本发明属于生物医用薄膜领域，具体涉及一种调控聚多巴胺薄膜的氧化/还原态的方法，实现该薄膜的不同功能性，可应用于干细胞体外培养及分化。
背景技术：
聚多巴胺(pda)因其结构含有大量的酚羟基和含氮基团可作为二级反应平台，对多类型的基体(如金属、玻璃，有机物等)具有较好的粘附性[a.j.steeves,
a.atwal,s.c.schock,f.variola.evaluationofthedirecteffectsofpoly(dopamine)ontheinvitroresponseofhumanosteoblasticcells.j.mater.chem.b,2016,4:3145—3156]，并且生物相容性良好等特点而被广泛用于生物材料表面修饰；此外，聚多巴胺利用自身的还原性可以实现材料表面无电金属化。
细胞的生长分为多个阶段，简单来说可以分为初期的粘附、中期的增殖以及后期的分化，而细胞的每个生长阶段所需的微环境和生长因子皆有所差异，因此需要一种能够原位调控表面状态的方法。低电压的电刺激对细胞的影响较小，而聚多巴胺因其良好的导电性，可以在细胞生长过程中施加原位电刺激来进行状态转变，可以及时的调整基底的状态以及后续改变其上吸附的蛋白构象来适应细胞生长所需，有望实现细胞粘附、增殖以及分化相关性能的提高，对干细胞体外培养及分化、组织工程等生物医学工程领域有较大的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种能够原位调控聚多巴胺薄膜氧化/还原态的方法，以实现薄膜不同功能性，从而改进表面与生物分子相互作用的特性，表达出更适合于表面与细胞相互作用不同阶段所需的蛋白吸附状态，可以提高细胞相关性能。
本发明的调控聚多巴胺薄膜的氧化/还原态的方法，是采用脉冲电处理的方式实时原位调控聚多巴胺薄膜的氧化/还原态。
优选的，所述的脉冲电处理的方式为：
对聚多巴胺薄膜进行+0.1～+1v的脉冲电压处理，获得氧化态的聚多巴胺薄膜；对聚多巴胺薄膜进行-0.1～-1v的脉冲电压处理，获得还原态的聚多巴胺薄膜。
该方法具体包括如下步骤：
1)将具有聚多巴胺薄膜的导电基体浸入乙醇溶液中，浸泡10～30min，取出后在37℃烘干；
2)将1)中得到的基体在去离子水下冲洗1～3min，重复3次，并且在去离子水中超声5～10min，取出后在37℃烘干；
3)将步骤2)处理后的具有聚多巴胺薄膜的基体按双电极法放置于pbs溶液中，其中对电极为铂电极或石墨电极；
4)采用脉冲电处理方式，调控聚多巴胺薄膜的氧化/还原态：
a)施加+0.1～+1v的电压，频率为1～100hz，占空比为10～90％，时间10～60min制备得到氧化态的聚多巴胺薄膜；
b)施加-0.1～-1v的电压，频率为1～100hz，占空比为10～90％，时间10～60min制备得到还原态的聚多巴胺薄膜；
5)将4)中得到的基体在去离子水下冲洗1～3min，重复3次，取出后在37℃烘干，即得到具有不同氧化/还原态的聚多巴胺薄膜。
上述技术方案中，所述的导电基体为纯钛或钛合金或不锈钢或具有底层导电膜的聚合物。所述的聚合物为聚乳酸或聚乙醇酸或聚已内酯或聚四氟乙烯或聚偏氟乙烯。
聚多巴胺易在多种基底上自聚成膜，并赋予基板表面一定的导电性，本发明通过电脉冲的方式实时原位调整聚多巴胺的氧化/还原态来有效地调控表面的生物相容性和蛋白吸附特性。经上述方法处理的聚多巴胺薄膜可以作为细胞培养表面适应不同生长阶段的细胞。
本发明以聚多巴胺(pda)为基础，通过脉冲电化学的方式调整其氧化/还原态，提高基板的蛋白吸附性能以及表达出更适合于表面与细胞相互作用不同阶段所需的蛋白吸附状态；并且在细胞培养细胞过程中原位施加电脉冲调整pda膜的状态以适应细胞生长所需，以提高细胞的粘附、增殖和分化性能。本发明中所用pda具有良好生物相容性，并且因自身含有大量的酚羟基和含氮基团易在多种类型的基板上自聚成膜，赋予基板一定的导电性，其本身良好的导电性使其适用于细胞培养过程中进行原位电刺激，为细胞生长提供不同的微环境。本发明的调控不同功能性聚多巴胺氧化/还原态的方法，聚多巴胺膜本身适用于各种类型的基底，而低电压的电脉冲调控方式本身对细胞的影响较小，对体外细胞培养、组织工程等生物医学工程领域有较大意义。
附图说明
图1是pda膜的sem图(a)以及pda(b)、opda(c)、rpda(d)的afm图。
图2是pda、opda、rpda膜的拉曼图谱。
图3是pda、opda、rpda膜的xps图谱。
图4是pda、opda、rpda膜表面bsa吸附量的图。
图5是pda、opda、rpda膜培养细胞一天和五天的od值图。
图6是pda、opda、rpda膜的alp活性图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。
实施例1
1)将具有聚多巴胺薄膜的导电基体浸入乙醇溶液中，浸泡10min，取出后在37℃烘干；
2)将1)中得到的基体在去离子水下冲洗3min，重复3次，并且在去离子水中超声5min，取出后在37℃烘干；
3)将具有pda膜的基体按双电极法放置于pbs溶液中，其中对电极为石墨电极；
4)采用脉冲电处理方式，调控聚多巴胺薄膜的氧化/还原态
a)施加+1v的电压，频率为1hz，占空比为10％，时间60min制备得到氧化态的聚多巴胺薄膜opda；
b)施加-1v的电压，频率为1hz，占空比为10％，时间60min制备得到还原态的聚多巴胺薄膜rpda；
5)将4)中得到的基体在去离子水下冲洗1min，重复3次，取出后在37℃烘干，即得到具有不同氧化/还原态的聚多巴胺薄膜(见图1)。
如图1所示，制备得到形貌均匀，呈纳米颗粒状的pda膜，并且电处理前后膜的形貌变化不大。
实施例2
1)将具有聚多巴胺薄膜的导电基体浸入乙醇溶液中，浸泡30min，取出后在37℃烘干；
2)将1)中得到的基体在去离子水下冲洗1min，重复3次，并且在去离子水中超声10min，取出后在37℃烘干；
3)将具有pda膜的基体按双电极法放置于pbs溶液中，其中对电极为铂电极；
4)采用脉冲电处理方式，调控聚多巴胺薄膜的氧化/还原态
a)施加+0.1v的电压，频率为100hz，占空比为90％，时间10min制备氧化态的聚多巴胺薄膜；
b)施加-0.1v的电压，频率为100hz，占空比为90％，时间10min制备还原态的聚多巴胺薄膜；
5)将4)中得到的基体在去离子水下冲洗3min，重复3次，取出后在37℃烘干，即得到不同状态的聚多巴胺薄膜。
实施例3
1)将具有聚多巴胺薄膜的导电基体浸入乙醇溶液中，浸泡8min，取出后在37℃烘干；
2)将1)中得到的基体在去离子水下冲洗2min，重复3次，并且在去离子水中超声8min，取出后在37℃烘干；
3)将具有pda膜的基体按双电极法放置于pbs溶液中，其中对电极为石墨电极；
4)采用脉冲电处理方式，调控聚多巴胺薄膜的氧化/还原态
a)施加+0.5v的电压，频率为50hz，占空比为50％，时间30min制备得到氧化态的聚多巴胺薄膜；
b)施加-0.5v的电压，频率为50hz，占空比为50％，时间30min制备得到还原态的聚多巴胺薄膜；
5)将4)中得到的基体在去离子水下冲洗2min，重复3次，取出后在37℃烘干，即得到具有不同氧化/还原态的聚多巴胺薄膜。
实施例4
1)将具有聚多巴胺薄膜的导电基体浸入乙醇溶液中，浸泡30min，取出后在37℃烘干；
2)将1)中得到的基体在去离子水下冲洗1min，重复3次，并且在去离子水中超声10min，取出后在37℃烘干；
3)将具有pda膜的基体按双电极法放置于pbs溶液中，其中对电极为铂电极；
4)采用脉冲电处理方式，调控聚多巴胺薄膜的氧化/还原态
a)施加+0.8v的电压，频率为10hz，占空比为40％，时间30min制备得到氧化态的聚多巴胺薄膜opda；
b)施加-0.4v的电压，频率为10hz，占空比为40％，时间30min制备得到还原态的聚多巴胺薄膜rpda；
5)将4)中得到的基体在去离子水下冲洗3min，重复3次，取出后在37℃烘干，即得到具有不同氧化/还原态的聚多巴胺薄膜(raman和xps图见图2和图3)。
通过拉曼图谱分析，1412cm-1和1573cm-1处峰分别代表了苯环的伸缩振动和变形振动，证明pda的存在。进一步的xps分析来看，pda的醌基和酚羟基在电处理过程中发生转化，导致opda和rpda的产生。
实施例5
1)将具有聚多巴胺薄膜的导电基体浸入乙醇溶液中，浸泡15min，取出后在37℃烘干；
2)将1)中得到的基体在去离子水下冲洗2min，重复2次，并且在去离子水中超声8min，取出后在37℃烘干；
3)将具有pda膜的基体按双电极法放置于pbs溶液中，其中对电极为铂电极；
4)采用脉冲电处理方式，调控聚多巴胺薄膜的氧化/还原态
a)施加+0.5v的电压，频率为100hz，占空比为90％，时间10min制备得到氧化态的聚多巴胺薄膜opda；
b)施加-0.2v的电压，频率为100hz，占空比为90％，时间10min制备得到还原态的聚多巴胺薄膜rpda；
5)将4)中得到的基体在去离子水下冲洗2min，重复3次，取出后在37℃烘干，即得到具有不同氧化/还原态的聚多巴胺薄膜。将三组样品(初始态pda、氧化态opda、还原态rpda)浸泡到2mg/ml的bsa溶液中24h，测试其上蛋白吸附量(见图4)。
如图所示，opda和rpda状态的蛋白吸附能力大大增强，并且以rpda状态尤为明显。
实施例6
1)将具有聚多巴胺薄膜的导电基体浸入乙醇溶液中，浸泡10min，取出后在37℃烘干；
2)将1)中得到的基体在去离子水下冲洗2min，重复3次，并且在去离子水中超声6min，取出后在37℃烘干；
3)将具有pda膜的基体按双电极法放置于pbs溶液中，其中对电极为铂电极；
4)采用脉冲电处理方式，调控聚多巴胺薄膜的氧化/还原态
a)施加+0.5v的电压，频率为5hz，占空比为10％，时间60min制备得到氧化态的聚多巴胺薄膜opda；
b)施加-0.2v的电压，频率为5hz，占空比为10％，时间60min制备得到还原态的聚多巴胺薄膜rpda；
5)将4)中得到的基体在去离子水下冲洗2min，重复3次，取出后在37℃烘干，即得到具有不同氧化/还原态的聚多巴胺薄膜；
6)将三组样品(初始态pda、氧化态opda、还原态rpda)接种e-1细胞，分别培养1天和5天，用cck-8kit测试od值(如图5)。如图所示，rpda显示出更好的细胞粘附和增殖性能，也即可以看出通过对聚多巴胺薄膜进行脉冲电处理使其呈还原态更利于细胞的初期生长。
实施例7
1)将具有聚多巴胺薄膜的导电基体浸入乙醇溶液中，浸泡10min，取出后在37℃烘干；
2)将1)中得到的基体在去离子水下冲洗2min，重复3次，并且在去离子水中超声6min，取出后在37℃烘干；
3)将具有pda膜的基体按双电极法放置于pbs溶液中，其中对电极为铂电极；
4)采用脉冲电处理方式，调控聚多巴胺薄膜的氧化/还原态
a)施加+0.5v的电压，频率为5hz，占空比为10％，时间60min制备得到氧化态的聚多巴胺薄膜opda；
b)施加-0.2v的电压，频率为5hz，占空比为10％，时间60min制备得到还原态的聚多巴胺薄膜rpda；
5)将4)中得到的基体在去离子水下冲洗2min，重复3次，取出后在37℃烘干，即得到具有不同氧化/还原态的聚多巴胺薄膜；
6)将三组样品(初始态pda、氧化态opda、还原态rpda)接种成纤维细胞，分别培养1天和5天，用cck-8kit测试od值。
实施例8
1)将具有聚多巴胺薄膜的导电基体浸入乙醇溶液中，浸泡10min，取出后在37℃烘干；
2)将1)中得到的基体在去离子水下冲洗3min，重复3次，并且在去离子水中超声5min，取出后在37℃烘干；
3)将具有pda膜的基体按双电极法放置于pbs溶液中，其中对电极为铂电极；
4)采用脉冲电处理方式，调控聚多巴胺薄膜的氧化/还原态
a)施加+0.6v的电压，频率为10hz，占空比为50％，时间20min制备得到氧化态的聚多巴胺薄膜opda；
b)施加-0.3v的电压，频率为10hz，占空比为50％，时间20min制备得到还原态的聚多巴胺薄膜rpda；
5)将4)中得到的基体在去离子水下冲洗1min，重复3次，取出后在37℃烘干，即得到具有不同氧化/还原态的聚多巴胺薄膜；
6)将三组样品(初始态pda、氧化态opda、还原态rpda)接种e-1细胞，在细胞培养达到7天的时候，将细胞裂解，然后分别用bca试剂盒和alp试剂盒测试总蛋白和alp的量，最后计算得出alp活性结果如图6，和参照组对比，opda膜对细胞的分化性能有较大的促进作用，也即可以看出通过对聚多巴胺薄膜进行脉冲电处理使其呈氧化态更利于细胞的后期分化。