本发明属于天然药物化学领域，具体地说，涉及一种从苦西瓜中制备葫芦素e及糖苷的方法。
背景技术：
苦西瓜是指葫芦科西瓜属带有苦味的西瓜品种，如药西瓜(拉丁名citrulluscolocynthis)、未经驯化的西瓜(拉丁名citrulluslanatus(thunb.)matsum.etnakai，英文名watermelon)野生品种及人工培育的带苦味的西瓜等。其中，药西瓜又称“苦西瓜”、“苦苹果”或“苦黄瓜”，原产于地中海地区，在我国主要分布在新疆等地，是维吾尔族习用药材，收载于我国一九九八年卫生部颁药材标准(维吾尔分册)中。主要适用于由寒气所引起的各种疾病，缓解疼痛，通气，消肿止痛。主治便秘，瘫痪，开窍，牙疼，胸闷，风湿等。
苦西瓜果实和根中含有多种葫芦素成分，其中以葫芦素e及其单葡萄糖苷含量最高。现代药理研究表明，葫芦素类化合物具有很强的抗癌活性。据报道，葫芦素b、e、i，对乳腺癌、肺癌、肝癌等癌细胞的增殖具有很强的抑制作用。甜瓜中的葫芦素b、e已被开发成五类中药“葫芦素片”，主要应用于湿热毒盛所致迁延性肝炎、慢性肝炎及原发性肝癌的辅助治疗。
葫芦素e(cucurbitacine)，异名α-西洋苦瓜素。分子式c32h44o8，分子量：556.695，cas号：18444-66-1。葫芦素e最早分别于1909年和1910在喷瓜和药西瓜中被发现，此后，在甜瓜、西瓜、雪胆、栝楼、天花粉等葫芦科植物中发现有葫芦素e的存在，其中，以甜瓜蒂中的含量最高，但仍不足0.4％(干重)。目前市售的葫芦素e均从甜瓜蒂中提取纯化而来，但甜瓜蒂中主要为葫芦素b，而葫芦素e含量相对极低，且二者极性大小接近，这给葫芦素e的提纯带来很大的干扰，使得工艺流程复杂，成本难以得到有效的降低，售价高达四万元每克。
前期研究发现，药西瓜和西瓜野生品种中葫芦素e及其单葡萄糖苷的含量很高，其中，药西瓜中葫芦素e及其单葡萄糖苷合计达到6％(湿重)(图1)，但目前尚未有苦西瓜中葫芦素e及其糖苷制备工艺的文献报道，本发明采用葫芦素e及其糖苷含量极高的苦西瓜为提取原材料，可极大地降低葫芦素e及其糖苷的生产成本。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种从苦西瓜中提取葫芦素e及其糖苷的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的苦西瓜中葫芦素e及糖苷的制备方法，用乙醇提取苦西瓜，然后除去乙醇，收集醇提物，再经过大孔树脂柱层析分离，半制备hplc纯化，分别得到式(i)和式(ii)所示的葫芦素e及单葡萄糖苷。
本发明中醇提对象为苦西瓜鲜药材，或干药材粗粉。具体地，鲜药材用匀浆机打碎后，用乙醇提取；或者，将成熟的苦西瓜晒干、粉碎，过24目筛，得到干药材粗粉，然后用乙醇提取。
前述的方法，包括以下步骤：
1)用乙醇提取苦西瓜，然后除去乙醇，收集醇提物；
2)将所述醇提物溶解于乙醇中，使乙醇含量达20％，离心或抽滤收集上清液或滤液；
3)所述上清液或滤液进行大孔树脂柱层析分离，依次用水、30％乙醇、浓度不低于35％的乙醇、浓度不低于60％的乙醇梯度洗脱，分别收集浓度不低于35％和不低于60％的乙醇洗脱组分；
4)将收集得到的浓度不低于35％的乙醇洗脱组分用半制备hplc进行分离纯化，得到式(ii)所示化合物；
5)将收集得到的浓度不低于60％乙醇水洗脱组分用半制备hplc进行分离纯化，得到式(i)化合物。
优选地，步骤1)中所述苦西瓜选自药西瓜或西瓜野生品种。
优选地，步骤1)中所述乙醇的浓度为40％～95％。
优选地，步骤1)提取方法选自渗漉提取、加热回流提取或浸渍提取中的任一种。
优选地，步骤3)中所用大孔树脂的型号选自d101、ab-8、hp-20、h-103、da-201、dm-130、xad-16或ds-401。
优选地，步骤3)中所述浓度不低于35％的乙醇，其浓度范围为35％～60％；所述浓度不低于60％的乙醇，其浓度范围为60％～95％。
优选地，步骤4)进行hplc分离纯化时，所用反相色谱柱的填料为c8或c18，柱规格为20mm×250mm。
优选地，步骤4)进行hplc分离纯化时，所用流动相为甲醇-水或乙腈-水，体积比10:90～70:30。
优选地，步骤5)进行hplc分离纯化时，所用流动相为甲醇-水或乙腈-水，体积比30:70～80:20。
在本发明的一个具体实施方式中，苦西瓜中葫芦素e及糖苷的制备方法为：取1kg苦西瓜干药材粗粉，加入1倍重量的75％乙醇润湿浸泡6小时，然后将润湿好的药西瓜样品加入到渗漉筒中，用75％乙醇渗漉提取，收集8倍量的渗滤液，减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.5l)；浓缩液中加入130ml95％乙醇，使得浓缩液乙醇含量达到20％，离心过滤，得上清液；将上清液加样至d101大孔树脂进行分离，依次用水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇梯度洗脱，分别收集50％和80％乙醇洗脱液，减压浓缩得浸膏。
50％乙醇洗脱所得浸膏用agilent1260半制备hplc进行分离纯化，dad检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相c18色谱柱20mm×250mm，流动相为甲醇：水体积比45:55的混合液，流速为8ml/min，收集保留时间为16.5min的流出峰，得到9.3g式(ii)所示化合物，纯度为98.5％。
80％乙醇洗脱所得浸膏用agilent1260半制备hplc进行分离纯化，dad检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相c18色谱柱20mm×250mm，流动相为甲醇：水体积比65:35的混合液，流速为8ml/min，收集保留时间为19min的流出峰，得到3.1g式(i)所示化合物，纯度为97.6％。
在本发明的另一个具体实施方式中，苦西瓜中葫芦素e及糖苷的制备方法为：
取1kg苦西瓜鲜药材，用匀浆机打碎，用75％乙醇回流提取3次，每次1h，提取溶剂量分别为6倍量、5倍量和5倍量；合并提取液，减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.8l)；向浓缩液中加入200ml95％乙醇，使得浓缩液乙醇含量达到20％，离心过滤，得上清液；将上清液加样至d101大孔树脂进行分离，依次用水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇梯度洗脱，分别收集50％和80％乙醇洗脱液，减压浓缩回收溶剂得浸膏。
50％乙醇洗脱所得浸膏用agilent1260半制备hplc进行分离纯化，dad检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相c18色谱柱20mm×250mm，流动相为甲醇：水体积比45:55混合液，流速为8ml/min，收集保留时间为16.5min的流出峰，得到5.8g式(ii)所示化合物，纯度为98.3％。
80％乙醇洗脱所得浸膏用agilent1260半制备hplc进行分离纯化，dad检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相c18色谱柱20mm×250mm，流动相为甲醇：水体积比65:35的混合液，流速为8ml/min，收集保留时间为19min的流出峰，得到2.2g式(i)所示化合物，纯度为98.0％。
葫芦素e，结构式如式(i)所示，为白色粉末。
结构确认：
hresimsm/z:579.2955[m+na]+(calcdforc32h44o8na:579.2928)；
uv(meoh)λmax：236nm；
1h-nmr(cdcl3，400mhz):δ7.06(1h，d，j＝15.6hz，h-24)，6.47(1h，d，j＝15.6hz，h-23)，5.95(1h，d，h-1)，5.77(1h，m，h-6)，4.36(1h，m，h-16)，3.50(1h，brs，h-10)，3.21(1h，d，j＝14.6hz，h-12a)，2.71(1h，d，j＝14.6hz，h-12b)，2.47(1h，d，j＝8.0hz，h-17)，2.37(1h，m，h-7a)，2.04(1h，m，h-8),1.88(1h，m，h-15a)，2.00(3h，s，ch3co)，1.89(1h，m，h-7b)，1.56(3h，s，h-27)，1.54(3h，s，h-26)，1.47(1h，m，h-15b)，1.42(3h，s，h-21)，1.38(3h，s，h-30)，1.35(3h，s，h-28)，1.25(3h，s，h-29)，1.03(3h，s，h-19)，0.99(3h，s，h-18)。
13cnmr(cdcl3，100mhz)：δ212.3(c-11)，202.6(c-22)，199.0(c-3)，170.3(ch3co)，151.8(c-24)，144.5(c-2)，136.7(c-5)，120.8(c-6)，120.5(c-23)，114.8(c-1)，79.3(c-25)，78.3(c-20)，71.5(c-16)，58.5(c-17)，50.7(c-13)，48.9(c-9)，48.7(c-12)，48.3(c-14)，47.5(c-4)，45.5(c-15)，41.6(c-8)，35.1(c-10)，25.9(c-27)，26.3(c-26)，27.9(c-28)，24.1(c-21)，23.8(c-7)，22.0(ch3co)，20.4(c-29)，20.1(c-19)，18.4(c-30)，19.7(c-18)。
葫芦素e单葡萄糖苷，结构式如式(ii)所示，为白色粉末。
结构确认：
hresimsm/z:741.3481[m+na]+(calcdforc38h54o13na:741.3457)；
uv(meoh)λmax：236nm；
1h-nmr(dmso-d6，400mhz):δ6.79(1h，d，j＝15.6hz，h-24)，6.84(1h，d，j＝15.6hz，h-23)，5.80(1h，d，h-1)，5.71(1h，brs，h-6)，4.49(1h，m，h-16)，3.61(1h，brs，h-10)，3.35(1h，d，j＝14.7hz，h-12a)，2.45(1h，d，j＝14.7hz，h-12b)，2.35(1h，d，j＝8.0hz，h-17)，2.26(1h，m，h-7a)，1.97(3h，s，ch3co)，1.93(1h，m，h-7b)，1.91(1h，m，h-8),1.73(1h，m，h-15a)，1.50(3h，s，h-27)，1.50(3h，s，h-26)，1.30(3h，s，h-30)，1.28(1h，m，h-15b)，1.27(3h，s，h-21)，1.18(3h，s，h-28)，1.18(3h，s，h-29)，0.86(3h，s，h-19)，0.76(3h，s，h-18)；4.57(1h，d，j＝7.7hz，h-1')，3.72(1h，m，h-6'a)，3.61(1h，m，h-6'b)，3.27(1h，m，h-5')，3.20(1h，m，h-3')，3.13(1h，s，h-4')，3.09(1h，s，h-2')。
13cnmr(dmso-d6，100mhz)：δ214.3(c-11)，204.6(c-22)，196.0(c-3)，169.3(ch3co)，148.8(c-24)，145.3(c-2)，136.4(c-5)，121.8(c-23)，120.7(c-6)，120.6(c-1)，79.5(c-25)，78.8(c-20)，69.4(c-16)，59.3(c-17)，50.2(c-13)，49.0(c-12)，48.8(c-4)，48.3(c-9)，47.5(c-14)，45.8(c-15)，41.2(c-8)，34.4(c-10)，27.2(c-29)，26.3(c-27)，26.3(c-26)，25.6(c-21)，20.5(c-28)，21.9(ch3co)，20.1(c-18)，19.8(c-19)，17.7(c-30)；98.8(c-1')，77.5(c-5')，76.9(c-3')，72.8(c-2')，69.0(c-4')，60.0(c-6')。
本发明的有益效果如下：
本发明首次公开了一种从苦西瓜中提取纯化获得葫芦素e及其糖苷的方法，该方法对苦西瓜中的目标成分提取率较高，可达20％，纯度高达98％以上。所用的苦西瓜葫芦素e及糖苷含量远高于目前常用的甜瓜蒂，既解决了甜瓜蒂药材来源困难的问题，又大大降低了成本，使得原来“万元”级别的葫芦素e原料有望降低到“千元”水平。生产工艺简单，所用溶剂仅为乙醇、甲醇、水等，对环境污染性较小。对设备要求不高，易于工业化放大生产。
附图说明
图1为药西瓜葫芦素e及其糖苷含量分析。其中，a：药西瓜横切面图，b：不同取样位置含量分析，c：分别为药西瓜中葫芦素e及其单糖苷的含量(湿重)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1药西瓜中葫芦素e及糖苷的制备方法
取1kg药西瓜粗粉，加入1倍重量的75％乙醇润湿浸泡6小时，然后将润湿好的药西瓜样品加入到渗漉筒中，用75％乙醇渗漉提取，收集8倍量的渗滤液，减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.5l)。浓缩液中加入130ml95％乙醇，使得浓缩液醇含量达到20％，离心过滤，得上清液和残渣。上清液上d101大孔树脂进行分离，依次用水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇梯度洗脱，分别收集50％和80％乙醇洗脱液，减压浓缩回收溶剂得浸膏。50％乙醇洗脱所得浸膏用agilent1260半制备hplc进行分离纯化，dad检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相c18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比45:55)，流速为8ml/min，收集保留时间为16.5min左右的流出峰，得9.3g式(ii)化合物，纯度为98.5％。80％乙醇洗脱所得浸膏用agilent1260半制备hplc进行分离纯化，dad检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相c18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比65:35)，流速为8ml/min，收集保留时间为19min左右的流出峰，得3.1g式(i)化合物，纯度为97.6％，提取率为20.6％。
实施例2药西瓜中葫芦素e及糖苷的制备方法
取1kg的药西瓜粗粉，加入1倍重量的75％乙醇润湿浸泡6小时，然后将润湿好的药西瓜样品加入到渗漉筒中，用75％乙醇渗漉提取，收集8倍量的渗滤液，减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.5l)。浓缩液中加入130ml95％乙醇，使得浓缩液醇含量达到20％，离心过滤，得上清液和残渣。上清液上ab-8大孔树脂进行分离，依次用水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇梯度洗脱，分别收集50％和80％乙醇洗脱液，减压浓缩回收溶剂得浸膏。50％乙醇洗脱所得浸膏用agilent1260半制备hplc进行分离纯化，dad检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相c18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比45:55)，流速为8ml/min，收集保留时间为16.5min左右的流出峰，得10.1g式(ii)化合物，纯度为98.1％。80％乙醇洗脱所得浸膏用agilent1260半制备hplc进行分离纯化，dad检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相c18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比65:35)，流速为8ml/min，收集保留时间为19min左右的流出峰，得3.6g式(i)化合物，纯度为97.7％，提取率为22.8％。
实施例3药西瓜中葫芦素e及糖苷的制备方法
取1kg的药西瓜粗粉，用75％的乙醇回流提取3次，每次1h，提取溶剂量分别为6倍量，5倍量，5倍量。合并提取液，减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.8l)。浓缩液中加入200ml95％乙醇，使得浓缩液醇含量达到20％，离心过滤，得上清液和残渣。上清液上d101大孔树脂进行分离，依次用水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇梯度洗脱，分别收集50％和80％乙醇洗脱液，减压浓缩回收溶剂得浸膏。50％乙醇洗脱所得浸膏用agilent1260半制备hplc进行分离纯化，dad检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相c18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比45:55)，流速为8ml/min，收集保留时间为16.5min左右的流出峰，得8.7g式(ii)化合物，纯度为98.3％。80％乙醇洗脱所得浸膏用agilent1260半制备hplc进行分离纯化，dad检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相c18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比65:35)，流速为8ml/min，收集保留时间为19min左右的流出峰，得3.2g式(i)化合物，纯度为98.0％，提取率为19.7％。
实施例4野生西瓜中葫芦素e及糖苷的制备方法
取1kg的野生西瓜粗粉，加入1倍重量的75％乙醇润湿浸泡6小时，然后将润湿好的野生西瓜样品加入到渗漉筒中，用75％乙醇渗漉提取，收集8倍量的渗滤液，减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.5l)。浓缩液中加入200ml95％乙醇，使得浓缩液醇含量达到20％，离心过滤，得上清液和残渣。上清液加至d101大孔树脂进行分离，依次用水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇梯度洗脱，分别收集50％和80％乙醇洗脱液，减压浓缩回收溶剂得浸膏。50％乙醇洗脱所得浸膏用agilent1260半制备hplc进行分离纯化，dad检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相c18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比45:55)，流速为8ml/min，收集保留时间为16.5min左右的流出峰，得6.4g式(ii)化合物，纯度为98.3％。80％乙醇洗脱所得浸膏用agilent1260半制备hplc进行分离纯化，dad检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相c18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比65:35)，流速为8ml/min，收集保留时间为19min左右的流出峰，得2.1g式(i)化合物，纯度为98.0％，提取率为20.5％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。