本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有同步产电和反硝化活性的分支杆菌及其应用。
背景技术：
微生物燃料电池(microbialfuelcell，mfc)作为近年来开发的新一代、绿色环保、非石油类的可再生能源的产电装置，逐渐成为新兴能源领域的研究热点。mfc的工作原理是阳极微生物在厌氧条件下通过微生物的新陈代谢作用催化氧化有机物并释放电子和质子，电子由阳极经外电路传导至阴极，并由阴极通过催化剂催化接收电子发生还原反应，从而实现了有机物的去除和电流的产生，直接将化学能转化成电能。
与其他燃料电池相比，mfc的功率密度相对较低，难以替代其他能源以满足人类对能源的需求。因此，mfc技术越来越多的被研究者们应用于污水处理领域，即解决了传统污水处理能耗高和污泥产量大的缺点，又可有效的回收污水中大量有机物潜在的化学能。此外根据国家规定的《污水综合排放标准》中指出污水排放一级标准中两个关键指标分别为cod浓度不超过50mg/l和总氮浓度不超过20mg/l。在传统生物法处理污水过程中，硝态氮的高效去除和达标排放一直是污水处理的一个重要难题。
对于mfc而言，阳极产电微生物作为有机物降解的生物催化剂对mfc产电效率和能量回收的影响起着关键的作用。因此挖掘更多具有这种功能的微生物对于丰富产电微生物的多样性，提高产电效率具有重要意义。通过筛选具有高产电活性和反硝化活性的产电微生物，将其应用于mfc中即可达到同步去除有机物和硝态氮的目的，减少后续对氮源污染的二次处理。
分支杆菌是环境中广泛存在的一类菌属，细胞染色为革兰氏阳性，兼性厌氧。目前，关于该菌属微生物的产电特性及其在mfc中的应用在国内外尚未发现相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种具有同步产电和反硝化活性的分支杆菌及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种分支杆菌，该分支杆菌命名为mycobacteriumsp.eb-1(以下简称菌株eb-1)，已于2017年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，其简称为cctcc，保藏中心登记入册编号为cctccno：m2017371。
本发明的菌株eb-1为兼性厌氧菌、杆状、革兰氏阳性。在30℃、好氧条件下，胰蛋白胨大豆肉汤培养基平板上暗培养48h，形成圆形易挑取，不透明、边缘整齐的乳白色菌落，在光照条件下合成色素变为黄色菌落。
本发明的菌株eb-1的显著特征为具有高产电活性，能将代谢有机物产生的电子传递给mfc的阳极，实现有机物的降解并产生电能。当以乙酸钠为电子供体时，mfc最大功率密度达835.5mw/m2。该菌株的另一个显著特征为具有同步电催化活性和硝酸盐还原活性，当阳极液以乙酸钠(cod＝700mg/l)为电子供体，硝态氮浓度分别为20、50、100和200mg/l时，mfc仍具有高产电活性和反硝化速率。
第二方面，本发明提供了上述分枝杆菌在反硝化和/或催化有机物降解/分解中的应用。本发明的分枝杆菌可利用多种碳源尤其是大分子有机物进行产电，该菌株在处理实际废水中有巨大的应用潜力；且该菌株可通过反硝化反应将废水中硝态氮还原为氮气，在处理低碳氮比废水过程中能保持高效的脱氮速率和产电活性。
作为本发明所述分枝杆菌在反硝化和/或催化有机物降解/分解中的应用的优选实施方式，所述分枝杆菌用于废水/污水处理中。
第三方面，本发明提供了上述分枝杆菌在用于微生物燃料电池进行产电和/或反硝化中的应用。在微生物燃料电池中，本发明的分枝杆菌用作产电微生物。
作为本发明所述分枝杆菌在用于微生物燃料电池进行产电和/或反硝化中的应用的优选实施方式，所述分枝杆菌的电子供体为有机物。
作为本发明上述应用的优选实施方式，所述有机物为乙酸钠、丁酸、葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少一种。
第四方面，本发明还提供了一种微生物燃料电池，所述微生物燃料电池含有上述的分枝杆菌。
作为本发明所述微生物燃料电池的优选实施方式，所述微生物燃料电池还含有分枝杆菌的电子供体，所述分枝杆菌的电子供体为有机物；更优选地，所述有机物为乙酸钠、丁酸、葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少一种。
作为本发明所述微生物燃料电池的优选实施方式，所述微生物燃料电池包括阳极室、阴极室和用于连接阳极室与阴极室的外电路；所述阳极室包括阳极、阳极液和作为阳极催化剂的分枝杆菌，所述阳极液含有所述有机物和无机盐培养基。
作为本发明所述微生物燃料电池的优选实施方式，所述阳极液还含有硝态氮。
作为本发明所述微生物燃料电池的优选实施方式，所述无机盐培养基含有下述浓度的组分：硝酸钾0.144～1.44g/l，二水合磷酸二氢钠0.8～8.1g/l，十二水合磷酸氢二钠2.1～22g/l，wolfes矿物溶液10ml/l，所述无机盐培养基由hcl/naoh溶液调节其ph值至7；其中，wolfes矿物溶液含有下述浓度的组分：氨基乙酸1.5g/l，mgso4·7h2o3g/l，mnso4·2h2o0.5g/l,nacl1.0g/l,feso4·7h2o0.1g/l,cocl20.1g/l,cacl20.1g/l,znso40.1g/l,cuso4·5h2o0.01g/l,alk(so4)20.01g/l,h3bo30.01g/l,na2moo4·2h2o0.01g/l,所述wolfes矿物溶液由koh调节其至ph值为7。
作为本发明所述微生物燃料电池的优选实施方式，所述微生物燃料电池的培养温度为30℃。
作为本发明所述微生物燃料电池的优选实施方式，所述阳极为碳毡。
作为本发明所述微生物燃料电池的优选实施方式，所述阴极室包括阴极和阴极液；优选地，所述阴极为pt/c催化的空气阴极，所述阴极液0.1mol/l的磷酸缓冲液。
作为本发明所述微生物燃料电池的优选实施方式，所述阳极室和阴极室由阳离子交换膜分隔开。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明首次发现了分支杆菌(mycobacteriumsp.)eb-1为一株具有高的电化学活性和反硝化活性的产电菌，该菌株为兼性厌氧菌，并且能利用多种碳源进行产电，不仅扩大了产电微生物的范围，改善厌氧实验条件和底物广谱性，同时高效去除废水中的硝态氮污染。本发明应用于mfc实现了含氮废水同步能源回收和氮污染去除，为mfc在实际废水的工程应用奠定了基础。
附图说明
图1为本发明菌株eb-1在暗培养下的平板菌落形态图；
图2为本发明菌株eb-1在mfc阳极表面附着的电镜图；
图3为本发明菌株eb-1在mfc阳极表面附着的电镜图(放大图)；
图4为本发明菌株eb-1在mfc中的电压输出结果图；
图5为本发明菌株eb-1在mfc中的极化曲线和功率密度曲线图；
图6为本发明菌株eb-1在mfc中对硝态氮的还原结果图；
图7为本发明菌株eb-1在mfc中对不同电子供体的能量回收结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明的分支杆菌命名为mycobacteriumsp.eb-1(以下简称菌株eb-1)，已于2017年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，其简称为cctcc，保藏中心登记入册编号为cctccno：m2017371。
实施例1菌株eb-1的分离与鉴定
(1)菌株的筛选和富集：菌株eb-1筛选至实验室长期稳定运行的双室mfc系统，取出阳极具有产电活性的碳毡置于已灭菌的生理盐水溶液中，并通过超声分散其附着在阳极表面的微生物。无菌条件下，将得到的菌悬液通过稀释涂布于胰蛋白胨大豆肉汤固体培养基上，好氧培养48h，依据菌体菌落的差异性，挑取单菌落，并通过多次划线分离得到纯菌株。进一步的，将纯菌株接种至以乙酸钠为碳源的阳极液固体培养基中，并置于厌氧培养箱中30℃培养若干天，观察菌落形态及其生长情况。挑取可同时在好氧和厌氧条件下生长的菌株，分别将其接种至胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中扩大培养，离心收集菌体。
阳极液培养基的成分组成为：乙酸钠1g/l，硝酸钾0.38g/l，二水合磷酸二氢钠6.08g/l，十二水合磷酸氢二钠21.85g/l，wolfes矿物溶液10ml/l，所述无机盐培养基由hcl/naoh溶液调节其ph值至7；其中，wolfes矿物溶液由下述浓度的组分组成：：氨基乙酸1.5g/l，mgso4·7h2o3g/l，mnso4·2h2o0.5g/l,nacl1.0g/l,feso4·7h2o0.1g/l,cocl20.1g/l,cacl20.1g/l,znso40.1g/l,cuso4·5h2o0.01g/l,alk(so4)20.01g/l,h3bo30.01g/l,na2moo4·2h2o0.01g/l,wolfes矿物溶液由koh调节其至ph值为7。
阳极液固体培养基为上述阳极液培养基成分上，加入琼脂15-20g/l。
(2)mfc部件预处理和组装：mfc部件中的阳极室、阴极室、垫圈和胶塞置于5％的过氧化氢溶液中浸泡过夜，以无菌水清洗备用。阳极碳毡分别经过乙醇丙酮混合液过夜浸泡、清洗、过硫酸铵浸泡15min、清洗、高温焙烧、5％nh3/ar焙烧后，置于超净台中紫外照射30min，备用。空气阴极分别经过碳布的防水层pdms处理、非防水层的pt/c负载(0.5mg/cm2)后，置于超净台中紫外照射30min，备用。阳离子交换膜经过5％的过氧化氢溶液浸泡2h，无菌水清洗过后，置于已灭菌的0.1mpbs溶液中浸泡备用。mfc所有部件在无菌超净台上组装成为双室空气阴极微生物燃料电池。
(3)接种和mfc运行：高温灭菌后的阳极液在无菌条件下通入高纯氮排出氧气，并加入到阳极室；阴极室加入高温灭菌的0.1mpbs溶液。接种针分别挑取(1)中离心得到的菌体至阳极室中，可看到阳极室因接种有明显的菌悬液。由钛导线连接外电路和阴阳极，外电路接一个1kω的电阻，电阻两端连接到多通道电压测定仪。电脑控制数据采集方式并保存采集的数据，得到随时间变化的电压曲线。
(4)产电菌的鉴定：选取电压输出最高的mfc所对应的接种菌株，命名为eb-1，对该菌株分别进行菌落形态鉴定、生理生化鉴定和分子鉴定，结果如下：
形态鉴定：平板在恒温培养箱中暗培养48h后，菌落表面光滑不透明，乳白色，如图1所示；在室温光照刺激下，菌落变为黄色，显微镜下呈杆状；在mfc阳极表面附着的形态如图2和图3所示。革兰氏染色为阳性；在厌氧条件下的无机盐固体培养基培养3-5天，菌落为白色细小颗粒。
生理生化鉴定：兼性厌氧菌；可以利用葡萄糖、淀粉、蛋白质等物质为碳源；硝酸盐还原实验阳性；甲基红(mr)试验阳性；v-p反应试验为阴性。
分子鉴定：所述菌株eb-1分别在好氧和厌氧条件下培养后，挑取菌落，经dna提取，pcr扩增后得到16srrna碱基序列一致，于ncbi数据库中进行同源性分析，blast检索比对得出该菌株与mycobacteriumfortuitum(nz_cp011269.1)相似性最高达99％。目前，未见能具有产电能力的分支杆菌报道。因此，将该菌命名为分支杆菌(mycobacteriumsp.)eb-1。
根据以上的鉴定结果，菌株eb-1属于分支杆菌，将其进行保藏，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，其简称为cctcc，保藏中心登记入册编号为cctccno：m2017371。
实施例2菌株eb-1的mfc产电验证及电化学特性
mfc按照实施例1中的(2)和(3)启动运行，电压输出情况如图4所示，经过三个周期的运行，在第四个周期输出电压达到稳定，意味着菌株eb-1在mfc的电化学活性已达稳定，视为启动成功。启动成功后进入正式运行阶段，当检测的输出电压低于20mv时，在无菌条件下更换阳极液，一般一个周期为3天左右。进一步的，更换新的阳极液后，当输出电压再次达到最高并趋于稳定时，通过改变外电阻大小进行mfc极化曲线和功率密度曲线的测试，如图5所示，最大功率密度达835.5mw/m2。
实施例3菌株eb-1同步产电和反硝化活性的研究
mfc按照实施例1中的(2)和(3)启动运行至电压输出稳定，最大功率密度达实施例2时，阳极液组分中固定乙酸钠浓度为1g/l(cod约为700mg/l)，其他的无机盐成分不变，通过改变阳极液中硝态氮的浓度分别为0、20、50、100和200mg/l，观察不同c/n比对菌株eb-1在mfc中电压输出和阳极反硝化反应的影响。
结果如图6所示，随着硝态氮浓度的升高，产电周期变短，但是最大输出电压几乎不变。该结果意味着菌株eb-1的电化学活性并未受硝态氮浓度而抑制，周期变短的主要原因是由于反硝化过程需要有机物提供电子供体因此消耗了阳极液中的乙酸钠，使得有效的电子输出降低，库伦效率下降。菌株eb-1在不同c/n比下，cod去除、硝态氮去除率及能量回收情况如表1所示，当c/n比大于7时，硝态氮去除率最高可达98.2％；而当c/n比小于3.5时，硝态氮去除率下降至82.8％，同时库伦效率(ce)仅为6.5％。因此，菌株eb-1还原硝态氮时与阳极共同竞争有机物氧化释放的电子。
表1
实施例4菌株eb-1利用不同碳源的产电特性及反硝化活性
mfc按照实施例1中的(2)和(3)启动运行至电压输出稳定，最大功率密度达实施例2时，更换阳极液，除改变碳源外，其他的组成成分不变。碳源分别选用甲酸、乳酸、丁酸、葡萄糖、蔗糖和淀粉。结果如图7所示，菌株eb-1能利用丁酸、葡萄糖、蔗糖和淀粉进行产电，但产电效率差别。而菌株对小分子酸如甲酸和乳酸的转化效率较低，几乎没有电压输出。本实施例公开的分支杆菌eb-1在双室空气阴极mfc中的产电特性，其目的为公开该菌株利用多种碳源尤其是大分子有机物的产电能力，意味着利用该菌株在处理实际废水中有巨大的应用潜力。
实施例5
本发明微生物燃料电池的一种实施例，本实施例的微生物燃料电池包括阳极室、阴极室和用于连接阳极室与阴极室的外电路，所述阳极室和阴极室由阳离子交换膜分隔开；
所述阳极室包括阳极、阳极液和作为阳极催化剂的菌株eb-1，所述阳极为碳毡，所述阳极液含有机物、无机盐培养基和硝态氮；所述有机物为乙酸钠、丁酸、葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少一种，所述无机盐培养基由下述浓度的组分组成：硝酸钾0.144～1.44g/l，二水合磷酸二氢钠0.8～8.1g/l，十二水合磷酸氢二钠2.1～22g/l，wolfes矿物溶液10ml/l，所述无机盐培养基由hcl/naoh溶液调节其ph值至7；其中wolfes矿物溶液由下述浓度的组分组成：氨基乙酸1.5g/l，mgso4·7h2o3g/l，mnso4·2h2o0.5g/l,nacl1.0g/l,feso4·7h2o0.1g/l,cocl20.1g/l,cacl20.1g/l,znso40.1g/l,cuso4·5h2o0.01g/l,alk(so4)20.01g/l,h3bo30.01g/l,na2moo4·2h2o0.01g/l,所述wolfes矿物溶液由koh调节其至ph值为7；
所述阴极室包括阴极和阴极液，所述阴极为pt/c催化的空气阴极，所述阴极液0.1mol/l的磷酸缓冲液。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。