检测目标碱基序列的方法、设计和制造探针的方法以及试剂盒与流程

本发明涉及检测目标碱基序列的方法，更具体涉及检测包含例如单核苷酸多态性(snp:singlenucleotidepolymorphism)等单碱基变异的目标碱基序列的方法、用于该方法的探针的设计方法及制造方法以及包含该探针的试剂盒。

背景技术：

snp是指在个体间以超过个体的全体整体的1％的频度存在的基因组序列中的1个核苷酸替换为不同的核苷酸的变异。snp中存在导致体质、疾病敏感性、药剂应答性等多种多样的表型的个体差异的变异。例如，已知人的酒精分解能力依赖于aldh2基因的snp，还已知与药物代谢的cyp家族中存在的snp分别有助于药剂对人的效果。此外，近年来作为预测癌症的术后过程和治疗效果的生物标志物报道了特定的snp，判别snp的实用性高。另外，用于判别snp的判别单碱基差异的技术不仅限于snp，还可有效地应用于包含单碱基取代造成的突变(点突变)的碱基序列的判别，例如也可用于存在频度低于1％的抗药性病原菌的检测。因此，预测可简易地鉴定碱基序列间的单碱基差异的方法的需求将不断增加。

作为snp的简便的判别法，已知探针检测法。探针检测法是利用使具有与检测对象的碱基序列互补的碱基序列的检测探针杂交而得的完全匹配的双链的tm值比使上述检测探针与同检测对象的碱基序列存在单碱基差异的碱基序列的核酸杂交而得的单碱基错配的双链tm值高5℃左右这点，通过tm值的差来判别碱基序列的方法。tm值根据检测对象的碱基序列的碱基组成、反应试样的盐浓度等条件而变化，所述条件成为噪声而可能会难以获得稳定的测定结果。因此，考虑了减低所述噪声的改良方案。

例如，专利文献1中揭示了使“检测型探针”的部分区域与目标核酸的包含单碱基变异位点的区域的3'末端侧和5'末端侧中的一方杂交，使具有除单碱基变异位点以外与检测型探针部分一致的碱基序列的“部分竞争型探针”的部分区域与其中的另一方杂交，在包含单碱基变异位点的区域使检测型探针与部分竞争型探针的剩余部分相互竞争的方法，即检测型探针和部分竞争型探针均可与目标核酸中分别对应的区域杂交，但这两种探针在包含单碱基变异位点的区域相互竞争的方法。该方法中，作为竞争部分的“包含单碱基变异位点的区域”中的变异识别能力提高，同时可降低单碱基错配的杂交的稳定度，所以可提高基于与完全匹配的情况的tm值差的判别的精度。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本专利第5597939号

发明的概要

发明所要解决的技术问题

然而，专利文献1中记载的方法中，通过tm值的差异判别核酸试样所含的碱基序列对于检测探针的碱基序列完全匹配还是单碱基错配这点并没变。本发明人发现基于tm值的差异的判别法中，可能会因盐浓度等实验条件、来源于试样的夹杂物、制备误差等而出现错误判定，从防止错误判定并使有无单碱基取代的判断变得简单的观点来看，还有改善的余地。

如专利文献1中也采用的那样，tm值的测定使用例如qp(淬灭探针/引物，quenchingprobe/primer)法等检测识别检测探针的荧光染料伴随核酸与检测探针的杂交或解离的淬灭或发光的方法。所述方法中，使向核酸试样中添加检测探针的反应试样的温度变化的同时测定荧光强度，将对由测定结果得到的温度-荧光强度曲线进行一阶微分而得的曲线所具有的峰(极大值)(与发生淬灭或发光的温度对应)作为tm值。通过该tm值的差异判别snp的方法中，需要判定所测定的tm值位于高温侧还是低温侧，可能会因误差等而难以判定，或者导致错误判定。

另外，例如作为snp判别的目标的核酸为snp的2个等位基因的杂合子的情况下，有时在高温侧的tm值与低温侧的tm值之间的温度下可见淬灭或发光的峰。所述情况下，测定结果的tm值与高温侧或低温侧的tm值的差小至例如2℃左右，难以判别。

于是，本发明的目的在于提供能够使核酸试样中是否存在目标碱基序列的判断变得容易的检测目标碱基序列的方法、用于该方法的试剂盒以及设计和制造用于该方法的探针的方法。

解决技术问题所采用的技术方案

为了解决上述课题，本发明人在不断认真研究的过程中发现，通过使用与单碱基错配的碱基序列特异性杂交的竞争探针抑制检测探针的单碱基错配的杂交，使低温侧的tm值下不会发生消光或发光，能够实现仅检测目标碱基序列的检测体系。另外，本发明人还发现，如果对根据检测探针与核酸的杂交的反应试样得到的温度-荧光强度曲线进行一阶微分，通常在tm值的温度伴随消光或发光出现一阶微分曲线的峰，此时通过抑制检测探针的单碱基错配的杂交，使该峰不会出现，可明确地判别通过目标碱基序列的检测出现峰的情况，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下的事项。

[1]一种从核酸试样检测包含碱基变异核苷酸的目标碱基序列(a)的方法，其中，该方法包括以下的步骤：

(1)向核酸试样中加入用可用于qp(消光探针/引物)法的荧光染料标记的检测探针和竞争探针，获得反应试样，由此荧光标记检测探针或竞争探针与反应试样中的具有目标碱基序列(a)的目标核酸杂交的步骤，

(2)改变反应试样的温度的同时，测定荧光强度的步骤，以及

(3)对由(2)的测定结果得到的温度-荧光强度曲线进行一阶微分的步骤；

在此，

(i)荧光标记检测探针的碱基序列包含与目标碱基序列(a)互补的碱基序列(a')，

(ii)竞争探针的碱基序列包含与碱基序列除碱基变异核苷酸替换为碱基未变异核苷酸以外与目标碱基序列(a)相同的非目标碱基序列(b)互补的碱基序列(b')，

(iii)荧光标记检测探针及竞争探针各自的碱基长度和碱基序列以及向核酸试样的添加量以如下的条件决定：如果按照以下的步骤：

(a)向含目标核酸、但实质上不含具有非目标碱基序列(b)的非目标核酸的对照目标核酸试样和实质上不含目标核酸、但含非目标核酸的对照非目标核酸试样分别加入荧光标记检测探针和竞争探针，获得对照目标反应试样和对照非目标反应试样的步骤，

(b)改变各对照反应试样的温度的同时，测定荧光强度的步骤，以及

(c)对由测定结果得到的温度-荧光强度曲线分别进行一阶微分的步骤

操作时，对照目标反应试样的一阶微分曲线具有峰(极大值)，而对照非目标反应试样的一阶微分曲线实质上不具有峰。

[2]根据[1]所述的方法，其中，还包括以下的步骤：

(4)当(3)中得到的一阶微分曲线具有峰的情况下，判断为核酸试样中存在目标碱基序列(a)的步骤；

在此，核酸试样除目标核酸以外还可包含非目标核酸。

[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，对于非目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记检测探针的tm值高至少5℃，且对于目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记检测探针的tm值低。

[4]根据[1]或[2]所述的方法，其中，对于非目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记检测探针的tm值高至少10℃，且对于目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记检测探针的tm值低。

[5]根据[1]或[2]所述的方法，其中，对于非目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记检测探针的tm值高至少10℃，且对于目标核酸，竞争探针的tm值不高于荧光标记检测探针的tm值+5℃。

[6]根据[1]或[2]所述的方法，其中，对于非目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记检测探针的tm值高至少15℃，且对于目标核酸，竞争探针的tm值不高于荧光标记检测探针的tm值+5℃。

[7]根据[1]或[2]所述的方法，其中，对于非目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记检测探针的tm值高至少15℃，且对于目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记检测探针的tm值低。

[8]根据[1]～[7]中的任一项所述的方法，其中，(i)目标核酸上与荧光标记检测探针杂交的区域包含与竞争探针杂交的区域；或者(ii)目标核酸上与竞争探针杂交的区域包含与荧光标记检测探针杂交的区域；或者(iii)目标核酸上与竞争探针杂交的区域和与荧光标记检测探针杂交的区域一致。

[9]根据[1]～[8]中的任一项所述的方法，其中，向核酸试样的竞争探针的添加量以摩尔比计为荧光标记检测探针的添加量的至少10倍。

[10]根据[1]～[9]中的任一项所述的方法，其中，向核酸试样的竞争探针的添加量以摩尔比计为荧光标记检测探针的添加量的至少20倍。

[11]根据[1]～[10]中的任一项所述的方法，其中，用可用于qp(消光探针/引物)法的荧光染料为选自tamra(商标)、bodipy(注册商标)fl、pacificblue(商标)和cr6g(注册商标)的至少1种荧光染料。

[12]根据[1]～[11]中的任一项所述的方法，其中，核酸试样来源于生物体。

[13]根据[1]～[12]中的任一项所述的方法，其中，碱基变异核苷酸为包含单碱基取代的变异的dna。

[14]设计可用于[1]～[13]中的任一项所述的方法的荧光标记检测探针和竞争探针的方法，其中，包括：

(1')以如下的条件决定荧光标记检测探针和竞争探针各自的碱基长度和碱基序列的步骤：按照(a)～(c)操作时，对照目标反应试样的一阶微分曲线具有峰(极大值)，而对照非目标反应试样的一阶微分曲线不具有峰。

[15]制造可用于[1]～[13]中的任一项所述的方法的荧光标记检测探针和竞争探针的方法，其中，包括：

(1")合成按照[14]所述的方法设计的各自的碱基长度和碱基序列的寡核苷酸的步骤；以及

(2")将荧光标记检测探针的寡核苷酸用可用于qp法的荧光染料标记的步骤。

[16]用于[1]～[13]中的任一项所述的方法的试剂盒，其中，包括荧光标记检测探针、竞争探针及使用说明书。

发明的效果

如果采用本发明，存在希望避免检测单碱基错配的非目标碱基序列的情况下，通过使对于该非目标碱基序列特异性的竞争探针杂交，不使荧光标记检测探针的单碱基错配的杂交发生，可使温度-荧光强度的测定结果中仅在检测到目标碱基序列时出现淬灭或发光的峰。因此，与利用tm值的差的判别方法不同，可通过有无淬灭或发光的峰而知道有无目标碱基序列，所以不会受到对tm值造成影响的盐浓度等条件的影响(高鲁棒性)，可容易地判断核酸试样中是否存在目标碱基序列。

附图的简单说明

图1表示实施例1中的向包含rpob基因的第516个密码子的点突变(野生型、变异型和野生型/变异型杂合)的核酸试样中添加用于检测野生型(rpob516asp)的检测探针和竞争探针并测定而得的温度-荧光强度曲线的一阶微分曲线(热解离曲线)。

图2表示实施例2中的从rpob基因扩增的目标核酸和非目标核酸以及为检测目标核酸而设计的荧光标记检测探针和各种竞争探针的碱基序列。

图3-1表示实施例2中的对于各反应试样得到的温度-荧光强度曲线。

图3-2表示对实施例2中得到的温度-荧光强度曲线进行一阶微分而得的曲线。

图4-1表示实施例3中的从rpob基因扩增的目标核酸和非目标核酸的碱基序列。

图4-2表示实施例3中的为检测目标核酸而设计的荧光标记检测探针和各种竞争探针的碱基序列、各探针分别与目标核酸和非目标核酸杂交的tm值、以及从分别针对目标核酸和非目标核酸的荧光标记检测探针的tm值减去各竞争探针的tm值而得的值、以及各1情况下的温度-荧光强度曲线的一阶微分曲线中的淬灭峰的有无。

图4-3表示实施例3中的为检测目标核酸而设计的荧光标记检测探针和各种竞争探针的分别与目标核酸和非目标核酸杂交的tm值。

图5表示对实施例3中得到的温度-荧光强度曲线进行一阶微分而得的曲线。

实施发明的方式

以下，对本发明进行详细说明。

本说明书中，术语snp以与该技术领域中的snps同样的含义使用。此外，本说明书中，对于使用术语snp说明的事项，即使将“snp”替换为“包含单碱基取代的变异的dna”，基本上同样的说明也成立。即，以下的说明中，snp为检测对象的一例，本发明可广泛地应用于检测包含单碱基取代的变异的dna的技术。

只要本说明书中无另作说明，关于本发明所用的科学技术方面的术语均具有与本领域的技术人员通常所理解的含义。一般来说，本说明书中所记载的关于分子生物学、微生物学、基因和蛋白质和核酸化学所用的术语及其技术在该技术领域中被熟知，是常用的知识。本说明书中所参照的全部的专利、申请及其他出版物通过参照其整体而纳入本说明书中。

＜检测方法＞

本发明所述的检测方法是一种从核酸试样检测包含碱基变异核苷酸的目标碱基序列(a)的方法，该方法至少包括以下的步骤(1)～(3)：

(1)向核酸试样中加入荧光标记检测探针和竞争探针，获得反应试样，由此荧光标记检测探针或竞争探针与反应试样中的具有目标碱基序列的目标核酸杂交的步骤；

(2)改变反应试样的温度的同时，测定荧光强度的步骤；以及

(3)对由(2)的测定结果得到的温度-荧光强度曲线进行一阶微分的步骤。

本说明书中，“检测目标碱基序列”是指判别核酸试样中所含的核酸的碱基序列是否包含与目标碱基序列相同的碱基序列。

核酸只要是dna或rna即可，无特别限定，可以是天然的核酸，也可以是合成的核酸。作为天然的核酸，例如有从生物回收的基因组dna、mrna、rrna、不均一核(hn)rna等。此外，作为合成的核酸，例如有通过β-氰乙基亚磷酰胺法、dna固相合成法等公知的化学合成法合成的dna和通过pcr等公知的核酸合成法合成的核酸、通过逆转录反应合成的cdna等。

本说明书中，将具有包含目标碱基序列的碱基序列的核酸称为“目标核酸”。

“核酸试样”只要是含有核酸的试样即可，无特别限定，较好是从动物、植物、微生物、培养细胞等提取核酸而得的样品。自动物等的核酸的提取可通过例如苯酚/氯仿法等公知的方法进行。核酸试样可以是来源于生物体的试样。在此，核酸试样“来源于生物体”不仅限于核酸试样为从生物体采集的试样本身的含义，只要是从采集自生物体的试样出发的试样即可，还包含例如在核酸提取后经扩增、克隆或者整合至其他碱基序列中等基因工程操作而得的试样的情况。例如，扩增后的核酸和克隆得到的核酸等也包含在“来源于生物体的核酸试样”内。通过对来源于生物体的核酸试样适用本发明的方法，可有助于对该生物体的基因诊断。

另外，核酸试样中所含的核酸为双链核酸的情况下，较好是预先将其制备为单链核酸。通过使用单链核酸，在后述的步骤(1)中，可使检测探针或竞争探针与该单链核酸杂交。所提取的双链核酸的单链化可通过加热等公知的方法进行。

“杂交”是指单链核酸相互(例如通过热处理单链化的检测对象的dna与探针)形成互补的碱基对结合而形成双链。本说明书中，“杂交”包括对于一方的碱基序列完全互补的碱基序列杂交的情况以及在一方的碱基序列与另一方的碱基序列之间尽管有例如1～数个碱基对无法形成互补的碱基对的部分(错配的部分)在具有互补性的部分相互形成碱基对而作为序列整体杂交的情况。本说明书中，也将对于一方的碱基序列完全互补的碱基序列杂交表述为“完全匹配的杂交”、“特异性杂交”，将包含错配的情况表述为“错配的杂交”、“非特异性杂交”。

本说明书中，作为“碱基变异核苷酸”、“碱基未变异核苷酸”的碱基不同的位点，可例举例如基于snp、插入变异、缺失变异、重复序列变异的变异位点。

典型的是，所述不同位点为snp中的变异位点，“碱基变异核苷酸”和“碱基未变异核苷酸”分别为1个核苷酸。但是，例如碱基变异为单碱基的缺失变异的情况下，也可将夹着缺失位点的连续2个碱基作为“碱基变异核苷酸”、将不含缺失的连续3个碱基作为“碱基未变异核苷酸”适用本发明。此外，例如碱基变异为单碱基的插入变异的情况下，也可将所插入的核苷酸与其两侧连续的核苷酸的合计3个碱基作为“碱基变异核苷酸”、将不含插入的连续2个碱基作为“碱基未变异核苷酸”适用本发明。缺失碱基数或插入碱基数可以是2个碱基以上。即，本申请所附的专利权利要求书中的“碱基变异核苷酸替换为碱基未变异核苷酸”的记载也包括“碱基变异核苷酸”和“碱基未变异核苷酸”分别为连续的数个核苷酸的情况。

本发明中，“碱基变异核苷酸”与“碱基未变异核苷酸”的关系例如也称为snp等等位基因(allele)中的野生型与变异型的相互不同的碱基的相对关系。因此，典型的是，“包含碱基变异核苷酸的目标碱基序列”为变异型的碱基序列，包含“碱基未变异核苷酸”的“非目标碱基序列”为野生型的碱基序列，但也可与之相反，将“包含碱基变异核苷酸的目标碱基序列”视作野生型的碱基序列的同时，将包含“碱基未变异核苷酸”的“非目标碱基序列”视作变异型的碱基序列。在后述的实施例1和2中对后者的例子进行说明。即，本说明书中的“碱基变异核苷酸”这一术语中的“变异”、“未变异”并不一定是指该核苷酸本身是否为变异型的核苷酸，而是指以不作为本方法的检测对象的非目标碱基序列中的snp的位点(可发生检测所涉及的基于单碱基取代的变异的位点)的碱基为基准，是否为不同的碱基。

本说明书中，“目标碱基序列”是指包含目标的碱基变异核苷酸的核酸(目标核酸)的碱基序列中含有碱基变异核苷酸的一定程度的部分序列。目标碱基序列的长度只要是具有与该部分序列互补的碱基序列的同样长度的探针可在严格条件下特异性杂交的长度即可，无特别限定。另外，目标碱基序列的长度可考虑目标碱基序列的种类、后述的检测探针及竞争探针的碱基序列等适当决定。

本说明书中，“非目标碱基序列”是指除碱基变异核苷酸替换为碱基未变异核苷酸以外与目标碱基序列相同的碱基序列。所述的非目标碱基序列虽然不是检测对象，但与检测对象的目标碱基序列相似，因此可与具有与目标碱基序列互补的碱基序列的检测探针非特异性杂交。因此，以往的探针法中，除目标碱基序列以外，非目标碱基序列也通过与检测探针的杂交而被检出，检出的碱基序列为非目标碱基序列的情况根据杂交的热稳定性(tm值)比目标碱基序列的情况低来判别(具体参照以下的实施例2的“仅检测探针”)。

本说明书中，将具有包含该非目标碱基序列的碱基序列的核酸称为“非目标核酸”。

本说明书中，“检测探针”和“竞争探针”是选自核苷酸、核苷酸类似物及它们的修饰物的1种以上通过磷酸二酯键连结而得的探针。

在此，核苷酸类似物是指具有与作为天然核苷酸的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)同样的功能的非天然的核苷酸。即，核苷酸类似物可与核苷酸同样通过磷酸二酯键成链，且使用核苷酸类似物形成的引物和探针可与仅使用核苷酸形成的引物和探针同样用于pcr和杂交。作为这样的核苷酸类似物，例如有pna(聚酰胺核酸衍生物)、lna(bna)、ena(2'-o,4'-c-乙烯桥连核酸)及它们的复合物等。在此，pna是将dna或rna的由磷酸和五碳糖形成的主链替换为聚酰胺链而得的化合物。此外，lna(bna)是核糖核酸的2'位的氧原子与4'位的碳原子介以亚甲基结合的具有2个环状结构的化合物。

在此，作为修饰物，例如有修饰脱氧核糖核酸、修饰核糖核酸、修饰磷酸-糖-骨架寡核苷酸、修饰pna、修饰lna(bna)、修饰ena等。在此，只要不破坏本发明的效果，可用于核苷酸或核苷酸类似物的修饰的物质无特别限定，可以使用核苷酸等的修饰中通常所用的物质。作为修饰核苷酸和修饰核苷酸类似物，例如有通过氨基、羧基乙烯基、磷酸基、甲基等官能团修饰的核苷酸等，通过甲基等2-o-甲基化修饰的核苷酸等，磷硫酰化修饰的核苷酸等，通过后述的荧光染料等标记分子修饰的核苷酸等。

检测探针用可用于qp(消光探针/引物)法的荧光染料标记。qp法是利用荧光因鸟嘌呤碱基在空间上接近某种荧光染料而淬灭的现象的检测方法。通过将检测探针用与鸟嘌呤碱基接近而淬灭的荧光染料标记，可检测是否检测探针与目标核酸(含鸟嘌呤碱基)接近。具体来说，在目标核酸中，按照内部具有鸟嘌呤碱基的条件设定目标碱基序列，并且检测探针按照在与该目标核酸的鸟嘌呤碱基互补的位点具有通过荧光染料标记的胞嘧啶碱基的条件预先设计。目标核酸与检测探针杂交的情况下，经标记的检测探针的荧光染料与目标核酸中的鸟嘌呤碱基接近，发生荧光染料的淬灭。

作为可用于qp法的荧光染料，可例举例如tamra(商标)(英杰公司制)、bodipy(注册商标)fl(英杰公司制)、pacificblue(商标)(英杰公司制)、cr6g(注册商标)(英杰公司制)等。各荧光染料对检测探针的标记可通过有机合成方法等通常所用的方法进行。

以下，也将检测探针称为“荧光标记检测探针”。

荧光标记检测探针的碱基序列包含与目标碱基序列(a)互补的碱基序列(a')。竞争探针的碱基序列包含与非目标碱基序列(即，除碱基变异核苷酸替换为碱基未变异核苷酸以外与目标碱基序列相同的碱基序列)(b)互补的碱基序列(b')。“探针的碱基序列”是指该探针的与核酸杂交的区域的全长的碱基序列。另外，本说明书中，“与目标碱基序列(a)互补的碱基序列(a')”的表述中的“互补”是指碱基序列(a)与(a')存在完全互补的关系，由碱基序列(a)与(a')形成的双链部分的全部的碱基对互补。“与非目标碱基序列(b)互补的碱基序列(b')”的表述中的“互补”也同样是指碱基序列(b)与(b')存在完全互补的关系。

“荧光标记检测探针的碱基序列”“包含与目标碱基序列互补的碱基序列”包括荧光标记检测探针的碱基序列(a')与目标碱基序列(a)互补的情况以及荧光标记检测探针的碱基序列(a')与目标核酸上的包含目标碱基序列(a)且比目标碱基序列(a)长的区域的碱基序列互补的情况。

“竞争探针的碱基序列”“包含与非目标碱基序列互补的碱基序列”包括竞争探针的碱基序列(b')与非目标碱基序列(b)互补的情况以及竞争探针的碱基序列(b')与非目标核酸上的包含非目标碱基序列(b)且比非目标碱基序列(b)长的区域的碱基序列互补的情况。

对本发明的检测方法所包括的各步骤进行说明。

首先，步骤(1)中，使荧光标记检测探针或竞争探针与反应试样中的具有目标碱基序列的目标核酸杂交。荧光标记检测探针及竞争探针各自的碱基长度和碱基序列以及向核酸试样的添加量按照满足规定条件的方式决定，关于该条件在后文中进行说明。目标核酸与荧光标记检测探针和竞争探针的杂交的反应条件无特别限定，可在考虑荧光标记检测探针和竞争探针的tm值等的基础上，在通常的温度、ph、盐浓度、缓冲液等条件下进行。

在此，tm值是指寡核苷酸的50％与其互补链解离时的温度，是使探针与核酸杂交时的双链的热稳定性的指标。作为tm值的计算方法，可使用常规方法，例如17～25碱基的探针的情况下，可通过下面的式子(华莱士方程，wallaceformula)概算。

tm＝2×(序列中的a的数量+序列中的t的数量)+4×(序列中的g的数量+序列中的c的数量)

此外，为了更高的准确性，tm值也可通过例如目前公知的meltcalc软件(http:/www.meltcalc.com/)等算出，通过最邻近法(nearestneighbormethod)确定。

杂交反应较好是在含具有缓冲作用的盐的反应溶液中进行。该反应溶液的ph较好是在ph6.5～8.5的范围内，更好是在ph6.7～7.7的范围内，该反应溶液的盐浓度较好是在5～250mm的范围内，更好是在10～100mm的范围内。作为具有缓冲作用的盐，可例举二甲胂酸盐、磷酸盐、tris盐等。此外，反应溶液较好是包含碱金属和/或碱土金属的盐，更好是包含氯化钠和/或氯化镁。

包含与目标碱基序列互补的碱基序列的荧光标记检测探针杂交优先与目标核酸。通过荧光标记检测探针向核酸的杂交，荧光淬灭。竞争探针也以一定的比例与目标核酸杂交。荧光标记检测探针向目标核酸的杂交的比例足够高，竞争探针与目标核酸杂交的比例为实质上不妨碍其检测的程度。

另外，核酸试样中存在具有非目标碱基序列的非目标核酸的情况下，该步骤中，竞争探针优先与非目标核酸杂交。其结果是，荧光标记检测探针向非目标核酸的错配的杂交大量受到抑制，基于该错配的杂交的淬灭或发光实质上不被检出。

因此，检测出标记于荧光标记检测探针的荧光染料的淬灭或发光的情况下，可知该核酸试样中存在具有与荧光标记检测探针的碱基序列互补的目标碱基序列的目标核酸。此外，未检测出淬灭或发光的情况下，可知该核酸试样中不存在与荧光标记检测探针的碱基序列互补的目标碱基序列。

标记于荧光标记检测探针的荧光染料的淬灭或发光可通过实施步骤(2)和(3)来检测。步骤(2)中，通过改变反应试样的温度的同时，测定荧光强度，获得表示荧光强度的变化的温度-荧光强度曲线。改变反应试样的温度的同时测定荧光强度的方法例如可利用市售的实时pcr装置(abiprism(注册商标)7900ht、abiprism7700(应用生物系统公司)、icycleriq(商标)real-timepcrdetectionsystem(伯乐公司(bio-rad))、mx3000p、mx3005p(安捷伦科技公司)等)，具体可利用与实时pcr中的荧光分析同样的解链曲线分析功能。步骤(3)中，通过对由步骤(2)中得到的温度-荧光强度曲线进行一阶微分，可灵敏地观测该温度-荧光强度曲线的凹凸。温度-荧光强度曲线的一阶微分可使用上述的实时pcr装置的专用软件等简单地进行。存在荧光标记检测探针的杂交或解离导致的淬灭或发光的情况下，其tm值下荧光强度的变化率增大，因此一阶微分的结果中出现峰(极大值)。另外，本说明书中，“峰(极大值)”不仅限于向正值侧的绝对值，也表示向负值侧的极大值(参照实施例)。特别是使用以会因接近核酸而发生淬灭的tamra(商标)或bodipy(注册商标)fl等荧光染料标记的荧光标记检测探针的情况下，如果温度下降至tm值以下，则荧光标记检测探针的荧光因杂交而淬灭，所以出现向负值侧的峰，本说明书中也将这种峰称为“淬灭峰”。

在此，本发明中，反应试样中包含可与荧光标记检测探针以单碱基错配杂交的非目标核酸的情况下，通过用竞争探针抑制荧光标记检测探针向非目标核酸的杂交，按照一阶微分的结果中不出现基于错配的杂交的峰的方式设定荧光标记检测探针和竞争探针的条件。

荧光标记检测探针及竞争探针各自的碱基长度和碱基序列以及向核酸试样的添加量以满足如下的功能性条件的方式决定：如果按照以下的步骤：

(a)向含目标核酸、但实质上不含具有非目标碱基序列(b)的非目标核酸的对照目标核酸试样和实质上不含目标核酸、但含非目标核酸的对照非目标核酸试样分别加入荧光标记检测探针和竞争探针，获得对照目标反应试样和对照非目标反应试样的步骤，

(b)改变各对照反应试样的温度的同时，测定荧光强度的步骤，以及

(c)对由测定结果得到的温度-荧光强度曲线分别进行一阶微分的步骤

操作时，对照目标反应试样的一阶微分曲线具有峰(极大值)，而对照非目标反应试样的一阶微分曲线实质上不具有峰。

“实质上”不含非目标核酸或目标核酸的含义除了试样中完全不含该非目标核酸或目标核酸的情况以外，还包括仅含少量至不会被检出的程度的该非目标核酸或目标核酸的情况。“对照非目标反应试样的一阶微分曲线实质上不具有峰”例如可以包括下述情况：严格来说，对照非目标反应试样的一阶微分曲线具有峰，但该峰的强度(荧光强度的最大振幅)与对照目标反应试样的一阶微分曲线的峰的强度相比大幅减弱(平坦化)，不具有对照目标反应试样的一阶微分曲线那样的峰的形状。

荧光标记检测探针及竞争探针各自的碱基长度和碱基序列以及向核酸试样的添加量的条件可按照上述步骤(a)～(c)，在不对本领域的技术人员造成过度的负担的情况下以实验方式决定，实质上至少决定各探针的tm值和各探针的添加量(摩尔比)这2个相关的因素即可。例如，如上所示，本发明人发现了满足上述的功能性条件的可能性高的荧光标记检测探针及竞争探针各自的碱基长度和碱基序列以及向核酸试样的添加量的优选条件的例子。本领域的技术人员也可基于所述的例子决定荧光标记检测探针及竞争探针各自的碱基长度和碱基序列以及向核酸试样的添加量来满足上述条件。

本发明人发现例如作为荧光标记检测探针及竞争探针各自的碱基长度和碱基序列的条件，对于非目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记检测探针的tm值高至少5℃，较好是高至少℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃，且对于目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记检测探针的tm值低，较好是低至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃。

虽然也根据荧光标记检测探针/竞争探针的摩尔比而不同，但如果对于非目标核酸的竞争探针的tm值与荧光标记检测探针的tm值的差至少为5℃，则存在基于荧光标记检测探针与非目标核酸的错配的杂交的峰容易被抑制的倾向。此外，如果对于目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记检测探针的tm值低，则荧光标记检测探针对于目标核酸的杂交容易发生，存在检测目标核酸时一阶微分曲线的峰变得更锐利的倾向。

另外，对于非目标核酸的竞争探针的tm值与荧光标记检测探针的tm值的差以及对于目标核酸的竞争探针的tm值与荧光标记检测探针的tm值的差相互关连地变化，无法独立设定。因此，根据作为目标的序列，可能会无法满足上述的优选的tm值条件的组合。例如，对于非目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记检测探针的tm值高至少10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃时，对于目标核酸，竞争探针的tm值可能会无法比荧光标记检测探针的tm值低。如果对于目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记检测探针的tm值高，则荧光标记检测探针对于目标核酸的杂交容易被竞争探针妨碍，因而产生检测目标核酸时的一阶微分曲线的峰衰减的倾向。但是，所述情况下，如果可在视觉上判断基于荧光标记检测探针与非目标核酸的错配的杂交的峰的有无，则能够实现本发明的效果，所以也可认为优选。例如，对于非目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记检测探针的tm值高至少10℃，较好是高至少11℃、12℃、13℃、14℃，更好是高至少15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃，且对于目标核酸，竞争探针的tm值不高于荧光标记检测探针的tm值+5℃，较好是不高于荧光标记检测探针的tm值+4℃、荧光标记检测探针的tm值+3℃、荧光标记检测探针的tm值+2℃、荧光标记检测探针的tm值+1℃或荧光标记检测探针的tm值的情况也被发现可能优选(具体参照以下的实施例3的使用“rb516a-3-p-8”作为竞争探针的例子)。

此外，作为荧光标记检测探针和竞争探针各自向核酸试样的添加量的条件，可例举竞争探针的添加量为荧光标记检测探针的添加量的以摩尔比计的至少1倍(即1:1)，较好是以摩尔比计至少2～9倍，更好是以摩尔比计至少10倍，进一步更好是以摩尔比计至少20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍、500倍或1000倍。如上所述，虽然也根据对于非目标核酸的竞争探针与荧光标记检测探针的tm值的差而不同，但如果添加量以竞争探针/荧光标记探针的摩尔比计为10以上，则存在基于荧光标记检测探针的错配的杂交的峰充分被抑制的倾向。

虽然也根据应检测的目标核酸的序列本身或检测探针、竞争探针覆盖该序列的哪些区域而不同，但一般来说，存在对于非目标核酸的竞争探针的tm值与荧光标记检测探针的tm值的差越大，则竞争探针/荧光标记探针的添加量以摩尔比计越小的倾向。本领域的技术人员可以目标核酸的序列为基础基于本发明所述的步骤通过常规的实验容易地决定探针的所述tm值的差和添加量。

此外，例如作为荧光标记检测探针及竞争探针各自的碱基长度和碱基序列的条件，可包括：

(i)目标核酸上与荧光标记检测探针杂交的区域包含与竞争探针杂交的区域；或者

(ii)目标核酸上与竞争探针杂交的区域包含与荧光标记检测探针杂交的区域；或者

(iii)目标核酸上与竞争探针杂交的区域和与荧光标记检测探针杂交的区域一致。

另外，该(i)～(iii)中所述的“杂交”既包括完全匹配的杂交，也包括错配的杂交。(i)或(ii)的情况下，与荧光标记检测探针杂交的区域和与竞争探针杂交的区域中任意较窄的区域与目标碱基序列对应。(iii)的情况下，荧光标记检测探针和竞争探针均具有与目标碱基序列相同的碱基长度，在完全一致的区域可相互竞争地杂交。

以上，例举了关于荧光标记检测探针及竞争探针的优选条件的例子。但是，荧光标记检测探针和竞争探针即使不是满足这些条件的探针，只要按照上述步骤(a)～(c)操作时，对照目标反应试样的一阶微分曲线具有峰，而对照非目标反应试样的一阶微分曲线实质上不具有峰即可。

本发明中，即使反应试样中包含非目标核酸，荧光标记检测探针向非目标核酸的错配的杂交也几乎被竞争探针抑制，因此非目标核酸实质上不会被荧光标记检测探针检出，也不会在温度-荧光强度曲线的一阶微分曲线中作为峰出现。并且，仅反应试样中包含目标核酸的情况下，出现基于荧光标记检测探针向核酸的杂交的峰。

由此，通过本发明所述的检测方法，可基于温度-荧光强度曲线的一阶微分曲线的峰的有无，明确地判别目标碱基序列的有无。另外，本发明所述的检测方法具有下述优点：即使作为对tm值造成影响的因素的反应液中的盐浓度发生一定程度的变化，也不易对判别能力产生影响，可稳定地获得准确的检测结果。

本发明所述的检测方法除了以上说明的步骤(1)～(3)之外，还可包括：

(4)当(3)中得到的一阶微分曲线具有峰的情况下，判断为核酸试样中存在目标碱基序列(a)的步骤。

在此，核酸试样除目标核酸以外还可包含非目标核酸。通过所述步骤(4)，可根据由步骤(1)～(3)得到的温度-荧光强度曲线的一阶微分曲线是具有峰的形状、还是实质上不具有峰的形状，容易地判断目标碱基序列(a)的有无。在此，核酸试样除目标核酸以外还可包含非目标核酸是指通过该方法，例如在基因诊断中，也可容易地判断是否存在等位基因的杂合子所含的目标碱基序列。

＜探针的设计方法＞

本发明还提供设计可用于上述的检测方法的荧光标记检测探针和竞争探针的方法。该方法包括：

(1')以如下的条件决定荧光标记检测探针和竞争探针各自的碱基长度和碱基序列的步骤：按照(a)～(c)操作时，对照目标反应试样的一阶微分曲线具有峰(极大值)，而对照非目标反应试样的一阶微分曲线不具有峰。

通过这样的探针的设计方法，可实现能够以高精度检测snp的单碱基的差异，根据温度-荧光强度曲线的一阶微分曲线的峰的有无，容易地判断目标碱基序列的有无的探针组。

＜探针的制造方法＞

此外，本发明还提供制造可用于上述的检测方法的荧光标记检测探针和竞争探针的方法。该方法包括：

(1")合成按照上述的探针的设计方法设计的各自的碱基长度和碱基序列的寡核苷酸的步骤；以及

(2")将荧光标记检测探针的寡核苷酸用可用于qp法的荧光染料标记的步骤。

寡核苷酸可人工合成，也可生物合成，基于其序列的制造方法在该技术领域中已周知，本领域的技术人员可选择适当的方法。

＜试剂盒＞

此外，本发明还提供用于上述的检测方法的试剂盒。本发明所述的试剂盒包括上述的荧光标记检测探针、竞争探针及使用说明书。使用说明书可包括例如关于可检测的目标碱基序列的信息、关于上述的检测方法的步骤(1)～(3)或步骤(1)～(4)的信息以及关于荧光标记检测探针和竞争探针各自的向核酸试样的添加量的信息等。

本发明所述的试剂盒可以是用于基因诊断的试剂盒。

＜基因诊断的方法＞

另外，本发明还提供利用上述的检测方法的基因诊断的方法。本发明所述的基因诊断的方法包括：

(1-1)从含dna的标本获得包含诊断对象的dna区域的核酸试样的步骤，

(1-2)向核酸试样中加入用可用于qp(消光探针/引物)法的荧光染料标记的检测探针和竞争探针，获得反应试样，由此荧光标记检测探针或竞争探针与反应试样中的具有目标碱基序列(a)的目标核酸杂交的步骤，

(2)改变反应试样的温度的同时，测定荧光强度的步骤，以及

(3)对由(2)的测定结果得到的温度-荧光强度曲线进行一阶微分的步骤；

在此，荧光标记检测探针和竞争探针满足与上述的目标碱基序列的检测方法同样的条件(i)～(iii)。由于使有无具有目标碱基序列的基因的判断更容易，因此本发明所述的基因诊断的方法可包括上述的检测方法的步骤(4)(当(3)中得到的一阶微分曲线具有峰的情况下，判断为核酸试样中存在目标碱基序列(a))。

此外，为了使方法更简便，本发明所述的基因诊断的方法可在步骤(1-1)中作为获得充分包含诊断对象的dna区域的核酸的核酸试样的手段，可通过lamp法使该dna区域的核酸扩增。由此，可提供与例如使用pcr法的现有的基因诊断方法相比，用时更短且简便的基因诊断方法。另外，本方法中的采用lamp法的扩增后的核酸如上所述为“来源于生物体的核酸试样”的一例。

以下的实施例是对本发明更具体地进行说明的例子，并不对本发明的范围造成任何限定。对本领域的技术人员而言具有通常的知识和技术的人在不超出本发明的主旨的范围内可对下述实施例中所示的形态进行各种改变，所述改变后的形态也包含在本发明内。

本领域的技术人员可参照以下的实施例针对各种对象的碱基序列适当设计可实现本发明的效果的荧光标记检测探针和竞争探针，不需要过度的试行错误。

实施例

实施例1:基于竞争探针添加的rpob基因变异的检测

使用本发明所述的检测目标碱基序列的方法，将与结核杆菌的利福平抗性获得相关的rpob基因的耐药决定区域(利福平耐药决定区域，rifampicinresistancedeterminingregion，rrdr)作为对象，实施了单碱基变异检测。该单碱基变异检测中，将由于rpob基因的碱基序列的第516个密码子中的1个碱基由a取代为t而导致其编码的氨基酸由asp取代为val的变异作为目标。包含该变异位点的区域的碱基序列以“具有目标碱基序列的目标核酸”(a等位基因)或“具有非目标碱基序列的非目标核酸”(t等位基因)表示。另外，实施例1相当于将“包含碱基变异核苷酸的目标碱基序列”作为野生型的碱基序列，将包含“碱基未变异核苷酸”的“非目标碱基序列”作为变异型的碱基序列，判别核酸试样中是否包含野生型的碱基序列的例子。

在此，作为前提，实施例1中，a等位基因中的目标碱基序列的有义链在上述变异位点具有“a”，t等位基因中的非目标碱基序列的有义链在上述变异位点具有“t”，但实际上使检测探针、竞争探针杂交的对象是各碱基序列的反义链。因此，如果将实施例1的内容与本申请所附的专利权利要求书的记载对照，与a等位基因的有义链互补的反义链相当于权利要求中的“目标核酸”的一例，与“目标碱基序列的有义链”互补的“目标碱基序列的反义链”相当于权利要求中的“目标碱基序列”的一例。同样地，t等位基因的反义链相当于权利要求中的“非目标核酸”的一例，非目标碱基序列的反义链相当于权利要求中的“非目标碱基序列”的一例。

将a等位基因中包含变异位点的核苷酸“a”(与其互补的反义链的“t”相当于权利要求中的“碱基变异核苷酸”的一例)的一定范围的碱基序列作为目标碱基序列的有义链，设计了包含与目标碱基序列的有义链相同的碱基序列的寡核苷酸的检测探针(rb516a-2)。对于作为t等位基因中与上述a等位基因中的目标碱基序列的范围相同的范围的碱基序列(即，除上述变异位点的核苷酸“a”(a等位基因的反义链中为“t”)替换为单碱基变异后的核苷酸“t”(t等位基因的反义链中为“a”)以外与上述目标碱基序列相同的碱基序列)的非目标碱基序列，设计了包含与该非目标碱基序列的有义链相同的碱基序列的寡核苷酸的竞争探针(rb516t-2-p)。另外，上述中，与t等位基因中的变异位点的核苷酸“t”互补的t等位基因的反义链中的“a”相当于权利要求中的“碱基未变异核苷酸”的一例。此外，如上所述，通过采用与各碱基序列的有义链相同的碱基序列，检测探针(rb516a-2)具有与目标碱基序列的反义链(权利要求中的“目标碱基序列”)互补的碱基序列，竞争探针(rb516t-2-p)具有与非目标碱基序列的反义链(权利要求中的“非目标积极性”)互补的碱基序列。分别合成这些设计的碱基长度和碱基序列的寡核苷酸，将检测探针用荧光染料tamra(商标)标记，从而制成荧光标记检测探针和竞争探针。另外，竞争探针未进行荧光染料的标记，对磷酸基进行了修饰。

[表1]

表1：实施例1中使用的探针

核酸试样如下制备：

关于上述的rpobrrdr的序列为变异型的基因序列和其单碱基变异位点的序列为野生型的基因序列，分别使用对亚克隆基因组dna中的以下区域：

结核杆菌(mycobacteriumtuberculosis)h37rvid：ref|nc_000962.3|760767-761516

(可在美国国家生物技术信息中心(ncbi)的genbank内检索)

而得的质粒进行限制酶处理(xbai/xhoi)得到的样品作为模板。更具体来说，从该数据库获得该h37rv的序列，制备人为地变异为耐药性序列(变异型)而得的质粒(采用欧陆基因组学株式会社(eurofinsgenomics)的人工基因合成服务)进行使用。同样地，也合成敏感性序列(野生型)的质粒，关于杂合，将合成的野生型与变异型的质粒混合使用。

对于上述的模板，使用以下的引物，在65℃进行了90分钟的lamp反应。lamp反应通过loopamp(注册商标)实时浊度测定装置la200(寺崎机械株式会社(teramecs))进行。

[表2]

表2：lamp反应中使用的引物

反应液的组成(25μl中)如下：

20mmn-三(羟甲基)甲基甘氨酸ph8.8、50mmkcl、8mmmgso4、1.4mmatp、1.4mmgtp、1.4mmctp、1.4mmttp、0.5％吐温20、16ubst-大片段。

此外，在lamp扩增反应前，添加荧光标记检测探针(最终浓度0.04μm)和竞争探针(最终浓度1.2μm)。在此，在lamp扩增反应前添加探针是为了防止反应后装有扩增产物的容器开封时扩增产物的携带污染(carryovercontamination)的危险性升高。

通过上述的反应，使变异型的模板中的t等位基因和野生型的模板中的a等位基因分别特异性扩增。由此，获得相当于在扩增产物中添加了荧光标记检测探针(最终浓度0.04μm)和竞争探针(最终浓度1.2μm)的反应试样。将这些反应试样通过装置mx3005p(安捷伦科技公司)在99℃加热5分钟后，以-2℃/30秒的速度降温，每隔30秒对荧光值进行了测定。关于通过测定得到的与温度-荧光强度曲线对应的数据，通过mx3005p(安捷伦科技公司)专用软件算出微分值。获得了图1所示的一阶微分曲线(热解离曲线)。

如图1的实验数据所示，通过添加具有与目标碱基序列相同的区域的与非目标碱基序列的有义链相同的碱基序列的竞争探针，可实现若反应试样中有目标碱基序列会在热解离曲线中出现峰(淬灭峰)，若反应试样中实质上不含目标碱基序列实质上不出现峰的检测体系。

如果采用该检测体系，对来源于野生型的不具有单碱基变异的个体的目标核酸(a等位基因)适用上述的检测方法时，所得的热解离曲线具有峰，所以可判断该个体为不具有变异型的单碱基变异的野生型，而对来源于具有变异型的单碱基变异的个体的非目标核酸(t等位基因)适用上述的检测方法时，所得的热解离曲线不具有峰，所以可判断该个体不具有野生型的目标核酸。

此外，假设核酸试样来源于等位基因的单碱基变异的基因型为变异型/野生型的杂合的情况，对目标核酸(a等位基因)和非目标核酸(t等位基因)的混合物也进行了同样的实验。所得的热解离曲线(图1中以一点划线表示)具有比仅目标核酸(a等位基因)的情况下所得的峰弱的峰。因此，可根据热解离曲线具有峰，判断该个体具有野生型的单碱基变异。此外，提示根据检测探针和竞争探针的条件，还可实现通过峰的强度预测单碱基变异的基因型是野生型的纯合还是变异型/野生型的杂合的半定量的判别。

实施例2:竞争探针的设计条件(1)(与部分竞争型探针的比较)

关于与实施例1同样的rpobrrdr的基因，对用于检测单碱基变异的探针的设计条件进行了探讨。将如图2所示的具有目标碱基序列的目标核酸(a等位基因，序列编号9(按照3'→5'方向看的序列))和具有非目标碱基序列的非目标核酸(t等位基因，序列编号10(按照3'→5'方向看的序列))分别用于对照目标核酸试样和对照非目标核酸试样。对于这些目标核酸和非目标核酸，分别设计了具有与目标碱基序列的有义链和非目标碱基序列的有义链相同的(即，分别与以序列编号9表示的碱基序列中的目标碱基序列和以序列编号10表示的碱基序列中的非目标碱基序列互补的)碱基序列的检测探针和竞争探针。这些检测探针和竞争探针具有相同的碱基长度，具有除与变异位点的核苷酸(“t”或“a”)互补的1个碱基不同以外相同的碱基序列。

为了与本发明中的使用竞争探针的情况比较，设计了2种部分竞争型探针。部分竞争型探针-1和部分竞争型探针-2按照其碱基序列的一部分可对于目标核酸上与检测探针共通的区域杂交的条件设计。

本实施例中，为了探讨竞争探针的设计条件，关于向含目标核酸、但实质上不含非目标核酸的核酸试样(对照目标核酸试样)和实质上不含目标核酸、但含非目标核酸的核酸试样(对照非目标核酸试样)分别添加了检测探针(最终浓度0.04μm)和竞争探针(最终浓度1.2μm)的各反应试样，与实施例1同样地在改变温度的同时测定了荧光强度。

同样地，关于向对照目标核酸试样和对照非目标核酸试样分别添加了检测探针(最终浓度0.04μm)和部分竞争型探针-1或部分竞争型探针-2(最终浓度1.2μm)的各反应试样，也在改变温度的同时测定了荧光强度。

另外，作为对照实验，向对照目标核酸试样和对照非目标核酸试样分别仅添加检测探针(最终浓度0.04μm)，在改变温度的同时测定了荧光强度。结果示于图3-1。

如图3-2所示，仅使用检测探针的情况和将部分竞争型探针与检测探针一起使用的情况下，关于对照非目标核酸试样得到的温度-荧光强度曲线的一阶微分曲线在比关于对照目标核酸试样的一阶微分曲线的淬灭峰更接近低温侧的位置具有淬灭峰。这是基于检测探针与非目标核酸的错配的杂交的淬灭峰。例如根据盐浓度等条件，出现该基于错配的杂交的淬灭峰的温度可能会向高温偏移，有可能误认为基于检测探针与目标核酸的完全匹配的杂交的淬灭峰。

另一方面，将上述的竞争探针与检测探针一起使用的情况下，关于对照非目标核酸试样的一阶微分曲线实质上不具有淬灭峰。因此，该竞争探针可与上述检测探针一起用于本发明的检测方法，通过该竞争探针，可实现若实质上不含目标核酸则实质上不会出现淬灭峰的检测体系。

该结果也可认为是如实地表示相对于专利文献1所述的发明的本发明的效果的显著性的例子。

实施例3:竞争探针的设计条件(2)(关于tm值)

关于与实施例1和实施例2同样的rpobrrdr的基因，为了探讨用于竞争探针设计的tm值条件，将荧光标记检测探针和竞争探针分别对于目标核酸和非目标核酸的结合力作为tm值算出，考察了与上述的温度-荧光强度曲线的一阶微分曲线中的淬灭峰的有无的相关性。

本实施例中，与实施例1、实施例2不同，目标核酸采用t等位基因(变异型的碱基序列)，非目标核酸采用a等位基因(野生型的碱基序列)。即，将如图4-1所示的具有目标碱基序列的目标核酸(t等位基因，序列编号10(按照3'→5'方向看的序列))和具有非目标碱基序列的非目标核酸(a等位基因，序列编号9(按照3'→5'方向看的序列))分别用于对照目标核酸试样和对照非目标核酸试样。本实施例中，通过将与t等位基因完全匹配的(即，与以序列编号10表示的碱基序列中的目标碱基序列完全互补的)检测探针用荧光染料bodipy(注册商标)fl标记，制成荧光标记探针(作为荧光标记检测探针)。此外，制成10种与a等位基因完全匹配的(即，与以序列编号9表示的碱基序列中的非目标碱基序列完全互补的)tm值不同的竞争探针。tm值不同的多种竞争探针通过对于荧光标记探针将竞争探针的碱基长度从比荧光标记探针短数个碱基的长度至比荧光标记探针长数个碱基的长度进行各种变更而制成。

使用1种与t等位基因完全匹配的荧光标记探针(最终浓度0.04μm)和10种与a等位基因完全匹配的竞争探针(最终浓度1.2μm)，通过与实施例1同样的方法测定了淬灭峰的有无。荧光标记探针和竞争探针分别对于目标核酸、非目标核酸的tm值如图4-2的表和图4-3的图表所示。对于完全匹配(对于t等位基因的荧光标记探针、对于a等位基因的竞争探针)、错配(对于a等位基因的荧光标记探针、对于t等位基因的竞争探针)的tm值使用meltcalc99free(http://www.meltcalc.com/)以设定条件:naeq.[mm]50的条件算出。

其结果是，如图4-2和图5所示，对于a等位基因的竞争探针(a等位基因完全匹配)的tm值比荧光标记探针(t等位基因完全匹配)的tm值高10.1℃以上时(使用“rb516a-3-p-7”、“rb516a-3-p-8”、“rb516a-3-p-9”或“rb516a-3-p-10”作为竞争探针时)，以a等位基因为模板时的淬灭峰消失。

另一方面，如果对于t等位基因的竞争探针(a等位基因完全匹配)的tm值比荧光标记探针(t等位基因完全匹配)的tm值高-1.8℃以上，将t等位基因作为模板时的淬灭峰逐渐衰减，如果高9.9℃(使用“rb516a-3-p-9”或“rb516a-3-p-10”作为竞争探针)，以t等位基因为模板时的淬灭峰消失。理论上，对于目标核酸的竞争探针的tm值比荧光标记检测探针的tm值高时，竞争探针比荧光标记检测探针更稳定地与目标核酸杂交，所以这被认为是由于荧光标记检测探针对于目标核酸的杂交被抑制，可检测的淬灭减少。

由该实验可知，对照目标反应试样(含有t等位基因的试样)的一阶微分曲线具有淬灭峰，但对照非目标反应试样(含有a等位基因的试样)的一阶微分曲线实质上不具有淬灭峰的是使用荧光标记探针“rb516t-3b”与竞争探针“rb516a-3-p-7”的组合、或者荧光标记探针“rb516t-3b”与竞争探针“rb516a-3-p-8”的组合的情况，可确定所述组合的探针组优选。

作为该例子中的tm值条件，发现优选对于非目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记探针的tm值高10.1℃以上，且对于目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记探针的tm值低。

另外，该例子中，对于目标核酸，即使竞争探针的tm值比荧光标记探针的tm值高，其差为6.1℃以下的情况下，对照目标反应试样的一阶微分曲线具有淬灭峰，对照非目标反应试样的一阶微分曲线实质上不具有淬灭峰，因此认为足以适用于本发明。因此，例如对于非目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记探针的tm值高至少10℃，且对于目标核酸，竞争探针的tm值不高于荧光标记探针的tm值+6.1℃，较好是不高于荧光标记探针的tm值+5℃也可认为是另一优选的tm值条件的例子。

在此，对于目标核酸的竞争探针的tm值比荧光标记探针的tm值高的情况下，存在对于非目标核酸的竞争探针的tm值也进一步升高的倾向，例如对于非目标核酸的竞争探针的tm值可比荧光标记探针的tm值高15℃以上(具体来说，如果参照图4-2，使用竞争探针“rb516a-3-p-8”的情况下竞争探针的tm值比荧光标记探针的tm值高16.8℃)。因此，例如对于非目标核酸，竞争探针的tm值比荧光标记探针的tm值高至少15℃，且对于目标核酸，竞争探针的tm值不高于荧光标记探针的tm值+5℃也可认为是另一优选的tm值条件的例子。

另外，上述实施例1和实施例2中，对检测具有野生型的碱基序列的目标碱基序列的例子进行了说明，上述实施例3中，与上述实施例1和实施例2相反，对用于检测变异型的碱基序列的探针的设计条件的探讨的例子进行了说明，但将目标碱基序列作为野生型的碱基序列还是作为变异型的碱基序列无特别限定。例如，可将上述实施例3中说明的方法与上述实施例3相反地适用于探讨用于检测野生型的碱基序列的探针的设计条件。作为所述变更的情况下，分别设计与a等位基因完全匹配的1种荧光标记探针和与t等位基因完全匹配的tm值不同的多种竞争探针，通过与上述同样的方法测定淬灭峰的有无即可。

实施例4:关于其他基因探讨用于检测单碱基变异的探针的设计条件(tm值)的例子

本发明人示出关于rpobrrdr以外的单碱基变异的检测，也可适用本发明的检测方法。本实施例中，与实施例1～3不同，以人的基因中的某个特定的单碱基变异的判别为目的，对检测探针和竞争探针的设计条件(tm值)进行了探讨。本实施例中，首先，决定包含作为对象的单碱基变异位点的适当长度的目标碱基序列，制成与目标碱基序列互补的检测探针并用荧光染料标记，作为荧光标记检测探针。然后，对于同样的检测探针将竞争探针的碱基长度从比检测探针短数个碱基的长度至比检测探针长数个碱基的长度作出各种变更，如上所述关于对照目标反应试样和对照非目标反应试样进行求一阶微分曲线的实验，对用于检测单碱基变异的探针的设计条件进行了探讨。根据该实验获得了下述结果：作为竞争探针的各种碱基长度和碱基序列的条件，对于非目标核酸，竞争探针的tm值比检测探针的tm值高至少5℃，且对于目标核酸，竞争探针的tm值比检测探针的tm值低，且竞争探针/荧光标记检测探针的添加量以摩尔比计为30/1的情况下，对照目标反应试样的一阶微分曲线具有淬灭峰，但对照非目标反应试样的一阶微分曲线实质上不具有淬灭峰(或者，虽然具有淬灭峰，但是明显比对照目标反应试样的一阶微分曲线的淬灭峰弱的淬灭峰，可与对照目标反应试样的情况明显区分)。

但是，对于非目标核酸的竞争探针的tm值与检测探针的tm值的差低于5℃的情况下，结果基于检测探针与非目标核酸的错配的杂交的峰未被抑制，对照非目标反应试样的一阶微分曲线上也可见与对照目标反应试样的一阶微分曲线相似的淬灭峰。另一方面，对于目标核酸，使竞争探针的tm值比检测探针的tm值高的情况下，得到的基于目标核酸检测的淬灭峰本身减小的结果。由于对于目标核酸，竞争探针比检测探针更稳定地杂交，因此这被认为是因为基于检测探针对于目标核酸的杂交的检测被阻碍。

此外，还发现上述条件中，除对于非目标核酸，使竞争探针的tm值比检测探针的tm值高至少15℃以外，与上述条件相同的情况下，与使对于同一非目标核酸的竞争探针的tm比检测探针的tm值高5～10℃左右的情况相比，对照非目标反应试样的一阶微分曲线的形状更加平坦。由此可认为，本发明中，通过相对于检测探针对目标核酸的杂交的热稳定性，更大幅地提高竞争探针对非目标核酸的特异性(杂交的热稳定性)，看更可靠地抑制基于特异性低的错配的杂交的淬灭峰。

由上述实施例3和实施例4的结果可知，优选的tm值条件根据应检测的目标核酸的序列本身和荧光标记检测探针、竞争探针覆盖该序列的哪些区域而不同，还会根据各探针的添加浓度和试样中的盐浓度等而复杂地变动。但是，本领域的技术人员通过将由上述实施例3和实施例4发现的优选的tm值作为参考，进行基于本发明所述的步骤的实验，可觉得用于实现本发明的效果的荧光标记检测探针和竞争探针的碱基长度和碱基序列，不需要过度的试行错误。

工业上利用的可能性

本发明提供简便且可靠地判别snp等1个碱基的差异的手段，而且与以往的方法不同，不需要对tm值造成影响的反应试样的盐浓度等条件的严格管理，从而可实现snp分型技术的简化，能够广泛地应用于基因检查、药物研发、医疗诊断等。

序列表

<110>荣研化学株式会社

<120>检测目标碱基序列的方法、设计和制造探针的方法以及试剂盒

<130>pct2842ek

<160>14

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