一种用于筛查Vel阴性血型基因的PCR-SSP的方法及试剂与流程

本发明涉及基因分型检测方法，具体是一种用于筛查vel阴性血型基因的pcr-ssp的方法及试剂。

背景技术：

vel血型是2013年新近命名的第34个血型系统，该系统只有一种抗原vel，vel表达于绝大多数红细胞表面，vel表达阴性(vel-)为稀有表型。抗-vel可导致严重的血管内溶血反应和新生儿溶血病。研究发现，抗原vel由位于1号染色体的smim1编码表达，该基因含有4个外显子，其中编码区位于第3、4外显子，当第3外显子发生c.64_80连续17个核苷酸的纯合缺失突变时，蛋白翻译的读码框发生改变使得翻译过程提前终止，血型蛋白smim1不表达，产生vel-稀有表型。当第3外显子发生17个核苷酸的杂合缺失突变时，由于vel抗原的表达量也受到第2内含子中snprs1175550的调控，vel抗原的表达量存在很大幅度的差异，有的接近正常vel+，有的则表达量极低近乎vel-。

目前国际上关于vel血型血清学研究所使用的抗体主要来自因输血或者怀孕体内产生了抗体的vel-个体，用vel+的红细胞经吸收、放散、纯化后才可用于血清学筛查；而且来自不同个体的抗血清其效价和活性也相差很大，给血清学筛查带来了诸多不便和不稳定因素。对于杂合缺失个体因vel抗原表达量复杂各异则容易造成假阴性的筛查结果。vel-表型产生的分子机制单一、明确，因此采用基因分型的方法针对c.64_80del等位基因进行pcr-ssp可避开经典血清学的不足之处。

国外报道的vel-的比例较低，其中欧洲地区约1/4000，高加索地区约1/5000，德国vel-比例约在1/2000，瑞典北部vel-个体的比例稍高，约为1/1762。我国关于vel血型的研究很少，参照国际上vel-的比例，要寻找vel-稀有个体可能需要大规模的筛查样本，也就意味着巨大的时间和经济成本。因此，根据vel-产生的特殊的分子机制，结合巧妙的引物设计，发明了一种适用于稀有血型大规模筛查的实验方法，即将一定数量的基因组dna标本汇集在一起，作为一个模板，在一个pcr-ssp反应中进行检测，再通过两种引物的结合使用对有反应性汇集中的单个标本拆分检测，以进一步分析和判定其基因型。此发明可大大降低筛查工作所需的时间和经济成本，提高筛查效率，相对于经典的血清学更加高效和便捷，可推广应用于实验室及临床vel血型以及具有类似分子机制的稀有血型的鉴定。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于筛查vel阴性血型基因的pcr-ssp的方法及试剂，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于筛查vel阴性血型基因的pcr-ssp的方法，包括以下步骤：

1)制备基因组dna作为随机待检标本；

2)合成vel-对照品质粒pvel-：选取smim1c.64_80纯合缺失突变序列插入载体质粒puc57-simple进行合成制得；

3)调节对照品质粒pvel-的使用浓度，使对照品质粒pvel-与随机待检标本所含模板的摩尔数在同一数量级；

4)针对smim1野生型和smim1c.64_80缺失突变序列分别设计并合成特异性扩增引物，分别命名为+p和-p；

5)确定最适样本汇集数(n)：将不同数量(1，3，5，......n-1)的随机待检标本与对照品质粒pvel-汇集，分别模拟2样、4样、6样......n样汇集，使用-p进行pcr-ssp，采用琼脂糖凝胶检测扩增结果；根据扩增效果，并结合参与汇集的单个随机标本的dna浓度，选定最适的汇集标本数；

6)将基因组dna标本每n样进行汇集，使用-p进行pcr-ssp；对照品质粒pvel-作为实验体系的质控品以及vel-个体的阳性对照同时被扩增；

7)对步骤6)中扩增出现特异性目的条带的汇集，即有反应性汇集，进行拆分检测；使用+p和-p两种引物分别扩增有反应性汇集中的单个标本，根据反应格局判断汇集中每个标本的基因型为野生型、杂合缺失突变序列或纯合缺失突变序列；

8)对杂合缺失突变序列或纯合缺失突变序列进行基因测序分析鉴定基因型。

作为本发明进一步的方案：所述步骤2)中，所选smim1c.64_80纯合缺失突变序列如序列表中seqidno：1所示。

作为本发明进一步的方案：所述步骤3)中，对照品质粒pvel-浓度调整如下：

载体质粒puc57-simple大小为2710bp，插入smim1c.64_80纯合缺失突变序列后合成的对照品质粒pvel-共计3318bp，对照品质粒pvel-浓度为1ng/μl；基因组dna长度为3×10⁹bp，经nanodrop2000测定基因组dna平均浓度数量级在100ng，故相同体积的两种模板其所含有效模板的摩尔数相差10000倍，因此使用对照质粒与随机标本模拟汇集时，应将质粒再稀释10000倍使用。

扩增反应体系及反应条件如下：

pcr反应体系：25μl体系，含5×buffer5μl，25mmmgcl21.6μl，2.5mmeach的dntp2μl，gotaqdna聚合酶1u，上下游扩增引物(10mm)各0.5μl，dna模板100ng；pcr反应程序：95℃3min；95℃45s，61℃45s，72℃30s，30个循环；72℃5min；4℃保存。

作为本发明进一步的方案：所述步骤4)中，+p引物序列如序列表中seqidno：2、seqidno：3所示；-p引物序列如序列表中seqidno：4、seqidno：5所示。

作为本发明进一步的方案：所述步骤7)中，反应格局有如下几种情况：若随机待检标本只有经+p扩增时出现特异性目的条带，则该随机待检标本smim1为野生型序列，表型为vel+；若随机待检标本只有经-p扩增时出现特异性目的条带，则该随机待检标本smim1为c.64_80纯合缺失序列，表型为vel-；若随机待检标本经+p和-p扩增时均出现特异性目的条带，则该随机待检标本smim1同时含有野生型和缺失突变序列，即为杂合缺失突变，表型可能为vel+^w，即弱vel。

作为本发明进一步的方案：所述步骤8)中所使用的测序引物序列如序列表中seqidno：6、seqidno：7所示。

pcr-ssp反应的体系：25μl体系，含5×buffer5μl，25mmmgcl21.6μl，2.5mmeach的dntp2μl，gotaqdna聚合酶1u，上下游扩增引物(10mm)各0.5μl，dna模板100ng；反应条件为：95℃3min；95℃45s，60℃45s，72℃1min，30个循环；72℃5min；4℃保存。

一种用于筛查vel阴性血型基因的试剂，包括：对照品质粒pvel-与特异性扩增引物，其中，对照品质粒pvel-是选取smim1c.64_80纯合缺失突变序列插入载体质粒puc57-simple进行合成制得；特异性扩增引物包括+p引物与-p引物，+p引物序列如序列表中seqidno：2、seqidno：3所示；-p引物序列如序列表中seqidno：4、seqidno：5所示。

作为本发明进一步的方案：所选smim1c.64_80纯合缺失突变序列如序列表中seqidno：1所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明采用汇集方法实现高效和准确地鉴定随机待检标本的vel血型基因型依赖于两组引物的结合使用。首先用缺失突变序列特异的-p扩增汇集标本(每n个标本汇集)，由于缺失突变序列为稀有序列，那么出现特异性目的条带的有反应性汇集是少数，此过程即可将筛查工作的时间和经济成本降低n倍。针对有反应性的汇集，则同时用+p和-p分别扩增汇集中的每一个标本，可判定每个标本vel血型的基因型。本发明可明显提高稀有血型大规模筛查工作的效率，节省实验成本。

附图说明

图1为本发明中+p和-p两种引物特异性验证结果。

图2为本发明中确定最适汇集样本数的pcr-ssp琼脂糖凝胶电泳图。

图3为本发明中用-p引物扩增汇集标本。

图4为本发明中使用+p、-p两种引物拆分检测有反应性汇集。

图5为本发明中使用基因测序技术验证被检标本的基因型正向测序结果图。

图6为本发明中使用基因测序技术验证被检标本的基因型反向测序结果图。

图7是本发明方法流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明要解决的技术问题之一是提供一种高效率的稀有血型基因筛查方法，用于vel-以及具有相似分子机制的稀有血型基因的筛查，可大大降低筛查工作的时间及经济成本，提高筛查效率。本发明中另外一个需要解决的问题是如何对有反应性汇集进行拆分检测。为此，设计了上述两对引物，通过单独使用-p引物扩增汇集标本提高大规模筛查工作的效率；通过两对引物的结合使用，实现对有反应性汇集标本的准确、特异的检测。具体情况结合实施例进行说明。

实施例1

本发明实施例中，利用健康献血者的edta-抗凝外周静脉血样，筛查vel-稀有血型基因型。现以80例血样的筛查过程为例进行详细说明。

1.从献血者edta-抗凝血样中富集白细胞膜层，制备基因组dna。取富含白细胞的血样约200μl，按照原平皓全血基因组dna提取试剂盒说明书制备基因组dna，利用nanodrop2000测定其浓度和纯度，-20℃保存待用。

2.合成对照品质粒pvel-。选取smim1c.64_80纯合缺失突变序列(608bp，序列见前述)插入载体质粒puc57-simple，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。配制成1ng/μl原液后，稀释10000倍使用。

3.针对smim1野生型和c.64_80缺失突变序列分别设计并合成特异性扩增引物，文中分别用+p和-p表示。使用前对两组引物进行特异性验证。如图1所示，随机选取10个随机待检标本的基因组dna与对照品质粒pvel-，分别用+p和-p进行pcr-ssp。其中对照品质粒pvel-作为实验体系正常运行的内部质控以及vel-个体的阳性对照。图1结果显示，+p可特异性扩增1-10随机标本，而不能扩增对照品质粒pvel-；相反，-p可特异性扩增对照品质粒pvel-，而不能扩增1-10随机标本。由此得出结论，1-10随机待检标本smim1无缺失突变；+p和-p可分别特异扩增smim1野生型序列和smim1c.64_80缺失突变序列。

4.确定最适标本汇集数。将对照品质粒pvel-分别与1个、3个、5个、7个随机待检标本汇集在一起，分别模拟2样、4样、6样和8样汇集。使用-p进行pcr-ssp。琼脂糖凝胶检测扩增结果。如图2所示，-p可特异扩增对照品质粒pvel-，任选1、3、5、7个随机待检标本与对照品质粒pvel-的汇集，也均被特异性扩增。根据所测得的基因组dna样本的平均浓度(≥100ng/μl)，选用“+3”，即4样汇集，可保证每个参与汇集标本的模板有效浓度≥50ng/μl，能够保证在高效筛选的同时不漏检任何一个低浓度vel-标本。图2显示6样汇集和8样汇集也可有效检测vel-标本，考虑到单个随机待检标本的浓度(若在100ng/μl左右时)，8样汇集时该随机待检标本参与汇集的模板量约在25ng，那么可能会因为有效模板浓度太低而被漏检。因此，结合随机待检标本的dna浓度以及上述模拟汇集的扩增效果，最终确定4样汇集为最适汇集标本数。对于少数浓度偏低的标本，则根据其浓度大小调整汇集数，选用3样或2样汇集，保证每个参与汇集的随机待检标本具备足够的模板浓度，可被-p特异扩增检测到。

5.将80例献血者的基因组dna每4样汇集成一份作为一个模板，共计20个汇集标本，使用-p进行pcr-ssp扩增，对照品质粒pvel-作为实验体系的质控对照。图3中筛查结果显示，除4号汇集外，1-20号汇集标本经-p扩增均未见特异性目的条带，即参与汇集的所有标本中均不含c.64_80缺失突变序列，即全部标本为vel+。4号汇集经-p扩增可见特异性目的条带，即含缺失突变序列，说明4号汇集中的4个随机待检标本中至少有一例含c.64_80缺失突变序列。其中420bp是内参对照hgf(人生长因子)的pcr产物。

6.使用+p和-p两组引物对4号汇集中的4个单独的标本进行拆分检测。4个参与汇集的随机待检标本依次编号为41、42、43、44。如图4中参与汇集的41、42、44仅可被+p特异扩增，目的条带为267bp。参与汇集的“43”可同时被+p和-p引物扩增，即43同时含有smim1野生型序列及c.64_80缺失突变序列，则可判定43为smim1c.64_80杂合缺失标本，其表型可能为vel+^w。相应地，若43只在被-p扩增时出现特异性目的条带，而+p扩增时无目的条带出现，那么43则为smim1c.64_80纯合缺失突变个体，表型为vel-。

7.基因测序分析确证43基因型。

采用sanger双脱氧测序对筛查到的43进行双向测序分析。图5为正向测序结果，结果显示序列在112位开始出现双峰，经blast比对，112位对应smim1(ng_033869.1)的7677位。smim1蛋白编码区(cds)起始于7614位，7677即为cds的第64位。反向测序结果(图6)显示双峰终止于167位(图中显示为164位，因smim1序列不管缺失与否末尾均为g-t-c，故165166167三位为特异单峰)，对应smim1的7693位，7693为cds区域的第80位。综合序列比对结果，得出该序列为cds区域64_80连续17个核苷酸缺失，且为杂合缺失突变序列。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110>刘衍春刘太香孙俊

<120>一种用于筛查vel阴性血型基因的pcr-ssp的方法及试剂

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>724

<212>dna

<213>脱氧核糖核酸(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

gctgcagccccacagcatgcagccccaggagagccacgtccactatagtaggtgggagga60

cggcagcagggacggagtccagcacagaagaggcctcacgctgccgcaggtgaggggcct120

gagggcagcctgccagccatagcaggctggtgtctccctccagagacgcctgccctaacc180

cctgctaccggccccatcaccctccaccccatcctggctgggagcccacggtccagcagc240

tcagcaaaccgcagcctttggccttccctctggttggctgtgggcggggagagcttcctc300

tcaactccagcagagcgcccaggcccctccccctgacccagaccaacggccacagtccac360

ttagggggcccctcatgcggccctggcctggggctcacctccagttggttctcaccccag420

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