本发明涉及生物技术领域，更具体地说涉及一种用保幼激素基因检测昆虫产卵量的应用及方法。
背景技术：
害虫生物防治在农林业可持续发展及绿色植保中发挥着重要的作用。大草蛉是一种非常优良的天敌资源，在自然界对多种害虫种群数量的消长有显著的控制效果，其主要捕食蚜虫、粉虱、螨类、小型鳞翅目幼虫、蓟马、介壳虫和斑潜蝇幼虫等，具有广泛而深远的应用前景。大量繁殖获得高品质的大草蛉是其成功应用于生物防治的重要条件。
目前国际上已实现多种草蛉的商品化生产，通过降低生产成本实现利润最大化是天敌昆虫规模化及商品化生产中极为关键的因素。采用较为经济的室内人工繁殖方法如利用不同的昆虫(替代)猎物、含昆虫成分的人工饲料和不含昆虫成分的人工饲料大量繁殖大草蛉，具有易获得、高繁殖系数、高整齐度和低成本等优点，势必能够大幅度节省生产成本，提高天敌昆虫生防利用率。值得注意的是不同食物繁殖生产的大草蛉生物学特性参差不齐，释放于田间后其生防效果相差各异。
大草蛉成虫产卵量是评价天敌昆虫生物学特性的重要参考指标，高产卵量的大草蛉种群增长快，倍增时间短，能在短时间内有效控制害虫种群数量的增长，降低防治成本，提高其生防效果。相反，低产卵量的大草蛉种群，其生命周期内种群扩增能力及捕食量降低，为保障害虫种群数量控制在一定水平，需要额外加大天敌昆虫释放量，大大增加了防治成本，减少了利润。目前，较为传统的评估不同食物饲喂或不同商家来源的大草蛉产品成虫产卵量的方法为检测基于其整个成虫期或人为设定时间段内产卵量的多少，耗时费力且高经济投入，因此，亟待寻求一种快速且经济的方法检测天敌昆虫商品重要生物学特性-产卵量的方法。
研究发现在大多数昆虫体内，保幼激素起到诱导卵黄原蛋白的合成以及信息素的生成等作用，如对滞育七星瓢虫和玉米螟施用外源保幼激素类似物均能促使其卵黄沉积进而产卵。
研究发现，昆虫体内保幼激素水平是昆虫综合生殖能力的最直接体现，在大多数昆虫体内保幼激素水平的总体季节变化规律波动较小，平均水平比较稳定。所以，通过检测昆虫体内保幼激素水平来检测并评估不同种群的昆虫的综合生殖能力(具体为产卵量)的方法较为稳定可靠。
技术实现要素：
本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种用保幼激素基因检测昆虫产卵量的应用，可通过检测保幼激素基因的表达量来检测并评估不同种群的昆虫产卵量，主要针对不同食物营养源的大草蛉成虫的产卵量；另一个目的是提供一种用保幼激素基因检测昆虫产卵量的方法，可以快速检测并评估昆虫产卵量。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
检测保幼激素基因表达量在评估昆虫产卵量中的应用；所述保幼激素基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。
进一步，所述昆虫包括昆虫个体或昆虫种群；所述昆虫种群为取食不同食物的昆虫种群；所述保幼激素基因编码的蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列2，或序列表中序列1自5’末端第52-645位核苷酸编码的215个氨基酸序列；所述昆虫具体为大草蛉成虫。
进一步，所述用于检测保幼激素编码基因的表达量的物质为如下1)-3)中任意一种：
1)引物对a由引物1和引物2组成；所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列3；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4；
2)含有所述引物对a的qrt-pcr反应体系；
3)含有所述引物对a或所述qrt-pcr反应体系包含的所有试剂及试剂盒。
进一步，所述qrt-pcr反应体系由qrt-pcr扩增缓冲液mix体系、dntp、cdna、由所述引物1作为的上游引物、由所述引物2作为的下游引物、去离子水、荧光染料组成；
所述上游引物、所述下游引物在上述qrt-pcr反应体系中的终浓度均为8-10μm。
进一步，所述qrt-pcr反应体系还包括内参引物对b；所述内参引物对b由引物3和引物4组成；所述引物3的核苷酸序列为序列表中序列6；所述引物4核苷酸序列为序列表中序列7。
一种用于检测保幼激素编码基因的表达量的qrt-pcr反应体系，所述qrt-pcr反应体系由引物对a、qrt-pcr扩增缓冲液mix体系、dntp、cdna、去离子水、荧光染料组成；
所述引物对a由引物1和引物2组成，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列3；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4；
所述引物1作为该反应体系的上游引物、所述引物2作为该反应体系的下游引物，所述上游引物、所述下游引物在上述qrt-pcr反应体系中的终浓度均为8-10μm。
进一步，所述qrt-pcr反应体系还包括内参引物对b；所述内参引物对b由引物3和引物4组成；所述引物3的核苷酸序列为序列表中序列6；所述引物4核苷酸序列为序列表中序列7。
一种用于检测保幼激素编码基因的表达量的试剂盒，包括引物对a或包含qrt-pcr反应体系所有试剂。
进一步，所述引物对a由引物1和引物2组成；所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列3；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4。
进一步，所述qrt-pcr反应体系由所述引物对a、qrt-pcr扩增缓冲液mix体系、dntp、cdna、去离子水、荧光染料组成；
所述引物对a由引物1和引物2组成；所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列3；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4；
所述引物1作为的上游引物、所述引物2作为的下游引物，所述上游引物、所述下游引物在上述qrt-pcr反应体系中的终浓度均为8-10μm。
进一步，所述qrt-pcr反应体系还包括内参引物对b；所述内参引物对b由引物3和引物4组成；所述引物3的核苷酸序列为序列表中序列6；所述引物4核苷酸序列为序列表中序列7。
一种用保幼激素基因检测昆虫产卵量的方法，包括如下步骤：
第一步，用引物对a或qrt-pcr反应体系或试剂盒对待测的昆虫进行qrt-pcr扩增；
第二步，对比所述待测昆虫的保幼激素基因的表达量；
上述方法中所述昆虫一般为昆虫个体或昆虫种群；
所述试剂盒含有所述引物对a或所述qrt-pcr反应体系包含的所有试剂。
进一步，所述引物对a由引物1和引物2组成，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列3；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4。
进一步，所述qrt-pcr反应体系由引物对a、qrt-pcr扩增缓冲液mix体系、dntp、cdna、去离子水、荧光染料组成；
所述引物对a由引物1和引物2组成；所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列3；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4；
所述引物1作为上游引物、所述引物2作为下游引物，所述上游引物、所述下游引物在上述qrt-pcr反应体系中的终浓度均为8-10μm。
进一步，所述qrt-pcr反应体系还包括内参引物对b，所述内参引物对b由引物3和引物4组成；所述引物3的核苷酸序列为序列表中序列6；所述引物4核苷酸序列为序列表中序列7。
进一步，所述qrt-pcr扩增的模板为昆虫cdna；所述昆虫为大草蛉。
一种蛋白或其编码基因，
所述编码蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2；
所述编码蛋白的核苷酸序列为序列表中序列1
本发明的有益效果为：
昆虫体内保幼激素水平是昆虫综合生殖能力的最直接体现，并且在大多数昆虫体内保幼激素水平的总体季节变化规律波动较小，平均水平比较稳定，通过检测昆虫体内保幼激素水平来检测并评估不同种群的昆虫的综合生殖能力的方法稳定可靠；
本发明所提供的检测方法可通过检测保幼激素基因的表达量来检测并评估不同种群的昆虫产卵量，主要针对不同食物营养源的大草蛉成虫的产卵量；
本发明的试验证明，本发明所提供的检测方法可通过检测保幼激素基因的表达量来检测并评估不同种群的昆虫产卵量，主要针对不同食物营养源的大草蛉成虫产卵量。试验证明用本方法提供的方法检测昆虫产卵量仅需2-3天，而用传统的生物学方法需要30-60天。本发明所采用的检测方法简单易行、材料易获得且操作便捷，是一种极为经济实用的适于商品化昆虫产品检验检测的方法。
附图说明
图1为大草蛉内参基因actin的扩增曲线；
图2为大草蛉内参基因actin的熔解曲线；
图3为大草蛉保幼激素基因的扩增曲线；
图4为大草蛉保幼激素基因的熔解曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
下述实施例中所有试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所有试剂、材料等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：昆虫保幼激素编码基因的鉴定及其qrt-pcr专用引物的设计
研究表明在大多数昆虫体内，保幼激素起到诱导卵黄原蛋白的合成以及信息素的生成等作用，如对滞育七星瓢虫和玉米螟施用外源保幼激素类似物均能促使其卵黄沉积进而产卵，是一种检测昆虫产卵量的很好的分子标记。因此，本发明利用大草蛉保幼激素基因的表达量来检测并评估其产卵量。
大草蛉(chrysopapallens(rambur)(neuroptera:chrysopidae))保幼激素(juvenilehormone,jh)基因的核苷酸序列为序列表中序列1，其编码的蛋白质的氨基酸序列为序列表中的序列2。
针对大草蛉保幼激素基因用于qrt-pcr扩增而设计的专用引物如下：
上游引物：5’-ccgtatctagcaaacggtatacc-3’(序列3)
下游引物：5’-gttaatgatactcgatatcc-3’(序列4)
实施例2：保幼激素基因在检测大草蛉产卵量中的应用
试验中所用大草蛉(chrysopapallens(rambur)(neuroptera:chrysopidae)，公众可由中国农业科学院植物保护研究所获得)根据取食猎物和人工饲料分为两组，分别记为昆虫a和昆虫b；各组30-36对，分3次重复；
取食猎物的大草蛉(昆虫a)：饲喂猎物的大草蛉饲养条件为温度(26±1)℃，相对湿度(70±5)％，光周期l:d＝16h：8h。每对雌、雄成虫每天饲喂一定量大豆蚜虫，试验至大草蛉成虫个体自然死亡截止。
取食人工饲料的大草蛉(昆虫b)：饲喂人工饲料的大草蛉饲养条件为温度(26±1)℃，相对湿度(70±5)％，光周期l:d＝16h：8h。每对雌、雄成虫每日饲喂15-20mg粉状饲料，试验至大草蛉成虫个体自然死亡截止。
猎物(大豆蚜虫(aphisglycinesmatsumura))室内以大豆(glycinemaxl.,品种为化诱5号)苗为寄主，建立稳定种群供试验所用；
人工饲料配方组成为家蝇蝇蛆脱脂粉10g，全鸡蛋粉(干粉)4g，茶花粉(干粉)2g，蔗糖粉(干粉)2g。
一、大草蛉cdna的合成
1、大草蛉rna的提取
采用svtotalrnaisolationsystemkit(promega,madison,wi,usa)试剂盒提取rna，步骤如下：
(1)将各组大草蛉样品放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨之后，加入1ml的rnalysisbuffer(实验用之前加入β-mercaptoethanol)。
(2)用rna-free枪头将上述裂解液转移至新的1.5mlrnase-free离心管中，上下充分混匀，室温静置反应5min.
(3)加入350μl的rnadilutionbuffer(rda,blue)。前后震荡,充分混匀。
(4)70℃加热2min.
(5)常温,12000rpm,离心10min.将上清液转移至新的1.5ml离心管中。
(6)加200μl95％的乙醇至(5)中的离心管中,用枪轻轻的打匀。
(7)转移(6)中的上清液至离心柱(spincolumns)中,离心柱置于2ml无盖收集管(collectiontubes)上。
(8)常温,12000rpm,离心1min.弃滤液。
(9)往离心柱(spincolumns)中加入600μl的rnawashsolution(实验用之前加入100ml95％的乙醇)。
(10)常温,12000rpm,离心1min.弃滤液。
(11)配制dnaseincubationmix.具体方法：向rnase-free200μl的pcr管中依次加入yellowcorebuffer40μl,mncl25μl,dnasei5μl，用枪轻轻的混匀。
(12)将上述配好的dnaseincubationmix50μl加入到离心柱(spincolumns)膜的正中央。室温反应15min.
(13)向离心柱正中央加200μldnasestopsolution(实验用之前加入8ml95％的乙醇)。
(14)常温,12000rpm,离心1min.弃滤液。
(15)向离心柱正中央加600μlrnawashsolution,常温,12000rpm,离心1min.弃滤液。
(16)向离心柱正中央加250μlrnawashsolution,常温,12000rpm,离心2min.
(17)将离心柱转移至洗脱管(elutiontubes)中准备收集rna。
(18)向离心柱正中央加100μlnuclease-freewater。常温,12000rpm,离心2min.
(19)重复步骤(18)以提高rna的洗脱效率。
(20)电泳检测所提rna的完整性。
(21)nanodropnd-1000分光光度计测定260/280比值。
2、反转录
反转录采用thermoscientifictmrevertaidtmfirststrandcdnasyinthesiskit(thermo)试剂盒。在反转录之前，用rq1rnase-freednase(promega,madison,usa)去除残留的基因组dna
ⅰ基因组dna的去除：
(1)将下列试剂按照规定体积加入离心管中，见表1：
表1各组分加入体积
将离心管置于37℃温浴30min；
(2)加1μlrq1dnase于上述离心管中终止反应
(3)65℃，10min激活dnase
(4)至此，rna样品已去除基因组dna，可以用于下一步qrt-pcr反应中。
ⅱ第一链cdna的合成(20μl反转录反应体系)：
(1)将下列试剂按照规定体积加入离心管中，见表2：
表2各组分加入体积
(2)将下列试剂按照顺序依次加入上述反应管中，见表3：
表3各组分加入表2对应的离心管
(3)简短离心混匀
(4)42℃温浴60min
(5)70℃，5min终止反应。反应结束后cdna第一链低温保存或直接用于下一步pcr反应。
二、qrt-pcr扩增
qrt-pcr扩增反应体系各组分体积见表4，反应程序见表5：
表4荧光定量qrt-pcr反应体系
表5荧光定量qrt-pcr反应程序
以大草蛉actin(genbankkc505163，序列5)基因作为内参基因，扩增引物如下：
内参上游引物：5’-tccagaagaacacccaatcc-3’(序列6)
内参下游引物：5’-atacaccatcaccagagtcaagt-3’(序列7)。
若取食昆虫猎物的大草蛉组中保幼激素基因的平均表达量显著高于取食人工饲料的大草蛉组，则前者产卵量高于后者。
qrt-pcr结果如图1-4所示，图1为2组大草蛉内参基因的扩增曲线；图2为2组大草蛉内参基因的熔解曲线；图3为2组大草蛉保幼激素基因的扩增曲线；图4为2组大草蛉保幼激素基因的熔解曲线，结果显示扩增曲线平滑，重复性较好；熔解曲线呈现单一峰值，表示无非特异性扩增，荧光定量结果准确。
qrt-pcr中各处理组大草蛉内参基因的ct值见表6：
表6各处理组大草蛉内参基因actin的ct值
qrt-pcr中各处理组大草蛉卵黄原蛋白受体基因的表达量见表7：
表7各处理组大草蛉保幼激素基因表达量
上述结果显示，取食昆虫猎物的大草蛉组保幼激素基因的表达量显著高于取食人工饲料的大草蛉组，推测取食昆虫猎物的大草蛉组产卵量高于取食人工饲料的大草蛉组。
通过传统生物学方法，即每日按照所述实施例中的方法饲喂上述2组大草蛉，每天观察记录，直至大草蛉成虫个体自然死亡截止，计算分别饲喂昆虫猎物和人工饲料的2组大草蛉的产卵量分别为1010.00±90.62粒和262.90±32.54粒，结果证明本发明中的检测结果与传统方法检测结果相一致，表明本发明中的检测方法正确。
结果表明，可以采用本发明中所述的检测方法既经济又快速检测不同营养源大草蛉的保幼激素基因的表达量，进一步明确不同营养源或不同商品化来源的草蛉产卵量的高低。
本发明中所述保幼激素基因的表达量可以作为分子标记检测并评估不同营养源的大草蛉种群产卵量；包含用于扩增保幼激素基因的特异性引物或上述qrt-pcr反应体系包含的试剂及试剂盒均可作为检测不同营养源大草蛉产卵量的试剂。
不同营养源大草蛉rna提取试剂盒、离心柱吸附及rna纯化方法也是本发明保护的范围。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110>中国农业科学院植物保护研究所
<120>一种用保幼激素基因检测昆虫产卵量的应用及方法
<130>2010
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>698
<212>dna
<213>人工序列()
<400>1
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