具有质量控制示踪剂的阵列的制作方法

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对序列表的引用

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背景

生物阵列是用于对分子包括脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)进行检测、分析和/或测序的宽范围的工具中的一种。在这些应用中，阵列被工程化成包括可用作测序或扩增引物或可用作用于人类和其他生物体的基因中存在的核苷酸序列的探针的核酸序列。除了这些应用之外，生物阵列还可以用于检测和评估宽范围的分子、分子家族、基因表达水平、单核苷酸多态性和基因分型。

通常，基因测序涉及确定一段遗传物质诸如dna或rna的片段中的核苷酸或核酸的顺序。越来越长的碱基对的序列被分析，并且所得到的序列信息可以在各种生物信息学方法中用于将片段逻辑地拟合在一起，以便可靠地确定片段源自的广泛长度的遗传物质的序列。已经开发了特征片段的自动化的基于计算机的检查，并且已经将其用于基因组作图、基因及其功能的识别、某些状况和疾病状态的风险的评估以及其他。例如，在某些应用中，修饰的靶核酸与阵列的表面上的测序或扩增引物杂交，被扩增，并且确定它们的基因序列。

在其他实例中，单独的dna和rna探针可以在阵列支持物上以几何栅格(或随机地)附接在小位置处。例如来自已知的人或生物体的测试样品可以暴露于栅格，使得互补片段与在阵列中的单独位点处的探针杂交。然后可以通过扫描位点上的特定频率的光以通过片段杂交的位点的荧光识别出哪些片段存在于样品中来检查阵列。

核酸官能化的阵列的适当的功能和再现性取决于与其结合的核酸序列的一致显示。本申请涉及质量控制组合物、阵列，以及用于确保核酸序列在阵列表面上的一致沉积和在阵列的任何后续制造和储存后保留序列的方法。

概述

在某些方面中，本公开内容涉及一种阵列，该阵列包括支持物，所述支持物包括多于一个离散孔、位于各个所述多于一个离散孔中的凝胶材料、以及质量控制示踪剂，所述质量控制示踪剂被接枝至各个所述多于一个离散孔中的凝胶材料。在一些实施方案中，被接枝至凝胶材料的质量控制示踪剂包括(a)包含裂解位点的可裂解的核苷酸序列和(b)可检测标记物。在一些实施方案中，质量控制示踪剂在示踪剂的第一末端被接枝至凝胶材料。在一些实施方案中，可裂解的核苷酸序列包含具有第一末端和第二末端的接枝的区域，其中第一末端被接枝至凝胶材料，并且第二末端被连接至可裂解的区域，该可裂解的区域被连接至可检测标记物并且包含裂解位点。在一些实施方案中，可裂解的核苷酸序列包含非反应性核苷酸序列，并且在一些情况下，接枝的区域包含非反应性核苷酸序列。在其他实施方案中，可裂解的核苷酸序列包含引物核苷酸序列，并且在一些情况下，接枝的区域包含引物核苷酸序列。

在一些实施方案中，可检测标记物被连接至质量控制示踪剂或可裂解的核苷酸序列的裂解位点处。在其他实施方案中，可检测标记物在远离裂解位点和接枝的第一末端的位置处被连接至质量控制示踪剂或可裂解的核苷酸序列(例如，支持物–示踪剂的接枝的第一末端–示踪剂的裂解位点–示踪剂上的可检测标记物)，并且在另外的实施方案中，该位置在可裂解的核苷酸序列的3’末端处。在一些实施方案中，可检测标记物被附接在可裂解的核苷酸序列的3’末端处或附近。在一些实施方案中，可裂解的核苷酸序列在其5’末端处被接枝至凝胶材料。在一些实施方案中，可检测标记物是通过质量控制示踪剂与核酸外切酶的反应可裂解的。在其他实施方案中，可检测标记物是通过质量控制示踪剂与糖基化酶和内切核酸酶的反应可裂解的。

在一些实施方案中，裂解位点是可裂解的核碱基。在一些实施方案中，可裂解的核碱基是酶可裂解的核碱基。在一些实施方案中，酶可裂解的核碱基包括切割位点。在一些实施方案中，可裂解的核碱基易于通过与糖基化酶和内切核酸酶或与核酸外切酶的反应来裂解。在一些实施方案中，裂解位点包括化学可裂解的接头。在一些实施方案中，化学可裂解的接头包括邻位二醇、二硫化物、硅烷、偶氮苯、光可裂解的基团或叠氮基。

在一些实施方案中，可检测标记物是荧光标记物。

在一些实施方案中，质量控制示踪剂包括(a)在其3’末端用荧光标记物加标签的可裂解的核苷酸序列，或(b)包含可裂解的核碱基的非反应性核苷酸序列，该可裂解的核碱基具有附接至其上的荧光标记物。在一些方面中，可裂解的核苷酸序列包括引物核苷酸序列。在一些方面中，具有质量控制示踪剂的阵列还包括接枝至各个所述多于一个离散孔中的凝胶材料的未标记的引物，其中引物包含引物核苷酸序列。这样的阵列预期用于本文描述的任何方法。

在一些实施方案中，质量控制示踪剂不包括引物核苷酸序列，并且阵列还包括单独的未标记的引物，该未标记的引物包括被接枝至各个所述多于一个离散孔中的凝胶材料的引物核苷酸序列。在一些实施方案中，质量控制示踪剂和未标记的引物(并且因此，引物核苷酸序列)以预定的比率存在于凝胶材料上。

本申请涉及确定接枝的引物核苷酸序列的密度和/或分布的方法，该方法包括：提供支持物，所述支持物包括多于一个离散孔，和位于各个所述多于一个离散孔中的凝胶材料，以及被接枝至各个所述多于一个离散孔中的凝胶材料的质量控制示踪剂和引物核苷酸序列；其中质量控制示踪剂包含(a)包含裂解位点的可裂解的核苷酸序列和(b)可检测标记物；以及检测来自可检测标记物的信号；至少部分地基于来自可检测标记物的信号来确定质量控制示踪剂的密度和/或分布；以及至少部分地基于所确定的质量控制示踪剂的密度和/或分布来确定接枝的引物核苷酸序列的密度和/或分布。在一些实施方案中，所述方法还包括将质量控制示踪剂接枝至凝胶材料。在一些方面中，质量控制示踪剂包括引物核苷酸序列。在其他方面中，质量控制示踪剂包括非反应性核苷酸序列(并且没有引物核苷酸序列)，并且在接枝质量控制示踪剂之前或同时并且在检测步骤之前，将引物核苷酸序列接枝至凝胶材料。在其他实施方案中，质量控制示踪剂包含引物核苷酸序列，使得质量控制示踪剂的接枝用于将示踪剂和引物核苷酸序列两者接枝至凝胶材料。在一些实施方案中，质量控制示踪剂和引物核苷酸序列以预定的比率被接枝至凝胶材料，并且确定引物核苷酸序列的密度和/或分布基于所检测的信号和预定的比率。在一些实施方案中，所述方法还包括通过裂解位点处的裂解反应从质量控制示踪剂去除可检测标记物。在一些情况下，去除通过酶促裂解或化学裂解来完成。在一些情况下，去除通过在裂解位点处与糖基化酶和内切核酸酶或与核酸外切酶的反应来完成。在其他情况下，去除通过将可裂解的核苷酸序列附接至可检测标记物的接头分子的化学反应来完成。

在本文公开的方法的实例中，质量控制示踪剂被接枝至支持物上的孔中的凝胶材料。例如，质量控制示踪剂使用荧光来检测，此时可检测标记物是荧光标记物，并且至少部分地基于所检测的信号或荧光，确定被接枝至凝胶材料的引物核苷酸序列的密度、或分布、或密度和分布。在一些方面中，所述方法包括将质量控制示踪剂接枝至支持物上的孔中的凝胶材料，使用荧光检测质量控制示踪剂，并且至少部分地基于荧光，确定被接枝至凝胶材料的引物核苷酸序列的密度、或分布、或密度和分布。在一些方面中，所述方法还包括在裂解位点处从质量控制示踪剂裂解可检测标记物。

在另一个方面中，本公开内容涉及将质量控制示踪剂和引物核苷酸序列共接枝至阵列的方法，该方法包括：将质量控制示踪剂和引物核苷酸序列以预定的比率组合以形成接枝混合物；将接枝混合物暴露于支持物上的孔中的凝胶材料；以及孵育接枝混合物和凝胶材料，从而将质量控制示踪剂和引物核苷酸序列共接枝至凝胶材料。在一些方面中，质量控制示踪剂是在其3’末端用荧光标记物加标签的可裂解的核苷酸序列，或具有被附接至可裂解的核碱基的荧光标记物的非反应性核苷酸序列。在一些方面中，所述方法还包括通过检测来自可检测标记物的信号来检测接枝的质量控制示踪剂；以及至少部分地基于所检测的信号和预定的比率，确定被接枝至凝胶材料的引物核苷酸序列的密度、或分布、或密度和分布。在一些方面中，接枝的质量控制示踪剂使用荧光来检测，并且至少部分地基于荧光和预定的比率，确定被接枝至凝胶材料的引物核苷酸序列的密度、或分布、或密度和分布。在另外的方面中，包括共接枝的凝胶材料的支持物然后用于如本文描述的确定接枝的引物核苷酸序列的密度和/或分布的方法中。在其他方面中，所述方法还包括经由如本文描述的在裂解位点处的酶促裂解或化学裂解从可裂解的核苷酸序列去除可检测标记物。

在另一个方面中，本公开内容涉及将质量控制示踪剂接枝至阵列的方法，该方法包括将质量控制示踪剂接枝至支持物上的孔中的凝胶材料，其中质量控制示踪剂包括包含裂解位点的可裂解的核苷酸序列和可检测标记物，其中可裂解的核苷酸序列包括具有第一末端和第二末端的接枝的区域，其中第一末端被接枝至凝胶材料，并且第二末端被连接至可裂解区域，该可裂解区域被连接至可检测标记物并且包括裂解位点。在一些方面中，质量控制示踪剂包括在接枝的区域中，即在质量控制示踪剂接枝的区域的接枝的第一末端和裂解位点之间的引物核苷酸序列。利用这种布置，在裂解位点处的裂解留下了被接枝至凝胶材料的未标记的引物序列。在一些方面中，所述方法还包括根据本文描述的裂解方法在裂解位点处裂解质量控制示踪剂，从而提供缺乏接枝至凝胶材料的可检测标记物的引物序列。

在另一个方面中，本发明涉及接枝混合物，该接枝混合物包含含有引物核苷酸序列的引物和质量控制示踪剂，其中引物和质量控制示踪剂以预定的比率存在于混合物中。

附图简述

通过参考以下详细描述和附图，本公开内容的实例的特征和优点将变得明显，其中相似的附图标记(referencenumberal)对应于类似的尽管可能不相同的组分。为了简洁起见，具有之前描述的功能的附图标记或特征可以结合或可以不结合其中它们出现的其他附图来描述。

图1是根据本公开内容的示例性阵列的图解表示，图示出了阵列的总体布局并且详细描述了各个位点的布置；

图2a至图2d是一起图示出用于形成阵列的方法的实例的横截面图；

图3a至图3d是本文公开的质量控制示踪剂的不同实例的示意图；

图4描绘了包括接头分子的质量控制示踪剂的若干个实例，以及可以用于裂解接头分子的化学物质的实例；

图5是描绘质量控制方法的实例的流程图；

图6a和图6b分别是用引物接枝并且与互补的含染料的寡核苷酸(tetqc)杂交的对照流动池的荧光图像，和用本文公开的质量控制示踪剂的实例接枝的流动池的荧光图像；

图6c是描绘图5a和图5b的接枝的表面的质量控制示踪剂荧光对tet荧光的图；

图7a和图7b分别图示出了用本文公开的质量控制示踪剂的实例接枝的流动池的初始荧光图像(在簇产生之前)和聚簇后荧光图像(在簇产生之后)；

图8a和图8b分别示出了图7a和图7b的接枝的流动池的接枝后质量控制示踪剂荧光的图和聚簇后质量控制示踪剂荧光的图；

图9a和图9b分别示出了使用图7a和图7b的接枝的流动池在一个测序循环(c1)之后红色通道的读段1(r1)荧光强度的图和读段2(r2)荧光强度的图；

图10a和图10b分别示出了使用图7a和图7b的接枝的流动池在一个测序循环(c1)之后绿色通道的读段1(r1)荧光强度的图和读段2(r2)荧光强度的图；

图11a和图11b分别示出了对于图7a和图7b的接枝的流动池，相对于参考基因组的读段1(r1)序列比对的图和读段2(r2)序列比对的图；以及

图12a和图12b分别示出了图7a和图7b的接枝的流动池的读段1(r1)测序错误率的图和读段2(r2)测序错误率的图。

详细描述

应理解，除非另外说明，否则本文使用的术语将采用它们在相关领域中的普通含义。下文阐述了本文使用的若干个术语和它们的含义。

除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”、和“该(the)”包括复数指示物。

如本文使用的，“烷基”指的是完全饱和(即，不包含双键或三键)的直链或支链的烃链。烷基基团可以具有1个至20个碳原子。示例性烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基及类似基团。作为实例，名称“c1-4烷基”指示在烷基链中存在一个至四个碳原子，即，该烷基链选自由以下组成的组：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。

烷基可以被卤化物或卤素取代，卤素意指元素周期表的第7列的放射稳定性原子中的任一个，例如，氟、氯、溴或碘。该基团被称为“烷基卤化物”。

如本文使用的，“烯基”或“烯烃”指的是包含一个或更多个双键的直链或支链的烃链。烯基基团可以具有2个至20个碳原子。示例性烯基基团包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基及类似基团。烯基基团可以被指定为例如“c2-4烯基”，其指示在烯基链中存在两个至四个碳原子。

如本文使用的，“炔基”或“炔烃”指的是包含一个或更多个三键的直链或支链的烃链。炔烃基团可以具有2个至20个碳原子。炔烃基团可以被指定为例如“c2-4炔基”，其指示在炔烃链中存在两个至四个碳原子。

“酰氨基”官能团指的是其中r是可以附接至荧光标记物的任何基团，r’是h，并且r”是可以附接至核苷酸序列的任何基团。

“氨基”官能团指的是-nrarb基团，其中ra和rb各自独立地选自氢、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-7碳环基、c6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文定义的。

如本文使用的，“芳基”指的是在环骨架中仅包含碳的芳香族环或芳香族环体系(即，共享两个相邻的碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基是环体系时，该体系中的每一个环是芳香族的。芳基基团可以具有6个至18个碳原子，其可以被指定为c6-18。芳基基团的实例包括苯基、萘基、薁基和蒽基。

“叠氮化物”或“叠氮基”官能团指的是-n3。

如本文使用的，术语“附接”指的是两个事物彼此接合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，核酸可以通过共价键或非共价键附接至诸如凝胶材料的材料。共价键的特征在于共享原子之间的电子对。非共价键是不涉及电子对的共享的化学键，并且可以包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。

如本文使用的，“碳环基”意指。当碳环基是环体系时，两个或更多个环可以以稠合的、桥接的或螺连接的方式接合在一起。碳环基可以具有任何饱和度，条件是在环体系中的至少一个环不是芳香族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基基团可以具有3个至20个碳原子(即，c3-20)。

如本文使用的，“环烯基”或“环烯烃”意指具有至少一个双键的碳环基环或碳环基环体系，其中环体系中没有环是芳香族的。实例包括环己烯基或环己烯和降冰片烯或降冰片基也如本文使用的，“杂环烯基”或“杂环烯烃”意指具有至少一个双键的、在环骨架中具有至少一个杂原子的碳环基环或碳环基环体系，其中环体系中没有环是芳香族的。

如本文使用的，“环炔基”或“环炔烃”意指具有至少一个三键的碳环基环或碳环基环体系，其中环体系中没有环是芳香族的。实例是环辛炔另一个实例是双环壬炔(即，双环环体系，诸如)。也如本文使用的，“杂环炔基”或“杂环炔烃”意指具有至少一个三键的、在环骨架中具有至少一个杂原子的碳环基环或碳环基环体系，其中环体系中没有环是芳香族的。

如本文使用的术语“化学裂解”指的是从支持物去除质量控制示踪剂或其部分的化学反应。

如本文使用的，术语“可裂解的核苷酸序列”指的是可以在切割位点或接头分子处断裂的单链核酸序列。

当提及物品的集合使用时，术语“各个(each)”旨在识别集合中的单个项目，但不一定指的是集合中的每个(every)项目。如果明确的公开内容或上下文另外清楚地指出，则可能发生例外。

如本文使用的，术语“酶促裂解”指的是利用内切核酸酶或核酸外切酶以从支持物去除质量控制示踪剂或其部分的过程。

如本文使用的术语“切割位点”指的是被酶靶向的核苷酸或核苷酸的碱基(即，核碱基)。质量控制示踪剂或其部分可以在切割位点处裂解。这样的裂解可以涉及单个酶促步骤或多个酶促步骤(例如，碱基修饰或切割后裂解)。

如本文使用的术语“荧光标记物”指的是化学附接至核苷酸序列的荧光团。荧光标记物可以被附接至核苷酸序列的3’末端、被附接至非反应性核苷酸序列的可裂解的核碱基、或被附接至与核苷酸序列附接的接头分子。

如本文使用的，术语“凝胶材料”旨在意指对液体和气体可渗透的半刚性材料。通常，凝胶材料是水凝胶，该水凝胶当液体被吸收时可以膨胀，并且当液体通过干燥被去除时可以收缩。

如本文使用的，术语“接枝”旨在意指共价结合，以及不仅仅经由非共价相互作用诸如杂交来附接。在一些情况下，质量控制示踪剂、可裂解的核苷酸序列、非反应性核苷酸序列和/或引物或引物核苷酸序列通过示踪剂或序列上的官能团与凝胶材料中的官能团之间形成共价键来接枝至凝胶材料。如本文使用的，术语“共接枝”指的是多于一个实体的接枝。

如本文使用的，“杂芳基”指的是在环骨架中包含一个或更多个杂原子(即，不同于碳的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳香族环或芳香族环体系(即，共享两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环体系时，该体系中的每个环是芳香族的。杂芳基基团可以具有5个-18个环成员。

如本文使用的，“杂环基”意指在环骨架中包含至少一个杂原子的非芳香族环或非芳香族环体系。杂环基可以以稠合的、桥接的或螺连接的方式接合在一起。杂环基可以具有任何饱和度，条件是在环体系中的至少一个环不是芳香族的。在环体系中，杂原子可以存在于非芳香族环或芳香族环中。杂环基基团可以具有3个至20个环成员(即，构成环骨架的原子的数量，包括碳原子和杂原子)。杂环基基团可以被指定为“3-6元杂环基”或类似的指定。在一些实例中，杂原子是o、n或s。

如本文使用的术语“肼”或“肼基”指的是-nhnh2基团。

如本文使用的术语“腙”或“腙基”指的是基团ra(rb)c＝n-nh2，其中ra和rb之前在本文中被定义。

如本文使用的，“羟基”是–oh基团。

如本文使用的，术语“间隙区域”指的是基底/支持物中的或表面上的区域，该区域分离基底或表面的其他区域。例如，间隙区域可以将阵列的一个特征与阵列的另一个特征分离。彼此分离的两个特征可以是离散的，即，缺乏彼此接触。在另一个实例中，间隙区域可以将特征的第一部分与特征的第二部分分离。在许多实例中，间隙区域是连续的，而特征是离散的，例如，如对于在其他连续表面中限定的多于一个孔的情况。由间隙区域提供的分离可以是部分的或完全的分离。间隙区域可以具有与在表面中限定的特征的表面材料不同的表面材料。例如，阵列的特征可以具有超过存在于间隙区域的量或浓度的凝胶材料和质量控制示踪剂的量或浓度。在一些实例中，凝胶材料和质量控制示踪剂可以不存在于间隙区域。

如本文使用的术语“接头分子”指的是一种分子，该分子包括在一个末端处的可以附接至可检测标记物或荧光标记物的官能团和在另一个末端处的可以附接至核苷酸序列的官能团。附接点是共价键。类似地，如本文使用的术语“连接”指的是经由一个或更多个共价键直接地连接或经由接头分子连接的两个实体。

如本文使用的“腈氧化物”意指“rac≡n⁺o^-”基团，其中ra选自氢、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-7碳环基、c6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。制备腈氧化物的实例包括通过用氯酰胺-t处理或通过碱对亚胺酰氯[rc(cl)＝noh]的作用从醛肟原位生成。

如本文使用的“硝酮”意指“rarbc＝nrc⁺o^-”基团，其中ra和rb之前在本文中被定义，并且rc选自如本文定义的c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-7碳环基、c6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。

如本文使用的，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或更多个磷酸酯基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。在rna中，糖是核糖，并且在dna中糖是脱氧核糖，即缺乏存在于核糖中的2’位的羟基基团的糖。含氮杂环碱基(即，核碱基)可以是嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)及其修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)及其修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的c-1原子结合至嘧啶的n-1或嘌呤的n-9。

本文提及的“非反应性核苷酸序列”可以是不积极参与正在进行的特定的dna或rna合成的任何核酸序列。在一些实例中，非反应性核苷酸序列可以构成质量控制示踪剂的一部分。例如，非反应性核苷酸序列可以是聚t序列或聚a序列，其是也包括切割位点的可裂解的核苷酸序列的一部分。对于另一个实例，非反应性核苷酸序列可以与所使用的引物核苷酸序列正交，并且因此非反应性核苷酸序列将不参与利用引物核苷酸序列的dna或rna合成。

如本文使用的，“预定的比率”指的是混合物中的两种化合物之间的比率。该比率在制备混合物之前被确定。该比率是混合物中的组分的浓度或摩尔浓度的比率，或是共混制备混合物的两种组分的溶液的体积的比率。在一些方面中，“预定的比率”指的是凝胶材料上的示踪剂和引物的比率，并且在这样的情况下，比率基于与凝胶材料反应的组分的比率，并且任选地考虑两种组分的任何不同的反应性。在一些方面中，示踪剂和引物的混合物的预定的比率被设定为引物(或引物混合物，其中使用多于一个引物序列)的体积百分比。

如本文使用的，“引物核苷酸序列”被定义为用作dna或rna合成的起点的单链核酸序列(例如，单链dna或单链rna)。测序引物的5’末端可以被修饰以允许与凝胶材料的偶联反应。测序引物长度可以是任何数目的碱基长的，并且可以包括多种非天然的核苷酸。在实例中，测序引物是包含20个碱基至50个碱基的短链。

如本文使用的术语“未加标签的”意指核苷酸序列不具有附接至其的荧光标记物。

“质量控制示踪剂”包括核苷酸序列和附接至核苷酸序列的荧光标记物。质量控制示踪剂的荧光标记物能够在质量控制方法中被检测到。质量控制示踪剂的荧光标记物也能够被去除，并且示踪剂的剩余部分能够参与测序方法，或在测序方法期间是非反应性的。

如本文使用的，“位点”指的是凝胶材料和质量控制示踪剂可以附接的、在支持物上或在支持物中限定的位置。

术语“基底”和“支持物”在本文中可互换使用，并且指的是位点所位于的表面。支持物通常是刚性的，并且不溶于水性液体。支持物对用于修饰凝胶材料的化学物质可以是惰性的。例如，在本文阐述的方法中，支持物对用于将质量控制示踪剂附接至凝胶材料的化学物质可以是惰性的。合适的支持物的实例包括玻璃和改性的或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如来自chemours的)、环烯烃/环烯烃聚合物(cop)(诸如来自zeon的)、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅氧烷、硅和改性的硅、碳、金属、无机玻璃和光学纤维束。

“硫醇”官能团指的是-sh(例如，)。

如本文使用的，术语“四嗪”和“四嗪基”指的是包含四个氮原子的六元杂芳基基团。四嗪可以任选地被取代。

如本文使用的“四唑”指的是包含四个氮原子的五元杂环基团。四唑可以任选地被取代。

如本文使用的，术语“孔”指的是支持物中的离散凹形特征，其具有完全被支持物表面的间隙区域包围的表面开口。孔可以在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，作为实例包括圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数目的顶点)等。与表面正交地截取的孔的横截面可以是弯曲的、正方形的、多边形的、双曲线的、锥形的、角形的(angular)等。

在一些实施方案中，可裂解的核苷酸序列经由酶促裂解或化学裂解是可裂解的。

在一些情况下，可裂解的核苷酸序列包括附接荧光标记物的接头分子，其中接头分子包含经由酶促裂解或化学裂解可裂解的部分。在一些实施方案中，接头分子包括邻位二醇，并且化学裂解通过氧化条件诸如例如高碘酸钠(naio4)来完成。在其他实施方案中，接头分子包括二硫化物，并且化学裂解用硫醇或叔膦来完成；或者接头分子是硅烷，并且化学裂解用酸或氟离子来完成；或者接头分子是偶氮苯，并且化学裂解用连二亚硫酸钠(na2s2o4)来完成；或者接头分子是光可裂解的基团，并且化学裂解用光来完成；或者接头分子是叠氮基，并且化学裂解用叔膦来完成。在第二方面的另一个实例中，所述方法还包括使用核酸外切酶从非反应性核苷酸序列的可裂解的核碱基裂解荧光标记物。

在该方面的一个实例中，质量控制示踪剂包括可裂解的核苷酸序列，并且可裂解的核苷酸序列包含切割位点。在实例中，可裂解的核苷酸序列是引物核苷酸序列。

在该方面的另一个实例中，质量控制示踪剂是可裂解的核苷酸序列，并且可裂解的核苷酸序列包括附接荧光标记物的接头分子。在一些实施方案中，接头分子包括选自由以下组成的组的官能团：二醇、二硫化物、硅烷、偶氮苯、光可裂解的基团和叠氮基。在该方面的该其他实例中，可裂解的核苷酸序列还包括附接至接头分子的引物核苷酸序列。

在该方面的仍然另一个实例中，质量控制示踪剂是非反应性核苷酸序列，并且非反应性核苷酸序列还包含切割位点。

阵列的该方面还可以包括接枝至各个所述多于一个离散孔中的凝胶材料的未加标签的引物核苷酸序列，其中质量控制示踪剂和未加标签的引物核苷酸序列以预定的比率存在。

应理解，阵列的该方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。

在所述方法的第一方面的实例中，质量控制示踪剂是可裂解的核苷酸序列，并且可裂解的核苷酸序列是引物核苷酸序列。在该实例中，所述方法还可以包括在确定引物核苷酸序列的密度、或分布、或密度和分布之后，从引物核苷酸序列裂解荧光标记物。

在所述方法的第一方面的另一个实例中，质量控制示踪剂是可裂解的核苷酸序列；在检测之前，引物核苷酸序列未加标签；所述方法还包括将引物核苷酸序列接枝至凝胶材料；可裂解的核苷酸序列和引物核苷酸序列以预定的比率存在；并且确定引物核苷酸序列的密度、或分布、或密度和分布基于荧光和预定的比率。所述方法的第一方面的该其他实例还可以包括从可裂解的核苷酸序列裂解荧光标记物。裂解经由酶促裂解和/或化学裂解来完成。

在所述方法的第一方面的仍然另一个实例中，质量控制示踪剂是非反应性核苷酸序列；引物核苷酸序列未加标签；在检测之前，所述方法还包括将引物核苷酸序列接枝至凝胶材料，其中非反应性核苷酸序列和引物核苷酸序列以预定的比率存在；并且确定引物核苷酸序列的密度、或分布、或密度和分布基于荧光和预定的比率。所述方法的第一方面的仍然其他实例还可以包括使用核酸外切酶从非反应性核苷酸序列的可裂解的核碱基裂解荧光标记物。

应理解，所述方法的第一方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应理解，所述方法的第一方面和/或阵列的特征的任何组合可以一起使用，和/或来自这些方面的任一方面或两者的任何特征可以与本文公开的任何实例组合。

在第二方面的一个实例中，所述方法还包括经由酶促裂解或化学裂解从可裂解的核苷酸序列裂解荧光标记物。在第二方面的该一个实例的一些情况中，质量控制示踪剂是可裂解的核苷酸序列，可裂解的核苷酸序列包括附接荧光标记物的接头分子，以及以下中的一项：接头分子包括二醇，并且化学裂解用高碘酸钠(naio4)来完成；或者接头分子包括二硫化物，并且化学裂解用硫醇或叔膦来完成；或者接头分子是硅烷，并且化学裂解用酸或氟离子来完成；或者接头分子是偶氮苯，并且化学裂解用连二亚硫酸钠(na2s2o4)来完成；或者接头分子是光可裂解的基团，并且化学裂解用光来完成；或者接头分子是叠氮基，并且化学裂解用叔膦来完成。

在第二方面的另一个实例中，所述方法还包括使用核酸外切酶从非反应性核苷酸序列的可裂解的核碱基裂解荧光标记物。

应理解，所述方法的该第二方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应理解，第一方面和/或第二方面的特征的任何组合可以一起使用，和/或来自这些方面的任一方面或两者的任何特征可以与阵列的任何特征和/或本文公开的任何实例组合。

本文公开的阵列的实例包括若干个位点，这些位点各自具有附接至凝胶材料的质量控制示踪剂的实例。质量控制示踪剂包括引物核苷酸序列或与引物核苷酸序列以预定的比率存在，并且因此可以在质量控制方法中用于确定引物核苷酸序列的密度和/或分布。质量控制示踪剂包括荧光标记物，该荧光标记物可以用于质量控制方法并且可以从示踪剂裂解，使得荧光标记物不干扰测序。在一些情况下，包括质量控制示踪剂减少了为了质量控制目的进行杂交和去杂交的需要。本文公开的实例能够评估支持物上的引物核苷酸序列的密度和/或分布，而不必加载测序试剂和样品并且不必在测序工作流程中进行初始步骤。

鉴于上文的定义，本文阐述的以及在权利要求中引述的方面和实例能够被理解。

现在参考图1，描绘了阵列10的实例。通常，阵列10包括基底或支持物12以及跨越支持物12的线或流动通道14。各个流动通道14包括多个(mutiple)位点16，这些位点16通过间隙区域18彼此分离。在各个位点16处，至少质量控制示踪剂22被附接至凝胶材料(例如，在图2d中的24、24’)。在一些情况下，除了质量控制示踪剂22之外，单独的引物核苷酸序列20、20’也被附接至凝胶材料24。

在图1中图示出的和本公开内容中讨论的阵列10可以设置在流动池中或形成为流动池的一部分，流动池是包括固体表面的室，各种载体流体、试剂等可以流过该固体表面。在一个实例中，流动池可以包括通过密封材料(例如，黑色聚酰亚胺或另一种合适的结合材料)结合至顶部基底的阵列10。结合发生在支持物12、密封材料和顶部基底的结合区域中。结合区域可以位于流动通道之间，使得密封材料将一条流动通道14与相邻的流动通道14物理地分离(以防止交叉污染)，并且可以位于流动池的外围(以密封流动池免受外部污染)。然而，应理解，取决于实施方式，结合区域和密封材料可以位于任何期望的区域。结合可以经由激光结合、扩散结合、阳极结合、共晶结合、等离子体活化结合、玻璃料结合或本领域已知的其他方法来完成。

可以与阵列10整合和/或在本公开内容的方法中容易使用的流动池和相关的流体系统和检测平台的其他实例在以下中被描述：例如，bentley等人，nature456:53-59(2008)，wo04/018497；美国专利第7,057,026号；wo91/06678；wo07/123744；美国专利第7,329,492号；美国专利第7,211,414号；第7,315,019号和第7,405,281号，以及美国专利公布第2008/0108082号，这些文献各自通过引用以其整体并入本文。

在一些应用中，流动池在反应自动化装置中诸如在核苷酸测序仪中用于进行受控的化学或生物化学反应。端口26可以钻穿支持物12。通过连接至端口26，反应自动化装置可以控制密封的流动通道14中的试剂和产品的流动。在一些应用中，反应自动化装置可以调节流动池的压力、温度、气体组成和其他环境条件。此外，在一些应用中，端口26可以钻入顶部基底中，或钻入支持物12和顶部基底两者中。在一些应用中，通过对热、光发射和/或荧光进行成像或测量，可以通过顶部基底和/或支持物12监测在密封的流动通道14中发生的反应。

应理解，流动通道14、位点16等的特定取向可以不同于图1中图示出的那些。在一些实例中，位点16是连续的，并且因此不需要由间隙区域18分离。

图1的阵列10以及可以如何制造阵列10的实例现在将参考图2a至2d更详细地描述。

图2a描绘了支持物12，该支持物12具有限定在其中并且由间隙区域18分离的位点16。该支持物12具有图案化表面。“图案化表面”指的是不同的区域(即，位点16)在固体支持物12的暴露的层中或暴露的层上的布置。例如，位点16中的一个或更多个可以是其中存在一个或更多个质量控制示踪剂22，并且在一些情况下，单独的引物核苷酸序列22的特征。特征可以由间隙区域18分离，在该间隙区域18中不存在质量控制示踪剂22和单独的引物核苷酸序列20。可以设想位点16的许多不同的布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在一个实例中，位点16被设置成六边形栅格用于紧密填充和改善的密度。其他布局可以包括例如直线(即，矩形)布局、三角形布局等等。作为实例，布局或图案可以是呈行和列的x-y格式的位点16。在一些其他实例中，布局或图案可以是位点16和/或间隙区域18的重复布置。在仍然其他实例中，布局或图案可以是位点16和/或间隙区域18的随机布置。图案可以包括斑点、垫、孔、柱、条带、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、棋盘格、方格、对角线、箭头、正方形和/或交叉影线。可以用于本文阐述的实例的图案化表面的仍然其他实例在美国专利第8,778,849号；第9,079,148号和第8,778,848号，以及美国专利公布第2014/0243224号中描述，这些文献各自通过引用以其整体并入本文。

布局或图案可以在所限定的区域中的位点16的密度(即，位点16的数目)方面表征。例如，位点16可以以每mm²约200万的密度存在。密度可以被调节至不同的密度，包括例如至少每mm²约100、每mm²约1,000、每mm²约10万、每mm²约100万、每mm²约200万、每mm²约500万、每mm²约1000万、每mm²约5000万或更大的密度。可选择地或另外地，密度可以被调节为不大于每mm²约5000万、每mm²约1000万、每mm²约500万、每mm²约200万、每mm²约100万、每mm²约10万、每mm²约1,000、每mm²约100或更小。还应理解，支持物12上的位点16的密度可以在选自上文的范围的一个较低值和一个较高值之间。作为实例，高密度阵列可以被表征为具有被分隔开小于约100nm的位点16，中等密度阵列可以被表征为具有被分隔开约400nm至约1μm的位点16，并且低密度阵列可以被表征为具有被分隔开大于约1μm的位点16。

布局或图案也可以或可选择地根据平均间距(pitch)，即从位点16的中心到相邻间隙区域18的中心的间隔(中心到中心的间隔)来表征。图案可以是规则的，使得围绕平均间距的变异系数小，或者图案可以是非规则的，在这种情况下，变异系数可以是相对大的。在任一情况下，平均间距可以是例如至少约10nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大。可选择地或另外地，平均间距可以是例如至多约100μm、约10μm、约5μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm或更小。位点16的特定图案的平均间距可以在选自上文的范围的一个较低值和一个较高值之间。在实例中，位点16具有约1.5μm的间距(中心到中心的间隔)。

在一些实例中，位点16是孔16’，并且因此支持物12包括在其表面中的孔16’的阵列。孔16’(或具有不同的配置诸如形状、横截面等的其他位点16)可以使用多种技术来制造，包括例如光刻术、纳米压印光刻术、冲压技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术、印刷技术等。如本领域技术人员将理解的，使用的技术将取决于支持物12的组成和形状。

孔16’可以是微孔(具有至少一个微米尺度的尺寸，例如，约1μm至约1000μm)或纳米孔(具有至少一个纳米尺度的尺寸，例如，约1nm至约1000nm)。各个孔16’可以通过其体积、孔开口面积、深度和/或直径来表征。

各个孔16’可以具有能够限制液体的任何体积。最小体积或最大体积可以被选择，例如以适应对阵列10的下游使用所预期的吞吐量(例如，多重性)、分辨率、分析物组成或分析物反应性。例如，体积可以是至少约1×10^-3μm³、约1×10^-2μm³、约0.1μm³、约1μm³、约10μm³、约100μm³或更大。可选择地或另外地，体积可以是至多约1×10⁴μm³、约1×10³μm³、约100μm³、约10μm³、约1μm³、约0.1μm³或更小。应理解，凝胶材料24可以填充孔16’的全部或部分体积。在单独的孔16’中的凝胶材料24的体积可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。

可以基于与上文关于孔体积阐述的标准类似的标准来选择由表面上的各个孔开口占据的面积。例如，用于表面上的各个孔开口的面积可以是至少约1×10^-3μm²、约1×10^-2μm²、约0.1μm²、约1μm²、约10μm²、约100μm²或更大。可选择地或另外地，面积可以是至多约1×10³μm²、约100μm²、约10μm²、约1μm²、约0.1μm²、约1×10^-2μm²或更小。

各个孔16’的深度可以是至少约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。可选择地或另外地，深度可以是至多约1×10³μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.1μm或更小。

在一些情况下，各个孔16’的直径可以是至少约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。可选择地或另外地，直径可以是至多约1×10³μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm、约50nm或更小。

在形成的阵列10中，凝胶材料24位于各个离散孔16’中。将凝胶材料24定位在各个孔16’中可以通过以下来完成：首先用凝胶材料24涂覆支持物12的图案化表面，如图2b所示，并且然后例如经由化学或机械抛光至少从结构化支持物12的表面上孔16’之间的间隙区域18去除凝胶材料24。这些过程将凝胶材料24的至少一些保持在孔16’中，但从结构化支持物12的表面上孔16’之间的间隙区域18去除至少大体上所有凝胶材料24或使至少大体上所有凝胶材料24失活。照此，这些过程产生了用于测序的凝胶垫24’(图2d)，凝胶垫24’经具有大量循环的测序运行可以是稳定的。

特别有用的凝胶材料24将符合其所在的位点16的形状。一些有用的凝胶材料24既可以(a)符合其所在的位点16(例如，孔16’或其他凹形特征)的形状，并且(b)具有至少大体上不超过其所在的位点16的体积的体积。

合适的凝胶材料24的一个实例包括由式(i)表示的聚合物：

其中：

r¹是h或任选地被取代的烷基；

r^a选自由以下组成的组：叠氮基、任选地被取代的氨基、任选地被取代的烯基、任选地被取代的腙、任选地被取代的肼、羧基、羟基、任选地被取代的四唑、任选地被取代的四嗪、腈氧化物、硝酮和硫醇；r⁵选自由以下组成的组：h和任选地被取代的烷基；

各个-(ch2)p-可以任选地被取代；

p是在1至50的范围内的整数；

n是在1至50,000的范围内的整数；并且

m是在1至100,000的范围内的整数。

在式(i)的结构中，本领域普通技术人员将理解，“n”和“m”亚基是以随机顺序存在于整个聚合物中的重复亚基。普通技术人员还将认识到，其他单体组分可以存在于聚合物中。

凝胶材料24的特定实例是聚(n-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺(“pazam”)(例如，在美国专利公布第2014/0079923a1号和第2015/0005447a1号中描述的，这些专利各自通过引用以其整体并入本文)，其包括下文示出的结构：

其中n是在1-20,000的范围内的整数，并且m是在1-100,000的范围内的整数。如同式(i)，本领域普通技术人员将认识到，“n”和“m”亚基是以随机顺序存在于整个聚合物结构中的重复单元。

pazam的分子量可以在约10kda至约1500kda的范围内，或者在具体的实例中，可以是约312kda。

在一些实例中，pazam是线性聚合物。在一些其他实施方案中，pazam是轻度交联的聚合物。在其他实例中，pazam包括分支。

合适的凝胶材料24的其他实例包括具有以下结构的那些：胶体结构，诸如琼脂糖；或聚合物网状结构，诸如明胶；或交联的聚合物结构，诸如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、无硅烷丙烯酰胺(sfa，参见，例如，美国专利公布第2011/0059865号，其通过引用以其整体并入本文)或叠氮化形式的sfa。合适的聚丙烯酰胺聚合物的实例可以由丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基基团的丙烯酸形成，如例如在wo2000/031148(通过引用以其整体并入本文)中描述的，或者由形成[2+2]光环加成反应的单体形成，例如在wo2001/001143或wo2003/0014392(其各自通过引用以其整体并入本文)中描述的。

凝胶材料24可以是预形成的凝胶材料。预形成的凝胶材料可以使用旋涂、或浸渍、或在正压或负压下凝胶的流动、或在美国专利第9,012,022号中阐述的技术来涂覆，该专利通过引用以其整体并入本文。浸渍或浸涂可以是选择性沉积技术，这取决于所使用的支持物12和凝胶材料24。作为实例，将图案化支持物12浸入预形成的凝胶材料24中，并且凝胶材料24可以选择性地填充位点16(即，凝胶材料24不沉积在间隙区域18上)，并且抛光(或另一种去除过程)可以不是必需的。

预形成的pazam可以使用旋涂、或浸渍、或在正压或负压下凝胶的流动、或在美国专利第9,012,022号中阐述的技术来涂覆在图案化支持物12上。pazam的附接还可以通过化学反应形成共价键，或经由表面引发的原子转移自由基聚合(si-atrp)至硅烷化表面来发生。

在一些实例中，支持物表面用烯烃衍生的硅烷处理，其中烯烃部分可以是直链的、支链的或环状的。在一些实例中，硅烷试剂是(ro)3si-接头-烯烃，并且在其他实例中，硅烷试剂是(ro)3si-c2-6亚烷基-环烯烃，并且在其他实例中，硅烷试剂是(ro)3si-ch2ch2-降冰片烯，其中各个r是c1-4烷基或是甲基或乙基。凝胶材料24，诸如pazam，在热或uv条件下共价结合至烯烃衍生的硅烷。

在其他实例中，支持物12表面可以用氨基衍生的硅烷预处理以将硅共价连接至表面上的一个或更多个氧原子(不旨在通过机制保持，各个硅可以结合至一个、两个或三个氧原子)，所述氨基衍生的硅烷诸如氨基丙基-三烷氧基硅烷(apts)，例如3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(aptms)或3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(aptes)。该化学处理的表面被烘烤以形成胺基团单层。胺基团然后与磺基-hsab反应以形成叠氮基衍生物。在21℃用1j/cm²至30j/cm²的能量的uv活化产生了活性氮宾物质，该活性氮宾物质可以容易地与pazam进行多种插入反应。

用于将pazam涂覆在支持物12上的其他实例在美国专利公布第2014/0200158号(该专利通过引用以其整体并入本文)中描述，并且包括紫外(uv)介导的pazam单体与胺官能化的表面的连接，或涉及活性基团(丙烯酰氯或其他含烯烃或炔烃的分子)的热连接反应，随后沉积pazam并施加热。

凝胶材料24可以通过施加随后形成凝胶材料24的液体来形成。施加随后形成凝胶材料24的液体的实例是，用呈液体形式的无硅烷丙烯酰胺和n-[5-(2-溴乙酰基)氨基戊基]丙烯酰胺(brapa)涂覆位点16的阵列，并且允许试剂通过在表面上聚合以形成凝胶。以该方式涂覆阵列可以使用如美国专利公布第2011/0059865号中阐述的化学试剂和程序。

凝胶材料24可以共价连接至支持物12(在位点16处)，或可以不共价连接至支持物12。聚合物与位点16的共价连接有助于在多种用途期间在阵列10的整个寿命中将凝胶保持在结构化位点16中。然而，如上文提及的并且在许多实例中，凝胶材料24不需要共价连接至位点16。例如，无硅烷丙烯酰胺sfa未共价附接至支持物12的任何部分。

如上文提及的，图2c图示出了凝胶材料24从间隙区域18的去除。去除可以经由抛光来完成。抛光可以是机械处理过程和/或化学处理过程。

机械抛光可以通过向固体支持物12的表面(其上具有凝胶材料24)施加磨蚀力来进行。示例性方法包括用珠的浆料磨蚀、用片材或布擦拭、刮擦等等。将理解，用于抛光的珠可以是球形的或可以不是球形的，并且可以具有不规则形状、多边形形状、卵形形状、细长形状、圆柱形状等。珠的表面可以是光滑的或粗糙的。多种颗粒中的任一种可以用作用于抛光的珠。抛光的一个实例包括使用涂覆有3μm二氧化硅珠浆料(在水中10％w/v)的无绒(洁净室级)擦拭物从间隙区域18去除凝胶材料24。抛光轮/研磨机还可以与该浆料一起使用。机械抛光还可以使用流体喷射或气体(例如，空气或惰性气体诸如氩气或氮气)喷射以从间隙区域18去除凝胶来实现。

可以使用化学抛光技术，诸如丙烯酰胺的水解或基于自由基的降解(例如经由暴露于过氧化苯甲酰或稀释的过氧化氢)。在该形式的抛光期间，化学物质可以以固态、液态、气态或等离子态提供。因此，在一些实例中，等离子体抛光可以是有用的。

抛光还可以涉及化学抛光方法和机械抛光方法的组合，其中使用包含颗粒的胶体悬浮液的化学浆料以从间隙区域18机械剥离并且然后化学溶解凝胶材料24的移位部分。

抛光或清洁间隙区域18的其他方法包括基于粘合剂的技术，例如，其中施加对凝胶材料24具有亲和力的刚性的平面的粘合剂膜，从而与间隙区域18中的凝胶材料24形成紧密接触(例如，经由化学连接(linkage))的技术。该粘合剂膜的机械除去/剥离将导致凝胶材料24从间隙区域18机械去除，同时将凝胶材料24留在位点16。

在一个实例中，硫代磷酸酯接枝的sfa可以按照以下从支持物12表面上的间隙区域18去除：将水润湿的whatman擦拭物可以轻擦至氧化铝(～100mg，0.3um)或钢珠内，并且然后可以将形成的浆料使用均匀的压力以小同心圆擦拭在支持物(其上具有硫代磷酸酯接枝的sfa)的表面上，并且然后可以使用洁净的水润湿的whatman擦拭物来从表面上去除浆料和硫代磷酸酯接枝的sfa。

本文例示的用于从间隙区域18去除凝胶材料24的机械抛光方法和化学抛光方法还可以用于使间隙区域18处的凝胶材料失活，无论凝胶材料24是否被去除。例如，凝胶材料24可以在附接质量控制示踪剂22和单独的引物核苷酸序列20、20’的能力方面失活。

在凝胶材料24被定位在各个孔16’中之后，质量控制示踪剂22以及在一些情况下的单独的引物核苷酸序列20、20’被接枝至凝胶材料24。所使用的附接技术以及是否包括单独的引物核苷酸序列20、20’将部分地取决于所利用的质量控制示踪剂22。质量控制示踪剂22的各种实例在图3a至图3d和图4中示出。现在将描述各实例。

图3a描绘了包括在具有单独的引物核苷酸序列20、20’的凝胶材料24/凝胶垫24’上的质量控制示踪剂22a的实例。在该实例中，质量控制示踪剂22a是在其3’末端用荧光标记物28加标签的可裂解的核苷酸序列27，并且引物核苷酸序列20、20’是未加标签的引物核苷酸序列。

图3a的可裂解的核苷酸序列27可以在其5’末端包括能够附接至凝胶材料24的官能团。该官能团的实例包括炔烃、降冰片基(或其他环烯基)、无铜点击部分(例如，二苯并环辛炔(dibo)、其他环炔烃或其他)和硫醇。该官能团可以基于所使用的凝胶材料24来选择。例如，炔烃、降冰片基和无铜点击部分可以经由点击反应与pazam的叠氮化物反应，并且硫醇可以与sfa反应。在一些实施方案中，官能团是炔烃。

图3a的可裂解的核苷酸序列27还可以在其3’末端包括能够附接至荧光标记物28的官能团。可以在寡核苷酸合成期间使用的该官能团的实例是5'-二甲氧基三苯甲基-5-[n-(三氟乙酰基氨基己基)-3-丙烯酰基亚氨基]-2'-脱氧尿苷、3'-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺(即，氨基修饰剂c6dt)。其他实例包括5'-二甲氧基三苯甲基-n-二甲基甲脒-5-[n-(三氟乙酰基氨基己基)-3-丙烯酰基亚氨基]-2'-脱氧胞苷、3'-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺(氨基修饰剂c6dc)并且使用固体支持物诸如(2-二甲氧基三苯甲基氧基甲基-6-芴基甲氧基羰基氨基-己烷-1-琥珀酰基)-长链烷基氨基-cpg。在3’末端处的官能团可以基于所使用的荧光标记物28来选择。

可检测标记物或荧光标记物28可以是可以例如在3’末端(或在3’末端处或附近)附接至可裂解的核苷酸序列27的任何合适的荧光团。合适的荧光标记物28的实例包括texas(磺酰氯染料，thermofisherscientific)，或磺基-花青7nhs酯(来自lumiprobe的花青染料)，红色波长染料，诸如tex^tm615(exiqon)，荧光染料，诸如alexa系列中的那些(thermofisherscientific)、atto染料(例如，atto488，其结构是：atto-tec系列，来自atto-tec)，fam^tm染料(荧光素的衍生物，integrateddnatechnologies)，呫吨荧光团，诸如cal染料(例如，来自lgcbiosearchtechnologies的calgold540、calorange460、calred590、calred610和calred635)，吲哚碳花青染料，诸如染料(例如，来自lgcbiosearchtechnologies的570、670和705)，或本领域普通技术人员已知的任何其他合适的荧光团。其他实例包括dylight^tm488(胺反应性染料)，或具有约518nm的最大发射波长的荧光团。在一些方面中，荧光标记物是呫吨荧光团。在一些方面中，呫吨荧光团具有在540nm至640nm、或540nm至570nm、或580nm至640nm的范围内的最大发射波长。在其他方面中，呫吨荧光团具有在585nm至640nm的范围内的最大发射波长。在其他方面中，呫吨荧光团在光谱的红色区域中发射。在其他方面中，呫吨荧光团具有约591nm、或610nm、或637nm的最大发射波长。其他合适的可检测标记物包括非荧光标记物，诸如等离子体纳米颗粒(splasmonicnanoparticle)(通过例如spr传感来检测)或量子点。在一些方面中，可检测标记物用氨基反应性基团诸如nhs来衍生，以允许与寡核苷酸序列偶联。

荧光标记物28可以使用任何合适的方法诸如模板导向连接、聚合酶介导的寡核苷酸延伸、化学合成等来附接至可裂解的核苷酸序列27。荧光标记物28的附接可以发生在核苷酸合成期间(例如，使用允许合成互补的荧光团标记的dna的突变体dna聚合酶，或在固相寡核苷酸合成期间使用荧光标记物修饰的单体)，或发生在核苷酸合成之后(例如，经由偶联化学将标记物28缀合至位于3’位的之前安装的官能团)。

可裂解的核苷酸序列27的该实例包括可裂解部分31和剩余部分29。可裂解部分31包括荧光标记物28(以及用于附接荧光标记物28的任何官能团)、任何核苷酸序列和切割位点30。照此，当可裂解的核苷酸序列27暴露于靶向位于切割位点30的核苷酸的酶时，序列27的可裂解部分31可以被去除。在酶促裂解之后仍附接至凝胶材料24的可裂解的核苷酸序列27的部分29是非反应性核苷酸序列，并且因此将不参与或干扰待进行或正在进行的测序操作。剩余部分可以是短的聚t序列或聚a序列，或者可以是与也附接至凝胶材料24的引物核苷酸序列20、20’正交的序列。

图3a中的质量控制示踪剂22a与单独的引物核苷酸序列20、20’组合使用(例如，在本文公开的质量控制方法的实例中)。合适的引物核苷酸序列20、20’的实例包括用于与互补序列杂交和扩增序列的正向扩增引物或反向扩增引物。合适的引物核苷酸序列20、20’的一些具体实例包括p5引物和/或p7引物。p5引物和p7引物在由illumina,inc.销售的商业流动池的表面上使用，以用于在genome和其他仪器平台上测序。p5引物和p7引物以及其他测序引物20、20’可以在5’末端处用能够与凝胶材料24的官能团反应的基团修饰。合适的官能团的一个实例是双环[6.1.0]壬-4-炔(bcn)，其可以与凝胶材料24的叠氮化物反应。封端的引物的其他实例包括四嗪封端的引物、降冰片烯封端的引物、炔烃封端的引物、氨基封端的引物、环氧基或缩水甘油基封端的引物、硫代磷酸酯封端的引物和三唑啉二酮封端的引物。可以是被炔烃封端的p5引物和p7引物的实例包括以下：

p5：5’-炔烃-aatgatacggcgaccaccgagauctacac-3’(seq.idno.1)

p7：5’-炔烃-caagcagaagacggcatacgag*at-3’(seq.idno.2)

及其衍生物。在一些实例中，p7序列包括在g*位的修饰的鸟嘌呤，例如，8-氧代-鸟嘌呤。在其他实例中，*指示g*和相邻的3’a之间的键是硫代磷酸酯键。在一些实例中，p5引物和/或p7引物包括非天然的接头。

任选地，p5引物和p7引物中的一个或两个可以包括聚t尾。聚t尾通常位于序列的5’末端(例如，在5’末端碱基和炔烃单元之间)，但在一些情况下可以位于3’末端。聚t序列可以包含任何数目的t核苷酸，例如，2个至20个。

虽然p5引物和p7引物被作为实例给出，但应理解，任何合适的扩增引物可以在本文呈现的实例中使用。本领域技术人员将理解如何设计和使用适合用于捕获和扩增如本文呈现的核酸的引物核苷酸序列20、20’。

质量控制示踪剂22a的实例与p5引物核苷酸序列和p7引物核苷酸序列20、20’正交。在一些方面中，质量控制示踪剂包括尿嘧啶切割位点。

在一些方面中，质量控制示踪剂包括以下序列中的一个：

(1)5’catctaggcatctaagcatcaaucttaca3’(seq.idno.3)

(2)5’acatacatacatacatacauacataca3’(seq.idno.4)

(3)5’attgattgattgattgatugattgat3’(seq.idno.5)

其中u是裂解位点。在一些方面中，u是尿嘧啶切割位点。

在一些方面中，质量控制示踪剂包括在序列的5’末端的聚t序列。在一些方面中，聚t区域包含2个至20个、或3个、4个、5个、6个或7个t核苷酸。在一些方面中，聚t区域包含4个、5个或6个t碱基。在其他方面中，聚t区域包含6个t核苷酸。在一些方面中，序列是：

(1)5’聚t-catctaggcatctaagcatcaaucttaca3’(seq.idno.6)或

(2)5’聚t-acatacatacatacatacauacataca3’(seq.idno.7)或

(3)5’聚t-attgattgattgattgatugattgat3’(seq.idno.8)。

在一些方面中，质量控制示踪剂包括texas作为荧光标记物。在一些方面中，质量控制示踪剂是：

5’-炔烃-catctaggcatctaagcatcaaucttaca[氨基c6dt-德克萨斯红]-3’(seq.idno.9)或

5’-炔烃-acatacatacatacatacauacataca[氨基c6dt-德克萨斯红]-3’(seq.idno.10)或

5’-炔烃-attgattgattgattgatugattgat[氨基c6dt-德克萨斯红]-3’(seq.idno.11)。

在一些方面中，这些示踪剂还包括炔烃和序列的剩余部分之间的聚t区域，如本文描述的。

在一些方面中，质量控制示踪剂是：

5’-炔烃-catctaggcatctaagcatcaaucttaca[氨基c6dt-呫吨荧光团]-3’(seq.idno.12)或

5’-炔烃-acatacatacatacatacauacataca[氨基c6dt-呫吨荧光团]-3’(seq.idno.13)或

5’-炔烃-attgattgattgattgatugattgat[氨基c6dt-呫吨荧光团]-3’(seq.idno.14)。

在一些方面中，这些示踪剂还包括在炔烃和序列的剩余部分之间的5’末端处的聚t区域，如本文描述的。

在一些方面中，质量控制示踪剂包括炔烃末端，并且在一些方面中，该炔烃末端是5’-己炔末端。合适的末端用于将示踪剂附接至凝胶材料。

在一些方面中，质量控制示踪剂是：

5’-炔烃-ttttttacatacatacatacatacauacataca[氨基c6dt-呫吨荧光团]-3’(seq.idno.15)。

在一些方面中，炔烃是己炔。在一些方面中，u裂解位点是尿嘧啶切割位点。在一些方面中，呫吨荧光团具有在585nm至640nm的范围内的最大发射波长。在其他方面中，呫吨荧光团在光谱的红色区域中发射波长。在其他方面中，呫吨荧光团具有约591nm、或610nm、或637nm的最大发射波长。在一些方面中，荧光团是texas

在一些方面中，当质量控制示踪剂包括引物序列和可检测标记物两者时，质量控制示踪剂包含以下序列中的一个：

5'-aatgatacggcgaccaccgagauctaca-3’(seq.idno.16)

5'-aatgatacggcgaccaccgagaucacac-3’(seq.idno.17)

5'-aatgatacggcgaccaccgagauctacac-3’(seq.idno.1)。

在一些方面中，质量控制示踪剂包括如上文描述的聚t区域。在一些实例中，质量控制示踪剂包含以下序列中的一个：

5'-(聚t或tttttt)aatgatacggcgaccaccgagauctaca-3’(seq.idno.18)

5'-(聚t或tttttt)aatgatacggcgaccaccgagaucacac-3’(seq.idno.19)

5'-(聚t或tttttt)aatgatacggcgaccaccgagauctacac-3’(seq.idno.20)。

在一些方面中，质量控制示踪剂包含允许接枝至凝胶材料的末端。在一些实例中，末端是炔烃或己炔部分。因此，在一些方面中，质量控制示踪剂包含以下序列中的一个：

5'-(炔烃)-(聚t或tttttt)aatgatacggcgaccaccgagauctaca-3’(seq.idno.18)

5'-(炔烃)-(聚t或tttttt)aatgatacggcgaccaccgagaucacac-3’(seq.idno.19)

5'-(炔烃)-(聚t或tttttt)aatgatacggcgaccaccgagauctacac-3’(seq.idno.20)。

在一些方面中，质量控制示踪剂包括如本文描述的呫吨荧光团或德克萨斯红。在一些方面中，质量控制示踪剂包含以下序列中的一个：

5'-(炔烃)-(聚t或tttttt)aatgatacggcgaccaccgagauctaca(氨基c6dt-呫吨荧光团)-3’(seq.idno.21)

5'-(炔烃)-(聚t或tttttt)aatgatacggcgaccaccgagauc(氨基c6dt-呫吨荧光团)acac-3’(seq.idno.22)

5'-(炔烃)-(聚t或tttttt)aatgatacggcgaccaccgagauctacac(氨基c6dt呫吨荧光团)-3’(seq.idno.23)。

当使用图3a中的质量控制示踪剂22a时，应理解，质量控制示踪剂22a以相对于单独的引物核苷酸序列20、20’的预定的比率存在。预定比率可以在本文公开的质量控制方法的实例中用于间接地确定单独的引物核苷酸序列20、20’的密度和/或分布。

为了形成图3a中示出的实例，可以使用顺序接枝或共接枝。

顺序接枝可以通过将支持物12(在位点16中具有凝胶材料24)暴露于包含质量控制示踪剂22a的溶液或混合物并孵育，并且然后暴露于包含引物核苷酸序列20、20’的溶液或混合物并孵育来完成。可选择地，顺序接枝可以通过将支持物12(在位点16中具有凝胶材料24)暴露于包含引物核苷酸序列20、20’的溶液或混合物并孵育，并且然后暴露于包含质量控制示踪剂22a的溶液或混合物并孵育来完成。

共接枝可以通过将支持物12(在位点16中具有凝胶材料24)暴露于包含质量控制示踪剂22a和引物核苷酸序列20、20’的溶液或混合物并且然后孵育来完成。支持物12暴露于该溶液或混合物可以通过将质量控制示踪剂22a和引物核苷酸序列20、20’的混合物沉积在支持物12上来完成。在一个实例中，溶液或混合物可以流过凝胶材料24涂覆的支持物12(在图2c中示出)。

在用于形成图3a中示出的实例的任何接枝实例中，孵育在预定的温度发生，该预定温度部分地取决于所使用的质量控制示踪剂22a和引物核苷酸序列20、20’。作为实例，孵育可以在约50℃至约70℃的范围内的温度完成。

同样地，在用于形成图3a中示出的实例的任何接枝实例中，溶液可以包含质量控制示踪剂22a和/或引物核苷酸序列20、20’、水、缓冲剂和催化剂。质量控制示踪剂22a和/或引物核苷酸序列20、20’，无论存在于相同的溶液/混合物中还是不同的溶液/混合物中，都可以以任何期望的预定比率存在。

图3b描绘了包含在具有单独的引物核苷酸序列20、20’的凝胶材料24/凝胶垫24’上的质量控制示踪剂22b的另一个实例。在该实例中，质量控制示踪剂22b是非反应性核苷酸序列32，具有附接至可裂解的核碱基的荧光标记物28，并且引物核苷酸序列20、20’是未加标签的引物核苷酸序列。

质量控制示踪剂22b的该实例的非反应性核苷酸序列32在进行质量控制方法之后和进行测序的同时保持至少大体上完整，并且因此序列32与也附接至凝胶材料24的引物核苷酸序列20、20’正交。

图3b的非反应性核苷酸序列32可以在其5’末端包含能够附接至凝胶材料24的官能团。该官能团的实例包括炔烃、降冰片基(或其他环烯基)、无铜点击部分(例如，二苯并环辛炔(dibo)、其他环炔烃或其他)和硫醇。该官能团可以基于所使用的凝胶材料24来选择。例如，炔烃、降冰片基和无铜点击部分可以经由点击反应与pazam的叠氮化物反应，并且硫醇可以与sfa反应。

在质量控制示踪剂22b的该实例中，荧光标记物28被附接至序列32的可裂解的核碱基。荧光标记物28所附接的核碱基是可以被核酸外切酶裂解的核碱基，核酸外切酶催化特定碱基的切割，同时保持磷酸二酯骨架完整。

在该实例中，荧光标记物28可以附接在序列32的3’末端附近(例如，在序列32的3’末端的10个碱基内)，但不直接附接在序列32的3’末端。可以使用任何之前描述的荧光标记物28，只要所选择的标记物可以共价地附接至非反应性核苷酸序列32的期望的核碱基。

图3b中的质量控制示踪剂22b与单独的引物核苷酸序列20、20’组合使用(例如，在本文公开的质量控制方法的实例中)。合适的引物核苷酸序列20、20’的实例包括用于与互补序列杂交和扩增序列的正向扩增引物或反向扩增引物。合适的引物核苷酸序列20、20’的一些具体实例包括之前描述的p5引物或p7引物。

当使用图3b中的质量控制示踪剂22b时，应理解，质量控制示踪剂22b以相对于引物核苷酸序列20、20’的预定的比率存在。预定比率可以在本文公开的质量控制方法的实例中用于间接地确定引物核苷酸序列20、20’的密度和/或分布。

为了形成图3b中示出的实例，可以如之前描述的使用顺序接枝或共接枝，除了使用质量控制示踪剂22b而不是质量控制示踪剂22a。在用于形成图3b中示出的实例的任何接枝实例中，孵育在预定的温度发生，该预定的温度部分地取决于所使用的质量控制示踪剂22b和引物核苷酸序列20、20’。同样地，在用于形成图3b中示出的实例的任何接枝实例中，溶液可以包含质量控制示踪剂22b和/或引物核苷酸序列20、20’、水、缓冲剂和催化剂。质量控制示踪剂22b和/或引物核苷酸序列20、20’，无论存在于相同的溶液/混合物中还是不同的溶液/混合物中，都可以以任何期望的预定比率存在。

图3c描绘了包含在具有单独的引物核苷酸序列20、20’的凝胶材料24/凝胶垫24’上的质量控制示踪剂22c的仍然另一个实例。在该实例中，质量控制示踪剂22c是非反应性核苷酸序列32’，具有附接至可裂解的核碱基(3’末端附近)的荧光标记物28且具有切割位点30，并且引物核苷酸序列20、20’是未加标签的引物核苷酸序列。

由于质量控制示踪剂22c的该实例包括附接至可裂解的核碱基的荧光标记物28，因此在已经进行质量控制方法之后，可以使用核酸外切酶以去除荧光标记物28。在该实例中，非反应性核苷酸序列32’在已经进行质量控制方法之后保持至少大体上完整，并且因此非反应性核苷酸序列32’可以与也附接至凝胶材料24的引物核苷酸序列20、20’正交。

此外，由于质量控制示踪剂22c的该实例还包括切割位点30，因此在已经进行质量控制方法之后，可以使用酶促裂解以去除非反应性序列32’的可裂解部分31’。在该实例中，可裂解部分31’包括任何寡核苷酸序列、附接至沿该序列的核碱基的荧光标记物28和切割位点30。在酶促裂解之后仍附接至凝胶材料24的非反应性核苷酸序列32’的部分29’也是非反应性核苷酸序列，并且因此将不参与或干扰待进行或正在进行的测序操作。剩余部分29’可以是短的聚t序列或聚a序列，或者可以是与也附接至凝胶材料24的引物核苷酸序列20、20’正交的序列。

图3c的非反应性核苷酸序列32’可以在其5’末端包含能够附接至凝胶材料24的官能团。该官能团的实例包括炔烃、降冰片基(或其他环烯基)、无铜点击部分(例如，二苯并环辛炔(dibo)、其他环炔烃或其他)和硫醇。该官能团可以基于所使用的凝胶材料24来选择。例如，炔烃、降冰片基和无铜点击部分可以经由点击反应与pazam的叠氮化物反应，并且硫醇可以与sfa反应。

在该实例中，荧光标记物28可以附接在序列32’的3’末端附近(例如，在序列32’的3’末端的10个碱基内)，但不直接附接在序列32’的3’末端。可以使用任何之前描述的荧光标记物28，只要所选择的标记物可以共价地附接至非反应性核苷酸序列32’的期望的核碱基。

图3c中的质量控制示踪剂22c与单独的引物核苷酸序列20、20’组合使用(例如，在本文公开的质量控制方法的实例中)。合适的引物核苷酸序列20、20’的实例包括用于与互补序列杂交和扩增序列的正向扩增引物或反向扩增引物。合适的引物核苷酸序列20、20’的一些具体实例包括之前描述的p5引物或p7引物。

当使用图3c中的质量控制示踪剂22c时，应理解，质量控制示踪剂22c以相对于引物核苷酸序列20、20’的预定的比率存在。预定比率可以在本文公开的质量控制方法的实例中用于间接地确定引物核苷酸序列20、20’的密度和/或分布。

为了形成图3c中示出的实例，可以如之前描述的使用顺序接枝或共接枝，除了使用质量控制示踪剂22c而不是质量控制示踪剂22a。在用于形成图3c中示出的实例的任何接枝实例中，孵育在预定的温度发生，该预定的温度部分地取决于所使用的质量控制示踪剂22c和引物核苷酸序列20、20’。同样地，在用于形成图3c中示出的实例的任何接枝实例中，溶液可以包含质量控制示踪剂22c和/或引物核苷酸序列20、20’、水、缓冲剂和催化剂。质量控制示踪剂22c和/或引物核苷酸序列20、20’，无论存在于相同的溶液/混合物中还是不同的溶液/混合物中，都可以以任何期望的预定比率存在。

图3d描绘了包含在不具有单独的引物核苷酸序列20、20’的凝胶材料24/凝胶垫24’上的质量控制示踪剂22d的实例。在该实例中，质量控制示踪剂22d是在其3’末端用荧光标记物28加标签的可裂解的核苷酸序列27’。荧光标记物28可以是任何之前描述的荧光团。

可裂解的核苷酸序列27’的该实例包括可裂解部分31”和剩余部分29”。可裂解部分31”包含荧光标记物28、任何核苷酸序列和在3’末端附近的切割位点30。可裂解部分31”还可以包含将荧光标记物28附接至核苷酸序列的官能团。该官能团的实例是5'-二甲氧基三苯甲基-5-[n-(三氟乙酰基氨基己基)-3-丙烯酰基亚氨基]-2'-脱氧尿苷、3'-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺(即，氨基修饰剂c6dt)。其他实例包括5'-二甲氧基三苯甲基-n-二甲基甲脒-5-[n-(三氟乙酰基氨基己基)-3-丙烯酰基亚氨基]-2'-脱氧胞苷、3'-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺(氨基修饰剂c6dc)并且使用固体支持物诸如(2-二甲氧基三苯甲基氧基甲基-6-芴基甲氧基羰基氨基-己烷-1-琥珀酰基)-长链烷基氨基-cpg。该官能团可以基于所使用的荧光标记物28来选择。当可裂解的核苷酸序列27’暴露于靶向位于切割位点30的核苷酸的酶时，序列27’的可裂解部分31”可以被去除。

在酶促裂解之后仍附接至凝胶材料24的可裂解的核苷酸序列27’的部分29”是引物核苷酸序列20、20’。在可裂解部分31”被去除之后剩余的引物核苷酸序列20、20’将参与待进行或正在进行的测序操作。本文公开的引物核苷酸序列20、20’的任何实例可以用于质量控制示踪剂22d。

图3d的可裂解的核苷酸序列27’可以在其5’末端包含能够附接至凝胶材料24的官能团。该官能团的实例包括炔烃、降冰片基(或其他环烯基)、无铜点击部分(例如，二苯并环辛炔(dibo)、其他环炔烃或其他)和硫醇。该官能团可以基于所使用的凝胶材料24来选择。例如，炔烃、降冰片基和无铜点击部分可以经由点击反应与pazam的叠氮化物反应，并且硫醇可以与sfa反应。

在其3’末端用荧光标记物texas加标签的p5引物的实例是：

5’-炔烃-aatgatacggcgaccaccgagauctaca[氨基c6dt-德克萨斯红]-3’(seq.idno.24)

图3d中的质量控制示踪剂22d可以在本文公开的质量控制方法的实例中用于直接地确定作为示踪剂22d的一部分的引物核苷酸序列20、20’的密度和/或分布。

为了形成图3d中示出的实例，可以使用一种类型的质量控制示踪剂22d(其各自包括相同的引物核苷酸序列20或20’)的接枝，或者可以使用不同类型的质量控制示踪剂22d(例如，其中的一些包括引物核苷酸序列20，而其中的另一些包括不同的引物核苷酸序列20’)的共接枝。接枝或共接枝可以如之前描述的进行，除了使用质量控制示踪剂22d而不是质量控制示踪剂22a。

质量控制示踪剂22e的仍然其他实例在图4中示出。在这些实例中，质量控制示踪剂22e是在其3’末端用荧光标记物28加标签的可裂解的核苷酸序列。可裂解的核苷酸序列的这些实例中各自包含核苷酸序列x、接头分子34和荧光标记物28。

核苷酸序列x可以是非反应性核苷酸序列(诸如序列32)或引物核苷酸序列(诸如序列20或20’)。当核苷酸序列x是非反应性核苷酸序列时，质量控制示踪剂22e可以与单独的引物核苷酸序列20、20’组合使用(类似于图3a至图3c中示出的实例)。当核苷酸序列x是引物核苷酸序列时，质量控制示踪剂22e可以单独使用(即，没有单独的引物核苷酸序列20、20’)(类似于图3d中示出的实例)。

图4的核苷酸序列x可以在其5’末端包含能够附接至凝胶材料24的官能团。该官能团的实例包括炔烃、降冰片基(或其他环烯基)、无铜点击部分(例如，二苯并环辛炔(dibo)、其他环炔烃或其他)和硫醇。该官能团可以基于所使用的凝胶材料24来选择。例如，炔烃、降冰片基和无铜点击部分可以经由点击反应与pazam的叠氮化物反应，并且硫醇可以与sfa反应。

接头分子34包含在一个末端处的可以(直接地或间接地)附接至荧光标记物28的官能团和在另一个末端处的可以(直接地或间接地)附接至核苷酸序列x的官能团(例如，在序列x的3’末端或特定的核碱基处)。质量控制示踪剂22e的接头分子34提供了化学连接，该化学连接可以经历裂解反应，该裂解反应在已经进行质量控制方法的实例之后从质量控制示踪剂22e至少去除荧光标记物28。进行的裂解反应取决于所使用的接头分子34。示例性接头分子34包括二醇、二硫化物、硅烷、偶氮苯、光可裂解的基团和叠氮基。

二醇是包含两个羟基基团的任何化合物。可以使用直链的或环状的二醇。合适的二醇的实例是邻位二醇，其中羟基基团被附接至相邻的碳原子。邻位二醇在氧化条件下诸如暴露于高碘酸盐(诸如高碘酸钠)或在酶促条件下是可裂解的。合适的二醇的实例是如图4中的34a所示的酒石酸衍生的二醇。在该实例中，二醇的各末端处的胺基团附接至相应的部分，胺基团中的一个附接至核苷酸序列x的3’末端，并且胺基团中的另一个经由任何合适的附接位点(例如，醇、胺、羧酸)附接至荧光标记物28。二醇可以通过将质量控制示踪剂22e暴露于高碘酸钠(naio4)来裂解，高碘酸钠可以将二醇氧化裂解成两个醛。

二硫化物具有一般结构r¹-s-s-r²，其中r¹和r²可以是烷基基团或芳基基团的任一个。二硫键在还原条件下裂解。合适的二硫化物的实例如图4中的34b所示。在该实例中，二硫化物的一个末端处的胺基团经由接头诸如烷基链附接至核苷酸序列x的3’末端，并且二硫化物的另一个末端处的胺基团形成酰氨基连接其中r是-(ch2)4-o-荧光标记物28，r’是h，并且r”是–(ch2)2-s-s-(ch2)2–(c＝o)-nh–(ch2)3-x。荧光标记物28经由任何合适的附接位点(例如，醇、胺、羧酸)来附接。在一个实例中，二硫化物可以通过将质量控制示踪剂22e暴露于还原条件诸如硫醇(r³sh，其中r³可以是任何合适的烷基基团)或叔膦(r⁴3p，其中r⁴是任何合适的烷基基团)来裂解。硫醇与二硫化物的反应将破坏二硫键，并且产生衍生自原始二硫化物的新的二硫化物和硫醇。叔膦与二硫化物的反应是双分子亲核取代(sn2)反应，该反应将破坏二硫键并且产生两个含硫产物。

如本文使用并且如图4中的34c所示的硅烷包含结合至两个氧原子和两个r基团(例如，r基团各自可以是烷基基团或芳基基团)的硅原子。在该实例中，硅烷的氧原子分别附接至与核苷酸序列x的3’末端附接的接头诸如烷基链并且经由任何合适的附接位点(例如，醇、胺、羧酸)附接至荧光标记物28。硅烷可以通过将质量控制示踪剂22e暴露于酸(在图4中示出为h⁺)或通过用氟离子处理(在图4中未示出)来在si-o键中的一个处裂解。

偶氮苯是包含由n＝n双键连接的两个苯基环的化合物。不同的官能团可以从苯基环在相对于n＝n双键的对位延伸。这些官能团可以是相同的或不同的，并且实例包括酰氨基基团、烷基胺或羟基基团。合适的偶氮苯的实例如图4中的34d所示。在该实例中，官能团包括酰氨基基团和乙胺。酰氨基基团附接至与核苷酸序列x的3’末端附接的接头诸如烷基链，并且乙胺的胺基团形成酰氨基连接其中r是–(ch2)4-o-荧光标记物28，r’是h，并且r”是–(ch2)2-偶氮苯-(c＝o)-nh–(ch2)3-x。荧光标记物28经由任何合适的附接位点(例如醇、胺、羧酸)来附接。在实例中，偶氮苯可以通过将质量控制示踪剂22e暴露于连二亚硫酸钠(na2s2o4)来裂解。连二亚硫酸钠与偶氮苯的反应将偶氮苯还原成两个苯胺基团。

光可裂解的基团是包含光裂解位点的非核苷酸部分，其中裂解通过用预定波长的光照射持续预定的时间来发生。光可裂解的基团可以用作中间体，以将核苷酸序列x的3’末端处的任何可用的亚磷酰胺修饰附接至与荧光标记物28附接的官能团。合适的光可裂解的基团的实例邻硝基苄基基团，如图4中的34e所示。在该实例中，光可裂解的基团在任一末端包含胺基团。在该实例中，光可裂解的基团的一个末端处的胺基团附接至与核苷酸序列x附接的接头诸如烷基链，并且光可裂解的基团的另一个末端处的胺基团形成通过–(ch2)4-o-附接至荧光标记物28的酰氨基连接。荧光标记物28经由任何合适的附接位点(例如醇、胺、羧酸)来附接。在一个实例中，通过将质量控制示踪剂22e暴露于预定波长的光持续预定的时间，至少荧光标记物28在光可裂解位点处从质量控制示踪剂22e裂解。

如本文提及的，叠氮基是包含基团n3的任何分子。合适的叠氮基的实例在图4中示出为o-叠氮基烷基基团34f。在该实例中，叠氮基的一个末端处的胺基团附接至与核苷酸序列x的3’末端附接的接头诸如烷基链，并且叠氮基的另一个末端处的胺基团形成酰氨基连接其中(在该实例中)r是–(ch2)4-o-荧光标记物28，r’是h，并且r”是–(ch2)3-o-(cn3)–(ch2)-(o(ch2)2)2-(ch2)–(c＝o)-nh–(ch2)3-x。荧光标记物28经由任何合适的附接位点(例如醇、胺、羧酸)来附接。在一个实例中，叠氮基可以通过将质量控制示踪剂22e暴露于叔膦(r⁶3p，其中r⁶是适当地被取代的烷基基团或芳基基团)来裂解。叔膦和叠氮基经历staudinger还原反应。

本文公开的接头分子34各自可以经历化学裂解反应，该化学裂解反应在已经进行质量控制方法的实例之后至少从质量控制示踪剂22e去除荧光标记物28。剩余部分可以是非反应性核苷酸序列(将不参与测序)或引物核苷酸序列(将参与测序)。

当质量控制示踪剂22e的核苷酸序列x是非反应性的时，质量控制示踪剂22e可以与单独的引物核苷酸序列20、20’顺序接枝或共接枝，如本文之前描述的。当质量控制示踪剂22e的核苷酸序列x是引物核苷酸序列20、20’时，可以接枝一种类型的质量控制示踪剂22e(其各自包括相同的引物核苷酸序列20或20’)，或者可以共接枝不同类型的质量控制示踪剂22e(例如，其中的一些包括引物核苷酸序列20，而其中的另一些包括不同的引物核苷酸序列20’)。接枝或共接枝可以如之前描述的进行，除了使用质量控制示踪剂22e的实例而不是质量控制示踪剂22a。

重新参考图2d，描绘了具有单独的引物核苷酸序列20、20’的质量控制示踪剂22的实例。在包含引物核苷酸序列20、20’的示踪剂22的实例中(例如，示踪剂22d和示踪剂22e的一些实例)，单独的引物核苷酸序列20、20’将不与示踪剂22一起存在。

本文公开的阵列10可以用于质量控制方法。质量控制方法的实例在图5中描绘。方法50通常包括：将质量控制示踪剂22接枝至支持物12上的孔16’中的凝胶材料24，质量控制示踪剂选自由以下组成的组：在其3’末端用荧光标记物28加标签的可裂解的核苷酸序列27、27’和具有附接至可裂解的核碱基的荧光标记物28的非反应性核苷酸序列32、32’(如附图标记52所示)；使用荧光检测质量控制示踪剂22(如附图标记54所示)；以及至少部分地基于荧光，确定接枝至凝胶材料24的引物核苷酸序列20、20’的密度、或分布、或密度和分布(如附图标记56所示)。

质量控制方法可以在质量控制示踪剂22单独地或与单独的引物核苷酸序列20、20’组合地被接枝至凝胶材料24之后和流动池制造完成之前(例如，在阵列10结合至顶部基底流动池之前)进行。质量控制方法还可以或可选择地由完整制造的流动池的终端用户来进行。当质量控制方法由流动池的终端用户进行时，应理解，该方法可以在将任何测序工作流程试剂和dna样品加载在流动池之前进行。因为各个质量控制示踪剂22a、22b、22c、22d、22e包含可检测荧光标记物28，所以荧光标记的互补核苷酸的杂交不需要作为本文公开的质量控制方法的一部分来进行。

在方法50中，质量控制示踪剂22a、22b、22c、22d、22e的各种实例的接枝可以如之前描述的来完成。

示例性质量控制示踪剂22a、22b、22c、22d、22e各自包含荧光标记物28，该荧光标记物28当暴露于较短波长的入射辐射时将发射较长波长的光。照此，检测质量控制示踪剂22可以通过将阵列10(或包含阵列10的流动池)暴露于由激光发射的辐射来完成。在激光激发之后，来自各个质量控制示踪剂22a、22b、22c、22d、22e的荧光标记物28的发射的荧光(就强度而言)经由合适的荧光检测器被捕获。

当质量控制示踪剂22a、22b、22c或示踪剂22e的一些实例与单独的引物核苷酸序列20、20’以预定的比率使用时，来自这些质量控制示踪剂22a、22b、22c、22e的荧光强度和预定比率可以用于评估或间接地确定引物核苷酸序列20、20’的密度和/或分布。荧光强度指示质量控制示踪剂22a、22b、22c、22e的密度和/或分布，并且预定比率使得质量控制示踪剂22a、22b、22c、22e的数据能够与引物核苷酸序列20、20’相关联。

当利用质量控制示踪剂22d或示踪剂22e的其他实例(其包含引物核苷酸序列20、20’)时，荧光结果可以单独地用于评估或直接确定引物核苷酸序列20、20’的密度和/或分布。质量控制示踪剂22d、22e的这些实例包含作为示踪剂22d、22e的一部分的序列20、20’，并且因此荧光强度单独地指示引物核苷酸序列20、20’的密度和/或分布。

在质量控制方法完成之后(例如，在工作流程的终端用户部分)，荧光标记物28可以使用本文描述的方法从质量控制示踪剂22a、22b、22c、22d、22e裂解。

如上文参考图3a提及的，质量控制示踪剂22a包含切割位点30。照此，在该示例性示踪剂22a中荧光标记物28的裂解可以经由酶促裂解来完成。质量控制示踪剂22a暴露于靶向位于切割位点30的核苷酸的酶。酶可以在开始测序之前引入，或者可以作为测序工作流程的聚簇产生过程的一部分引入。合适的酶的实例包括核酸外切酶(其从序列的末端去除连续的核苷酸)、内切核酸酶(其裂解序列中的磷酸二酯键)、碱基切除修复酶(其去除特定碱基以形成无嘌呤/无嘧啶(ap)位点，然后无嘌呤/无嘧啶(ap)位点可以被ap内切核酸酶裂解)、限制性酶(其扫描质量控制示踪剂22a以寻找切割单链序列的4个至6个核苷酸的特定序列)等。一些具体的实例在下表1中示出。

在表1中，*表示荧光标记物28，n表示核苷酸，并且切割位点为粗体。

在表1中的一个实例中，切割位点30是被user酶靶向的尿嘧啶(du)。user酶是尿嘧啶dna糖基化酶(udg)和dna糖基化酶-裂解酶内切核酸酶viii的混合物。udg催化尿嘧啶碱基的切割，形成无碱基(无嘧啶)位点，同时保持磷酸二酯骨架完整。内切核酸酶viii的裂解酶活性破坏无碱基位点的3′侧和5′侧的磷酸二酯骨架，使得释放无碱基脱氧核糖。照此，示踪剂22a在切割位点30处的裂解从支持物12去除了序列27的部分31和荧光标记物28。在表1中的另一个实例中，切割位点30是被fpg靶向的氧化的嘌呤(例如，oxog)。fpg识别并且去除氧化的鸟嘌呤。fpg充当n-糖基化酶和ap-裂解酶两者。

在酶促裂解之后仍附接至凝胶材料24的质量控制示踪剂22a的部分29是非反应性核苷酸序列，并且因此将不参与或干扰待进行或正在进行的测序操作。

如上文参考图3b提及的，质量控制示踪剂22b包含附接至序列32的可裂解的核碱基的荧光标记物28。质量控制示踪剂22b暴露于核酸外切酶，核酸外切酶通过磷酸二酯裂解催化特定碱基的切割。核酸外切酶可以在开始测序之前引入，或者可以作为测序工作流程的聚簇产生过程的一部分引入。作为实例，核酸外切酶i催化具有附接至其上的荧光标记物28的尿嘧啶碱基的切割。

在核碱基裂解之后仍附接至凝胶材料24的质量控制示踪剂22b的序列32是非反应性的，并且因此将不参与或干扰待进行或正在进行的测序操作。

如上文参考图3c提及的，质量控制示踪剂22c包含附接至序列32’的可裂解的核碱基的荧光标记物28以及切割位点30。照此，在该示例性示踪剂22c中的荧光标记物28的裂解可以经由任何之前描述的酶促裂解的实例来完成。在一个实例中，核酸外切酶可以用于催化具有附接至其上的荧光标记物28的碱基的切割。在另一个实例中，靶向位于切割位点30的核苷酸的酶可以用于催化序列32’的部分31’的切割。在这些实例中，酶可以在开始测序之前引入，或者可以作为测序工作流程的聚簇产生过程的一部分引入。

在核碱基或部分31’裂解之后仍附接至凝胶材料24的质量控制示踪剂22c的序列32’的部分29’是非反应性的，并且因此将不参与或干扰待进行或正在进行的测序操作。

如上文参考图3d提及的，质量控制示踪剂22d包含切割位点30。照此，在该示例性示踪剂22d中的荧光标记物28的裂解可以经由任何之前描述的酶促裂解的实例来完成。在该实例中，在部分31”裂解之后仍附接至凝胶材料24的序列27’的部分29”是引物核苷酸序列20、20’，并且因此将参与待进行或正在进行的测序操作。

如上文参考图4提及的，质量控制示踪剂22e的各种实例包括接头分子34。这些示例性示踪剂22e中的荧光标记物28的裂解可以通过将示踪剂22e暴露于适合用于裂解示踪剂22e中存在的接头分子34的化学物质经由化学裂解来完成。接头分子34a、34b、34c、34d、34e、34f和相关的可裂解化学物质的各种实例参考图4进行了描述。在这些实例中，可裂解化学物质可以在开始测序之前引入。

在化学裂解之后仍附接至凝胶材料24的质量控制示踪剂22e的部分将取决于核苷酸序列x和化学裂解发生的位置。剩余部分可以包含非反应性核苷酸序列(其将不参与或干扰测序)或引物核苷酸序列(其将参与测序)。

虽然附图中未示出，但方法的另一个实例包括：将质量控制示踪剂的实例(例如，22a、22b、22c和22e的一些实例)与引物核苷酸序列20、20’以预定的比率掺入接枝混合物中；将接枝混合物暴露于支持物23上的孔16’中的凝胶材料24；孵育接枝混合物，从而将质量控制示踪剂22a、22b、22c和22e的一些实例以及引物核苷酸序列20、20’共接枝至凝胶材料24；使用荧光检测质量控制示踪剂；以及至少部分地基于荧光和预定的比率，确定接枝至凝胶材料24的引物核苷酸序列20、20’的密度、或分布、或密度和分布。

多种测序方法或技术，包括通常被称为合成测序(sbs)、连接测序、焦磷酸测序等等的技术，可以在荧光标记物28被裂解之后进行。对于这些技术中的任一种，由于凝胶材料24和附接的引物核苷酸序列20、20’存在于位点16并且不存在于间隙区域18上，扩增将限于不同的位点16。

简言之，合成测序(sbs)反应可以在诸如来自illumina(sandiego,ca)的或测序仪系统的系统上运行。将一组待测序的靶dna分子与结合的引物核苷酸序列20、20’杂交(而不与任何非反应性核苷酸序列杂交)，并且然后通过桥式扩增(bridgeamplification)或动力学排除扩增(kineticexclusionamplification)来扩增。变性留下了锚定至凝胶材料24的单链模板，并且产生了几百万密集的双链dna的簇(即，聚簇产生)。然后进行测序反应。将数据与参考进行比对和比较，并且识别测序差异。

为了进一步说明本公开内容，本文给出了实施例。应理解，该实施例为了说明的目的而被提供，并且不应被解释为限制本公开内容的范围。

实施例

使用以下质量控制示踪剂：

5’-己炔-聚t尾-catctaggcatctaagcatcaaucttaca[氨基c6dt-德克萨斯红]-3’(seq.idno.25)

为了评估用于接枝至基底表面的p5/p7引物的质量控制的qc示踪剂的实例，p5/p7引物接枝混合物被制备为具有10％的qc示踪剂加标(spike)和不具有qc示踪剂加标(对照)。用包含10％的qc示踪剂加标的p5/p7引物混合物接枝的基底表面通过测量示踪剂荧光来评估。对照表面(不具有qc示踪剂加标)通过基于杂交的tetqc来评估。tet是具有与p5/p7引物互补的序列的染料标记的寡核苷酸。tet在表面上与p5/p7引物杂交，洗去过量的tet，并且通过荧光检测测量附接的染料浓度。

图6a和图6b分别示出了与互补的含染料寡核苷酸(tetqc)杂交的接枝的对照基底表面的荧光图像和包含qc示踪剂的接枝的基底表面的荧光图像。图6c示出了图6a和图6b的接枝的表面的qc示踪剂荧光对tet荧光的图。图6a-图6c中的数据示出来自qc示踪剂的荧光强度与基底表面上的p5/p7密度相关。

为了评估在标准聚簇产生过程期间接枝的qc示踪剂从流动池的表面的裂解，使用用不同qc示踪剂接枝的流动池。图7a示出了初始荧光图像，其示出了在聚簇产生之前用qc示踪剂接枝的流动池。图7b示出了聚簇后荧光图像，其示出了在聚簇产生之后用qc示踪剂接枝的流动池。qc示踪剂(200nm)是：

5’-己炔-聚t尾-catctaggcatctaagcatcaaucttaca[氨基c6dt-德克萨斯红]-3’(seq.idno.25)(200nm示踪剂)

5’-己炔-聚t尾-aatgatacggcgaccaccgagauctaca[氨基c6dt-德克萨斯红]-3’(seq.idno.26)(200nmp5)

和

5’-己炔-聚t尾-aatgatacggcgaccaccgagauctaca[氨基c6dt-德克萨斯红]-3’(seq.idno.26)，具有1:1的校正的最终p5/p7比率。(200nmpg(1:1))

参考图7a的初始荧光图像，流动池中的暗区域是来自qc示踪剂的信号；较亮的区域是对照泳道(即，不存在qc示踪剂)。参考图7b的聚簇后荧光图像，来自qc示踪剂的信号显著降低，指示qc示踪剂在簇形成期间的裂解。

图8a和图8b分别示出了图7a和图7b的接枝的流动池的接枝后qc示踪剂荧光的图和聚簇后qc示踪剂荧光的图。数据示出，在簇形成之后残余的荧光最小。裂解效率在约97％至约99％的范围内。

为了评估qc示踪剂接枝和随后的裂解对于下游测序度量的影响，使用图7a和图7b的流动池用于测序。

图9a和图9b分别示出了在一个测序循环(c1)之后红色通道的读段1(r1)荧光强度的图和读段2(r2)荧光强度的图。数据示出，红色通道中的c1强度受到qc示踪剂的使用的最小影响。

图10a和图10b分别示出了在一个测序循环(c1)之后绿色通道的读段1(r1)荧光强度的图和读段2(r2)荧光强度的图。数据示出，绿色通道中的c1强度受到qc示踪剂的使用的最小影响。

图11a和图11b分别示出了相对于参考基因组的读段1(r1)序列比对的图和读段2(r2)序列比对的图。数据示出，qc示踪剂的使用对于序列比对度量存在很小的影响或无影响。

图12a和图12b分别示出了读段1(r1)测序错误率的图和读段2(r2)测序错误率的图。数据示出，qc示踪剂的使用对于测序错误率度量存在很小的影响或无影响。

补充注释

应认识到，前述概念的所有组合(假设这样的概念不相互不一致)被预期为本文公开的创造性主题的一部分。特别地，出现在本公开内容的结尾处的所要求保护的主题的所有组合被预期为本文公开的创造性主题的一部分。还应认识到，也可以出现在通过引用并入的任何公开内容中的本文中明确使用的术语应符合与在本文公开的特定概念最一致的含义。

本说明书中所引用的全部出版物、专利以及专利申请据此通过引用以其整体并入。

贯穿本说明书对“一个实例”、“另一个实例”、“实例”等的提及意指结合该实例描述的特定要素(例如，特征、结构和/或特性)被包括在本文描述的至少一个实例中，并且可以存在于或可以不存在于其他实例中。此外，应理解，除非上下文另外清楚地指出，否则对于任何实例描述的要素可以在各种实例中以任何合适的方式组合。

应理解，本文提供的范围包括所陈述的范围和在所陈述的范围内的任何值或子范围。例如，约10kda至约1500kda的范围，应该被解释为不仅包括约10kda至约1500kda的明确列举的限值，而且包括单个值，诸如约18kda、约325kda、约425kda、约1075.5kda等，以及子范围，诸如约425kda至约990kda、约235kda至约780kda等。此外，当利用“约”和/或“大体上”来描述值时，它们意在涵盖与所陈述的值的微小变化(最多+/-10％)。

虽然已经详细描述了若干个实例，但应理解，可以修改所公开的实例。因此，前述描述应被认为是非限制性的。

序列表

<110>伊鲁米那股份有限公司

<120>具有质量控制示踪剂的阵列

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<223>具有在2-20的范围内的t碱基数目的聚胸腺嘧啶

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<222>(1)..(1)

<223>具有在2-20的范围内的t碱基数目的聚胸腺嘧啶

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nacatacatacatacatacauacataca28

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<223>具有在2-20的范围内的t碱基数目的聚胸腺嘧啶

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<220>

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<222>(35)..(35)

<223>通过氨基修饰剂c6dt接头附接至腺嘌呤的呫吨荧光团

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<221>misc_feature

<222>(30)..(30)

<223>通过氨基修饰剂c6dt接头附接至胞嘧啶的呫吨荧光团

<400>22

ttttttaatgatacggcgaccaccgagauc30

<210>23

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>misc_feature

<220>

<221>misc_feature

<222>(36)..(36)

<223>通过氨基修饰剂c6dt接头附接至胞嘧啶的呫吨荧光团

<400>23

ttttttaatgatacggcgaccaccgagauctacacn36

<210>24

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>misc_feature

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)..(29)

<223>通过氨基修饰剂c6dt接头附接至腺嘌呤的红色荧光染料

<400>24

aatgatacggcgaccaccgagauctacan29

<210>25

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>misc_feature

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>具有在2-20的范围内的t碱基数目的聚胸腺嘧啶

<220>

<221>misc_feature

<222>(31)..(31)

<223>通过氨基修饰剂c6dt接头附接至腺嘌呤的红色荧光染料

<400>25

ncatctaggcatctaagcatcaaucttacan31

<210>26

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>misc_feature

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>具有在2-20的范围内的t碱基数目的聚胸腺嘧啶

<220>

<221>misc_feature

<222>(30)..(30)

<223>通过氨基修饰剂c6dt接头附接至腺嘌呤的红色荧光染料

<400>26

naatgatacggcgaccaccgagauctacan30