用于分离和处理颗粒靶标的方法和装置与流程

本发明涉及一种使用毛细管细胞分选装置分离和处理位于基体上的颗粒靶标的方法。

背景技术：

来自肿瘤、内皮组织、组织细胞、干细胞和其他材料的分离细胞是医学诊断应用或生命科学研究中用于分析和病人资料收集的先决条件。然而，分离单颗粒靶标(例如细胞)的当前方法更经常地对应于富集方法，而不是真正分离单细胞。

例如，设计成从体液(例如血液)中按照大小分离上皮性肿瘤细胞(例如循环癌细胞(ctc))的过滤器被rarecellssas商业化，并且实际上富集了这种细胞。这意味着被捕获在过滤器中的多个细胞在细胞类型和基因学方面都不相同。因此，不可能批量分析收集的细胞，并因此必须单独分离各个细胞以确定其基因类型。

还可以通过激光显微切割方法从组织样本分离单细胞或细胞簇，该激光显微切割方法存在多种变型。例如，wo2006031574a1描述了使用一种特殊的基于激光的技术(称为激光捕获显微切割)，在该技术中能够通过利用热塑性膜的ir激光诱导转移从生物组织样本提取小细胞区。ep0879408b1中描述的另一种变型在于称为激光弹射器技术的技术。第一，使用激光在感兴趣区域(例如组织样本中的细胞)的周围切割，第二，通过使用激光脉冲将该区域弹射到收集容器中。de10003588c1公开了一种激光显微切割技术，在该技术中，在第一步骤中，使用激光从膜载玻片上的组织样本切出细胞，并且在第二步骤中，通过将切割区域粘附到粘附帽上来分离该细胞，并随后使用裂解缓冲液提取细胞组分(如dna或rna)，用于进一步的基因分析。

所有以上方法都需要两个不连续的步骤：从靶细胞的环境和/或基体选择并且分离该靶细胞的第一步骤和随后的将靶细胞转移到单独容器的第二步骤，然后，在该单独容器中将例如裂解缓冲液的处理液添加到先前分离出的靶细胞。这些方法是劳动密集型的，即使是自动化的，也需要使用额外的容器和材料，例如转移箔和试管。

尽管已经使用激光显微切割从组织样本切出细胞，但这些方法不适合从细胞培养容器的底部分离贴壁细胞，特别是培养细胞。

因此，期望提供一种方法以及合适的装置，通过该方法和装置能够以更有效且简单的方式分离和处理单颗粒靶标(例如细胞)，以简化对这种单颗粒靶标的处理。

技术实现要素：

本发明的方法和装置通过提供一种方法和装置克服了以上问题，在该方法和装置中同时进行靶颗粒(例如细胞)的分离和处理，实质上是通过将颗粒靶标吸入填充有处理液的毛细管中并且在毛细管内进行处理，而不是将颗粒靶标转移到单独的容器进行处理。

因此，本发明的目的是提供一种使用装置来分离和处理优选位于基体上的颗粒靶标的方法，所述装置包括：

包括尖端孔和内腔的至少一个毛细管，所述内腔包括处理液，

定位元件，能够定位毛细管的尖端孔，

排出/吸入元件，能够将液体从毛细管排出以及将液体吸入毛细管中，

所述方法包括以下步骤：

a.将待分离和处理的颗粒靶标设置在基体上；

b.使用定位元件定位毛细管的尖端孔，使得毛细管的尖端孔接近颗粒靶标；

c.使用排出/吸入元件优选从毛细管的内腔排出足够量的处理液，以便将颗粒靶标基本封闭在处理液中；

d.将封闭在处理液中的颗粒靶标吸入毛细管的内腔，

e.在包括处理液的毛细管的内腔内对颗粒靶标进行处理。

本发明的另一个目的是提供一种使用装置来分离和裂解优选位于基体上的靶细胞的方法，所述装置包括：

包括尖端孔和内腔的至少一个毛细管，所述内腔包括细胞裂解缓冲液，

定位元件，能够定位毛细管的尖端孔，

排出/吸入元件，能够将液体从毛细管排出以及将液体吸入毛细管中，

所述方法包括以下步骤：

a.将待分离和裂解的颗粒靶标设置在基体上，

b.使用定位元件定位毛细管的尖端孔，使得毛细管的尖端孔接近靶细胞，

c.使用排出/吸入元件优选从毛细管的内腔排出足够量的细胞裂解缓冲液，以便将靶细胞基本上封闭在细胞裂解缓冲液中，

d.使用排出/吸入元件将封闭在细胞裂解缓冲液中的靶细胞吸入毛细管的内腔中；

e.使靶细胞在包括细胞裂解缓冲液的毛细管内腔内裂解，并可选地

f.将中和液引入毛细管的内腔中，以便中和细胞裂解缓冲液，或将靶细胞裂解物排出到优选包括中和液的接收器中，以便中和细胞裂解缓冲液。

本发明的另一个目的是提供一种使用装置来分离和蛋白水解处理优选位于基体上的靶细胞的方法，所述装置包括：

包括尖端孔和内腔的至少一个毛细管，所述内腔包括蛋白水解缓冲液，

定位元件，能够定位毛细管的尖端孔，

排出/吸入元件，能够将蛋白水解缓冲液从毛细管排出以及将蛋白水解缓冲液吸入毛细管中，

所述方法包括以下步骤：

a.将待分离和蛋白水解处理的靶细胞定位在基体上，

b.使用定位元件定位毛细管的尖端孔，使得毛细管的尖端孔接近靶细胞，

c.使用排出/吸入元件优选从毛细管的内腔排出足够量的蛋白水解缓冲液，以便将靶细胞基本上封闭在蛋白水解缓冲液中，

d.使用排出/吸入元件将封闭在蛋白水解缓冲液中的靶细胞吸入毛细管的内腔中，

e.在包括蛋白水解缓冲液的毛细管内腔内对靶细胞进行蛋白水解处理，并可选地

f.将中和液引入毛细管的内腔中，以便中和蛋白水解缓冲液，或将经蛋白水解处理的靶细胞排出到优选包括中和液的接收器中，以便中和蛋白水解缓冲液。

本发明的另一个目的是提供一种用于分离和处理优选位于基体上的颗粒靶标的方法中的装置，所述装置包括：

a.包括尖端孔和内腔的至少一个毛细管，所述内腔配置成包括处理液，

b.定位元件，配置成能够将毛细管的尖端孔定位为接近颗粒靶标，

c.排出/吸入元件，配置成将处理液从毛细管排出以及将处理液吸入毛细管中。

本发明的另一个目的是提供一种用于分离和裂解优选位于基体上的颗粒靶标的方法中的装置，所述装置包括：

a.包括尖端孔和内腔的至少一个毛细管，所述内腔配置成包括细胞裂解缓冲液，

b.定位元件，配置成能够将毛细管的尖端孔定位为接近细胞，

c.排出/吸入元件，配置成将细胞裂解缓冲液从毛细管排出以及将细胞裂解缓冲液吸入毛细管中。

本发明的另一个目的是提供一种用于分离和蛋白水解处理优选位于基体上的细胞的方法中的装置，所述装置包括：

a.包括尖端孔和内腔的至少一个毛细管，所述内腔配置成包括蛋白水解缓冲液，

b.定位元件，配置成能够将毛细管的尖端孔定位为接近细胞，

c.排出/吸入元件，配置成将蛋白水解缓冲液从毛细管排出以及将蛋白水解缓冲液吸入毛细管中。

进一步的实施例在权利要求以及本发明的以下详细描述中给出。

附图说明

下面参考附图描述本发明的优选实施例，附图是为了说明而不是限制本发明的优选实施例。在附图中：

图1示出了具有内腔(4)的毛细管(3)，并且毛细管的尖端孔被定位为接近位于基体(1)上的颗粒靶标(2)。

具体实施方式

因此本发明的目的是提供一种使用装置来分离和处理存在的颗粒靶标(特别是单颗粒靶标)的方法，所述装置包括：

包括尖端孔和内腔的至少一个毛细管，所述内腔包括处理液，

定位元件，能够定位毛细管的尖端孔，

排出/吸入元件，能够将液体从毛细管排出以及将液体吸入毛细管中，

所述方法包括以下步骤：

a.设置待分离和处理的颗粒靶标；

b.使用定位元件定位毛细管的尖端孔，使得毛细管的尖端孔接近颗粒靶标；

c.使用排出/吸入元件排出一定量的处理液，以便将颗粒靶标封闭在处理液中；

d.将封闭在处理液中的颗粒靶标吸入毛细管的内腔中，

e.对包括处理液的毛细管内腔内的颗粒靶标进行处理，并且可选地

f.将中和液引入毛细管的内腔中，以便中和处理液，或者将颗粒靶标排出到优选包括中和液的接收器中，以便中和处理液。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，颗粒靶标可以是无生命的靶标颗粒，特别是无生命的单靶标颗粒，例如无机颗粒靶标或有机颗粒靶标，例如在法医调查或地质调查的情况下待分离和处理的无生命的靶标颗粒。这种无生命的颗粒靶标的示例是灰尘颗粒、晶体颗粒、金刚石颗粒、盐颗粒、硫化物颗粒、氧化物颗粒和金属颗粒。特别地，无生命的颗粒靶标可以嵌入天然或人造材料中。这种嵌入的示例是嵌入天然岩石中的地质感兴趣的靶颗粒或嵌入石蜡基质中的法医感兴趣的靶颗粒以用于保存目的。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，颗粒靶标还可以是细胞，特别是单细胞或其聚合体，即真核或原核单细胞或其聚合体。原核细胞的聚合体的示例是细菌或真菌细胞的菌落，而原核细胞的聚合体能够是来自细胞培养物的聚集细胞或组织样本。特别地，颗粒靶标也可以是单动物细胞或其聚合体，例如循环细胞(像白细胞、血小板或红细胞)，或培养的单动物细胞(诸如，非贴壁细胞和贴壁细胞)。在诊断背景下特别感兴趣的单动物细胞是循环肿瘤细胞(ctc)，该循环肿瘤细胞可以是能够例如通过从血液样本过滤得到的单ctc或ctc簇。为了便于细胞的分离，可以例如使用本领域已知的荧光标记或染料对细胞进行标记。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，颗粒靶标是细胞(诸如真核或原核细胞)或其聚合体，并且优选为单动物细胞或其聚合体。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，处理液不是生长培养基。处理液可以是用于蛋白水解处理的酶促缓冲液，该酶促缓冲液能够用于将培养的动物细胞的聚合体或培养的单动物细胞从在其上培养它们的基体解离。该酶促缓冲液的示例是胰蛋白酶缓冲液。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，处理液不是生长培养基。例如当颗粒靶标是要进行基因分析的细胞时，处理液是细胞裂解缓冲液或细胞解离缓冲液。这种细胞裂解缓冲液的示例是磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液、tris-hcl缓冲液和hepes-naoh缓冲液。通常，在处理液中，即在裂解缓冲液中处理颗粒靶标(即细胞)持续1秒至10分钟，优选5秒至5分钟。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，颗粒靶标(优选为无生命的颗粒靶标，例如无机颗粒靶标或有机颗粒靶标)嵌入固体材料中，并且该固体材料优选在处理液中可溶。该固体材料能够是天然或人造材料。例如，处理液可以是有机溶剂或有机酸或无机酸。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，基体可以是能够承载颗粒靶标的任何合适的主体，例如载玻片、聚合物膜、滤板或滤膜或者细胞培养容器的底板。在颗粒靶标是动物细胞的情况下，特别是在动物细胞是循环肿瘤细胞(ctc)的情况下，基体能够是滤板或滤膜。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，毛细管的尖端孔被定位成使得毛细管的孔至少在颗粒靶标的20μm内，优选10μm内，和/或其中，该颗粒靶标具有的尺寸为100nm至100μm，优选为500nm至50μm，更优选为1μm至50μm。

在根据本发明的分离和处理颗粒靶标的方法中使用的装置包括至少一个毛细管(该至少一个毛细管包括尖端孔和内腔，所述内腔包括处理液)、能够定位毛细管的尖端孔的定位元件、能够将处理液从毛细管排出以及将处理液吸入毛细管的排出/吸入元件。

包括尖端孔和内腔的毛细管能够商业购买。由于尖端孔的直径必须被选择成使得颗粒靶标能够进入毛细管，因此虽然尖端孔的直径不受特别限制，但是在大多数情况下，尖端孔的直径为1μm至1000μm，更优选地为10μm至1000μm，且甚至更优选地为10μm至50μm。内腔的直径不受特别限制，只要内腔的直径至少等于或大于尖端孔的直径即可。作为示例，合适的直径为100μm至5000μm，并且优选为100μm至1000μm。毛细管可以由任何合适的材料形成，例如玻璃、聚合物或石英。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，毛细管还能够包括一个或更多个集成监控区域，该一个或更多个集成监控区域被配置为允许通过诸如光学设备(如光谱仪)的监控设备来监控在毛细管内腔中对颗粒靶标的处理。集成监控区域对应于毛细管上被配置为允许具有预定波长或波长范围的电磁辐射(例如uv、ir或vis辐射)透射穿过集成监控区域并且进入内腔然后返回的区域。优选地，集成监控区域被配置为允许透射优选辐射的至少75％或至少80％。根据所使用的电磁辐射的所需波长，集成监控区域可以由不同材料制成。例如，合适的材料是具有340至2500nm的光学波长透射范围的玻璃，具有380至780nm(vis)的波长透射范围的聚合物和具有低于380nm(uv)的波长透射范围的石英。该一个或更多个集成监控区域能够例如形成为两个径向相对的集成监控区域，或者形成为环绕毛细管的一个连续集成监控区域，从而形成环形集成监控区域。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，在将颗粒靶标封闭在处理液中之后基本上立即将封闭在处理液中的颗粒靶标吸入毛细管的内腔中，使得处理基本上是在毛细管的内腔中进行的。特别是在颗粒靶标是单细胞或其聚合体的情况下，将封闭在处理液中的颗粒靶标吸入毛细管内腔中优选在数秒内进行，更优选地在将颗粒靶标封闭在处理液后的一分钟内进行。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，该装置还能够包括监控元件，该监控元件被配置为优选地经由集成监控区域来监控对毛细管内腔中颗粒靶标的处理。监控元件优选地包括辐射源和辐射检测器。辐射源可以是能够发射限定波长范围内的uv、ir或vis光的光源，而辐射检测器能够检测在相同限定波长范围内的光，或者例如，在当通过测量荧光来监控毛细管内腔中颗粒靶标的处理时的情况下也是如此，检测相应发射波长范围的光。在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，辐射源、集成监控区域和辐射检测器沿公共轴线布置。

本发明的另一个目的是提供一种使用装置来分离和处理颗粒靶标(特别是单颗粒靶标，例如，细胞)的方法，所述装置包括：

包括尖端孔和内腔的至少一个毛细管，所述内腔包括处理液和集成监控区域，

定位元件，能够定位毛细管的尖端孔，

排出/吸入元件，能够将液体从毛细管排出以及将液体吸入毛细管中，

监控元件，能够经由毛细管的集成监控区域来监控对毛细管内腔中的颗粒靶标的处理，

所述方法包括以下步骤：

a.设置待分离和处理的颗粒靶标；

b.使用定位元件定位毛细管的尖端孔，使得毛细管的尖端孔接近颗粒靶标；

c.使用排出/吸入元件排出一定量的处理液，以便将颗粒靶标封闭在处理液中；

d.将封闭在处理液中的颗粒靶标吸入毛细管的内腔中，

e.对包括处理液的毛细管内腔内的颗粒靶标进行处理，

f.使用监控元件确定是否已经完成对毛细管内腔中颗粒靶标的处理，如果已经完成，则可选地将中和液引入毛细管的内腔中以便中和处理液，或者将颗粒靶标排出到优选包括中和液的接收器中以便中和处理液。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，该装置还能够包括定位元件，该定位元件能够定位毛细管的尖端孔，该定位元件能够手动地或自动地操作。毛细管通常通过夹紧元件固定到定位元件，该夹紧元件夹紧在毛细管的固定部分的周围。在一个实施例中，定位元件是配置成将毛细管的尖端孔定位在三维空间中的高精度机械臂。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，该装置还能够包括排出/吸入元件，该排出/吸入元件能够使处理液从毛细管排出以及将处理液吸入毛细管中，该排出/吸入元件能够是高精度泵，该高精度泵允许排出或吸入纳升范围内的少量处理溶液，以开始处理用于处理的单颗粒靶标(例如动物细胞)。通常，排出和/或吸入的量能够能够被选择为1至1000nl，优选10至500nl。排出/吸入元件能够手动地或自动地操作。在优选实施例中，通过优选吸入相同量或优选较少量的预先排出的处理液，将封闭在一定量的处理液中的颗粒靶标吸入毛细管的内腔中，以封闭颗粒靶标。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，并且在毛细管还包括集成监控区域(该集成监控区域被配置为允许通过光学装置监控在毛细管内腔中对颗粒靶标的处理)的情况下，该装置还包括控制元件，该控制元件被配置成i)从监控元件接收指示毛细管内腔中的颗粒靶标的处理进程的信息，和ii)在从监控元件接收到指示处理完成的信息时，通过控制排出/吸入元件将颗粒靶标从毛细管排出。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，并且在例如监控元件包括辐射源和辐射检测器的情况下，控制单元被配置成i)接收具有来自辐射源和辐射检测器的电信号或光信号形式的指示颗粒靶标(例如毛细管内腔中的细胞)的处理进程的信息，和ii)在从监控元件接收到指示处理完成的信息时，通过控制排出/吸入元件将颗粒靶标(例如，细胞)从毛细管排出。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，该装置还包括释放元件，该释放元件被配置成通过例如超声波脉冲或激光脉冲将颗粒靶标从基体释放。在释放元件通过超声波脉冲来促进颗粒靶标的释放的情况下，释放元件可以是配置成经由例如第二定位元件定位在颗粒靶标附近的超声波换能器针或抹刀。在释放元件通过激光脉冲来促进颗粒靶标的释放的情况下，释放元件可以是能够经由例如第二定位元件聚焦在颗粒靶标附近的激光发射元件，并且能够传送0.1～1000μj，优选1～100μj和/或约1～100000皮秒，优选约1～10000皮秒的连续脉冲。波长优选被选择为使得不影响颗粒靶标的完整性，即以便不杀死细胞。在本发明的一个实施例中，释放元件可以是针或抹刀，在没有超声波或激光的情况下，该针或抹刀由诸如聚合物或金属的合适材料形成。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，至少毛细管的尖端孔和/或内腔和/或释放元件进一步用例如聚硅氧烷层或含氟聚合物层的疏水层作内衬，或用亲水层作内衬以增强毛细管的尖端孔和/或内腔和/或释放元件的润湿。

在根据本发明的方法和装置的优选实施例中，毛细管的尖端部分和/或纵向轴线相对于由基体限定的平面取向于法线方向上，或毛细管的尖端部分和/或纵向轴线相对于由基体限定的平面取向于非法线方向上，并且优选地取向为相对于由基体限定的平面成30至60度。

附图标记列表

1.承载体53.毛细管

2.颗粒靶标4.内腔