本发明涉及分子生物学领域，更具体地涉及一种数字pcr芯片及其制备方法以及使用方法。
背景技术：
聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制。现已广泛应用到基因检测、基因扩增、基因工程等分子生物学领域，并且在临床医学、法医学、亲子鉴定以及环境检测等方面发挥着不可替代的作用。然而pcr反应以指数级扩增，在几十分钟内即可扩增百万倍，难于通过pcr产物确定原始pcr模板的含量。为了精确定量分析核酸含量，发明了数字pcr(digitalpcr，dpcr)技术。dpcr的基本原理是将一个样品等量稀释成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含零个或一个拷贝的目标分子(初始dna模板)，在每个反应单元中独立进行单个拷贝dna的pcr扩增，单独反应单元中扩增出的dna片段可以通过序列特异性探针分子发出的荧光显示。扩增结束后，包含目标分子的反应单元有荧光信号记为阳性，没有目标分子的反应单元则没有荧光信号的记为阴性，通过阳性比例即可计算初始样品中目标核酸模板的拷贝数。
dpcr技术主要分为两大类型：液滴式dpcr(droplet-baseddpcr，ddpcr)和微腔式dpcr(chamber-baseddpcr，cdpcr)技术。ddpcr采用油包水的液滴进行pcr反应，具有高通量、高灵敏度的检测优点，但一般需要液滴产生、收集、转移等复杂的操作流程和配套仪器，其商品化的产品成本过高，仪器庞大操作复杂，不利于产品推广和研究的普及。另外，所产生液滴的尺寸不稳定性还会影响检测结果的准确性。相比较而言，cdpcr平台上有固定大小的微腔存储样品液滴，使液滴大小相等，不会变化，确保了定量检测结果的准确性，而且随着技术的进步，微腔式pcr的通量也大为增高，能够满足一般需求。以微电子技术为基础的微流控技术促进了dpcr技术发展，微流控芯片的微型化、集成化、试剂低消耗、操作简便以及适用于现场检测等优点使dpcr技术得到了更大的发展空间。聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，pdms)具有透明、生物兼容性好、价值低、易于制作等特性，被广泛应用在dpcr上。
pdms是高分子聚合物，能够透过气体并且能存储一定量的空气，因此在cdpcr上可以通过外加正压将微腔内的气体挤出，实现液体微腔终端填充，也可以通过将pdms器件预先抽气，依靠pdms自身气体存贮能力造成的负压实现微腔终端填充。然而pdms的气体透过性带来了一个严重问题，因为它会造成pcr过程中水分的挥发损失。水分挥发会影响pcr反应，微腔体系越小，这一现象越明显。有研究者采用了在pcr反应微腔上方集成聚对二甲苯(parylene)等材料的防水层，但是进样必需的透气需求和防止水分蒸发的不透气需求形成矛盾，难以达到平衡，造成进样慢以及水分低速挥发等问题。pdms芯片的个体微腔体积必须足够大才能弥补水分丢失带来的影响，这样就降低了cdpcr的通量。此外防水层是构建在pdms层体中间，导致器件制备过程复杂。进样以后整体防水是另外一种选择，但增加了芯片使用操作的难度和时间，限制了临场快速应用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种数字pcr芯片及其制备方法以及使用方法，从而解决现有技术中的数字pcr芯片在必需的透气需求和防止水分蒸发的不透气需求二者之间难以达到平衡，造成进样慢以及水分低速挥发的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种数字pcr芯片，包括自下而上依次设置的：玻璃支撑层、密封层、反应层、空腔层以及防水层，其中，所述反应层与密封层通过键合在所述反应层与密封层之间形成主流道和通过所述主流道间隔开的多个独立的pcr反应腔室，所述空腔层与反应层通过键合在所述空腔层与反应层之间形成空腔，所述反应层、空腔层以及防水层还具有依次贯穿的进样口和出样口，所述空腔层和防水层具有依次贯穿的空腔层入口和空腔层出口；其中，所述密封层、反应层和空腔层由聚二甲基硅氧烷(pdms)制成，所述防水层由聚对二甲苯(parylene)制成。
所述多个独立的pcr反应腔室两两对称或相间排列布置于主流道的两侧，并与所述主流道贯通。
所述反应层包括多个主流道。
所述空腔层包括防止腔体坍塌的朝向所述反应层延伸的阵列式支撑柱结构。该支撑柱结构优选地可采用直径50～100微米，高50～100微米，间距200微米的阵列式圆柱体结构，但是应当理解的是，此处仅作为优选实施方式，并非限制。
所述密封层、反应层和空腔层通过不可逆的等离子体键合贴合在一起。
所述防水层上的进样口、出样口、空腔层入口以及空腔层出口均可通过紫外胶迅速封闭。
所述空腔层同时还提供向所述数字pcr芯片补水的功能，即同时具有形成空腔和补水的双重功能。
优选地，所述数字pcr芯片包括多个进样口和一个出样口。
本发明针对cdpcr芯片透气性与水分蒸发性造成的耗时长，芯片通量低的缺点，特别地在芯片内部增加空腔层，充分利用pdms的透气性，完成进样，进样后又通过抽气向空腔层补满缓冲液，确保芯片内达到饱和水蒸汽环境，同时在芯片外部施加高效的parylene防水层。做到透气层与防水层分开，而不受对方影响，各自发挥最大功效。
根据本发明的第二方面，提供一种如上所述的数字pcr芯片的制备方法，包括以下步骤：p1：清洗硅片，在该硅片上制作空腔层模具；p2：清洗硅片，在该硅片上制作反应层模具；p3：将聚二甲基硅氧烷溶液浇筑到空腔层模具上，制作出具有阵列式支撑柱结构的空腔层，并打孔，形成空腔层入口和空腔层出口；p4：将聚二甲基硅氧烷溶液浇筑到反应层模具上，制作出具有主流道和pcr反应腔室的反应层；p5：将所述空腔层和反应层经过等离子体处理键合，并打孔，形成进样口和出样口；p6：将聚二甲基硅氧烷溶液旋涂于载玻片上，烘烤形成密封层；p7：将步骤p5获得的键合在一起的空腔层和反应层与步骤p6获得的密封层一起等离子体处理键合；以及p8：将步骤p7中所得结构使用聚对二甲苯真空气相沉积系统进行聚对二甲苯沉积，在所述空腔层顶部形成防水层，制得数字pcr芯片。
应当理解的是，使用真空气相沉积实际上是在前面步骤所得结构的侧面、顶部以及底部均形成parylene防水层结构，但是由于最底层的玻璃支撑层的防水效果比parylene更好，所以底部的parylene层对于该数字pcr芯片并无必须存在的意义，仅仅是在生长过程中的自然生长而已，因此该数字pcr芯片的结构实际仅仅包括位于空腔层顶部的parylene防水层。
上述步骤p5和p7中的等离子体处理包括在80℃下烘烤1～2h实现永久键合。
根据本发明的第三方面，还提供一种如上所述的数字pcr芯片的使用方法，包括以下步骤：s1：使用移液枪自防水层的进样口滴加pcr反应液；s2：使用注射器经软管接头自防水层的出样口处向外抽气，引导pcr反应液流入反应层的主流道，直到部分pcr反应液自出样口流出；s3：封住空腔层入口，使用注射器自空腔层出口向外抽取空气，直到pcr反应液充满反应层的主流道和独立的pcr反应腔室；s4：迅速打开空腔层入口，然后自该空腔层入口滴加pcr缓冲液，使用注射器自空腔层出口向外抽取空气，直到pcr缓冲液充满空腔层与反应层之间的空腔；s5：吸掉进样口处的多余pcr反应液，并滴加石蜡油，在出样口处抽气，引导石蜡油填满反应层的整个主流道，完成对pcr反应腔室的隔离；s6：吸掉各出入口处的残余液体后，在防水层的各出入口滴加液体紫外胶，紫外光照固化紫外胶密封各出入口；s7：将密封后的上述数字pcr芯片放到pcr仪中反应；以及s8：检测荧光信号，计算pcr反应液中的核酸浓度。
本发明主要涉及一种充分利用pdms(聚二甲基硅氧烷)的透气性能，以及parylene(聚对二甲苯)的防水性能制成的高效数字pcr芯片。该数字pcr芯片相对现有技术的最主要的发明点在于，通过在pcr反应层的上方键合一个含有支撑柱的pdms空腔层，并在该pdms空腔层的上方沉积一个parylene防水层。当进行pcr进样时，使用普通一次性注射器在空腔层抽气，即可引导pcr反应液充满反应层的所有主流道以及pcr反应腔室；pcr进样完成后，向该空腔层充满水相补充液；parylene材料与紫外胶兼容，该数字pcr芯片的所有出入口均可使用紫外胶迅速密封。pcr反应过程中，由于parylene的防水性能，以及空腔层里面含有足够体量的水环境，因此能够在该数字pcr芯片内部保持饱和水蒸气环境，使pcr反应腔室内的水蒸发降低到可忽略程度。
根据本发明提供的一种数字pcr芯片及其制备方法以及使用方法，相对现有技术具有以下显著的有益效果：
1)操作简单：不依赖泵、阀等复杂设备，芯片进样只需要普通一次性针筒注射器，防水层上各出入口的封装也只需要简单紫外光照即可完成；
2)速度快：最大程度的利用了pdms的透气性能，pdms隔层只有10～100微米厚，确保快速进样，并能尽量减少管道内气体残留，parylene外壳使得芯片封装极为便捷；
3)通量高：内部增加了pdms空腔层，外部增加了parylene防水层，因此pcr反应腔内水分损失可以忽略不计，因此反应腔室体积可以做的更小，单位面积芯片可以制作更多的反应腔，增加芯片整体通量；
4)自动化程度高、造价低廉：本芯片厚度小，总体需要pdms少，芯片打孔方便，parylene层由仪器生长，易于批量制造。
总之，根据本发明，提供了一种操作简单的、速度快的、通量高的、自动化程度高的、造价低廉的数字pcr芯片。
附图说明
图1是根据本发明的一个优选实施例提供的数字pcr芯片的五层结构示意图；
图2是如图1所示数字pcr芯片在不同进样阶段从顶部往下观察所得的显微图片。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例
人血浆dna纯化物egfr外显子定量
数字pcr芯片的制作
(1)清洗硅片：使用piranha溶液清洗硅片，再用去离子水冲洗干净，氮气吹干，并在180℃热板上烘烤30分钟。
(2)空腔层su8模具制作：硅片在180℃热板上烘烤30分钟，再等离子体处理1分钟，然后旋涂su83050(100μm)，进行光刻、显影，制作出阵列支撑微柱作为空腔层的模具。
(3)反应层su8模具制作：硅片在180℃热板上烘烤30分钟，再等离子体处理1分钟，然后旋涂su83005(10μm)，进行光刻、显影，制作出反应腔层反应腔与主流道的联通支管。170℃热板上烘烤30分钟，再等离子体处理1分钟，然后旋涂su83025(25μm)，进行光刻、显影，制作出反应腔体以及主流道模具。
(4)pdms空腔层制作：采用道康宁sylgard184pdms，将前聚体和固化剂按照质量比10:1的比例混合均匀，并用真空脱气法除去混合液中的气泡，然后将溶液浇注在具有图形结构的空腔层模具上，80℃热板上烘烤40分钟后，将固化的pdms膜片从模具上揭下后切割并打孔。
(5)pdms反应层制作：将sylgard184pdms溶液浇注在具有图形结构的反应层模具上，1000rpm旋涂，后80℃热板上烘烤15分钟后。
(6)pdms空腔层、反应层键合，先用等离子体处理两个pdms层表面，然后在显微镜下对准图形使pdms键合
(7)80℃热板上烘烤对准了的芯片1小时，实现两层pdms之间的永久键合。
(8)将固化的pdms膜片从模具上揭下并打孔。
(9)将sylgard184pdms溶液3000rpm旋涂在载玻片上，80℃热板上烘烤15分钟后。
(10)步骤(8)步骤(9)的pdms表面经等离子体处理后键合在一起并80℃热板上烘烤2小时，实现pdms之间的永久键合。
(11)整个芯片使用parylene沉积系统生长3μm厚parylene防水层，至此，获得一种数字pcr芯片。
数字pcr芯片的结构说明
如图1所示，该数字pcr芯片包括自下而上依次设置的：玻璃支撑层1、密封层2、反应层3、空腔层4以及防水层5，其中，反应层3包括主流道31和通过主流道31间隔开的多个独立的pcr反应腔室32，空腔层4与反应层3之间构成空腔，反应层3、空腔层4以及防水层5还具有依次贯穿的进样口33和出样口34，空腔层4和防水层5具有依次贯穿的空腔层入口41和空腔层出口42；其中，密封层2、反应层3和空腔层4由聚二甲基硅氧烷(pdms)制成，防水层5由聚对二甲苯(parylene)制成。
特别是结合图2所示，该反应层3可包括多个主流道31，多个独立的、圆形的pcr反应腔室32两两对称布置于主流道31的两侧，并与主流道31贯通。应当理解的是，此处仅作为举例而非限制，pcr反应腔室32并不仅限于两两对称，实际还可以是相间排列于主流道31的两侧。
空腔层4包括防止腔体坍塌的朝向反应层3延伸的阵列式支撑柱结构43。
密封层2、反应层3和空腔层4通过不可逆的等离子体键合贴合在一起。
防水层5上的进样口33、出样口34、空腔层入口41以及空腔层出口42均可通过紫外胶迅速封闭。
当向空腔层4中填充pcr缓冲液或者其他水相溶液时，空腔层4同时还提供向整个数字pcr芯片补水的功能，即同时具有形成空腔和补水的双重功能。
优选地，该数字pcr芯片包括多个进样口33和一个出样口34，如图1中所示，作为举例而非限制地，为四个进样口。
pcr反应体系：
10μlpcr反应体系：400nmol/l引物(包括：正向引物5’-atcccagaaggtgagaaagt-3’；反向引物5’-tgtggagatgagcagggtct-3’)；250nmol/lmgb水解探针5’hex-aagccaacaaggaaatc-mgb3’以及1μldna模板。
数字pcr：
1)使用移液器在每个进样口33处滴加pcr反应液10。
2)使用注射器经软管接头抽出样口34，引导pcr反应液10流入反应层3的主流道31，如图2中的a所示，直到部分pcr反应液10流出出样口34。
3)封住空腔层入口41，比如盖上一块pdms胶布，使用注射器自空腔层出口42处向外抽取空气，直到pcr反应液10进一步充满反应层3的各pcr反应腔室32，如图2中的b所示。
4)通过移开pdms胶布迅速打开空腔层入口41，然后滴加pcr缓冲液20，该pcr缓冲液20相比pcr反应液10不含dna模板、dntp等物质，其作用是补充pcr反应水分蒸发，直到pcr缓冲液20充满空腔层4与反应层3之间的空腔，如图2中的c所示。
5)吸掉进样口33处多余的pcr反应液10，并滴加pcr级石蜡油30，在出样口34处向外抽气，引导石蜡油30填满反应层3的整个主流道31，完成对pcr反应腔室32的隔离，如图2中的d所示。
6)用吸水纸吸掉各出入口处的残余液体后，在各出入口滴加液体紫外胶，紫外光照固化紫外胶密封各出入口。
7)将密封后的芯片放到pcr仪反应。
8)检测荧光信号，计算pcr反应液中核酸浓度。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
序列表
<110>中国科学院上海微系统与信息技术研究所
<120>一种数字pcr芯片及其制备方法以及使用方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>misc_feature
<223>人工序列描述：合成引物(descriptionofartificialsequence:syntheticprimer)
<400>1
atcccagaaggtgagaaagt20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>misc_feature
<223>人工序列描述：合成引物(descriptionofartificialsequence:syntheticprimer)
<400>2
tgtggagatgagcagggtct20
<210>3
<211>17
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>misc_feature
<223>人工序列描述：水解探针(descriptionofartificialsequence:hydrolysisprobes)
<400>3
aagccaacaaggaaatc17