012/134808中，棉花、除草剂耐受性，保藏为pta-11754)，事件t304-40(描述于us-a2010-077501或wo08/122406中，棉花、昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为atccpta-8171)；事件t342-142(描述于wo06/128568中，棉花、昆虫控制，未保藏)；事件mon88701(棉花，atcc保藏号pta-11754，wo2012/134808a1)，事件pdab4468.18.07.1(棉花，除草剂耐受性，atcc保藏号pta-12456，wo2013112525a2)，事件pdab4468.19.10.3(棉花，除草剂耐受性，atcc保藏号pta-12457，wo2013112527a1)，事件a26-5(棉花、昆虫控制，wo2013170398)，事件a2-6(棉花、昆虫控制，wo2013170399)，事件a26-5(棉花，如wo2013170398a1中所述)，事件a2-6(棉花，如wo2013170399a1中所述)。
对本发明特别有用的是组合ee-gh7与事件ghb119(棉花、昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为atccpta-8398，描述于wo08/151780)、事件t304-40(棉花、昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为atccpta-8171，描述于us-a2010-077501或wo08/122406)、和事件cot102(棉花、昆虫控制，未保藏，描述于us-a2006-130175或wo04/039986)的植物。
如下面的权利要求中所使用的，除非另有明确说明，术语“植物”旨在包括任何成熟阶段的植物组织、以及取自或衍生自任何这种植物的任何细胞、组织或器官，包括但不限于任何种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。
包含原种事件ee-gh7的参考种子于2016年2月24日以atcc保藏号pta-122856保藏于atcc(10801universityblvd.，manassas，va20110-2209)，并确认其存活。ee-gh7的替代名称是事件ghb811。
本发明的上述描述旨在举例说明而非限制。
本领域技术人员可以想到所描述的实施方案中的各种改变或修改。这些可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下进行。
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