本发明涉及微生物基因工程技术领域，具体涉及一株利用crispr/cas9系统突变hxt3基因提高木糖转运速率的共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株及其构建方法。
背景技术：
木质纤维素生物质主要来源于农业废弃物，而秸秆等农业废弃物是地球上储量最为丰富的可再生有机物质，在中国每年约有9亿吨秸秆产生，转化处理方式上仍多为废弃或直接田间焚烧，处理成本过高造成极大的资源浪费、污染大气环境，破坏生态平衡。而利用生物质资源生产生物能源产品，其产生过程不会导致温室气体总量的净增加，减轻环境压力，是环境友好的可再生清洁能源。
木质纤维素生物质原料主要由纤维素，半纤维素和木质素三部分组成。其水解液中主要六碳糖为葡萄糖，主要五碳糖为木糖，而木糖醇可由木糖还原制得，乙醇可由葡萄糖转化获得。
木糖醇在医药食品等行业应用广泛，且作为21世纪新兴最有前途的生物平台化合物之一，经济价值十分可观。
生产木糖醇的方法主要有化学加氢法和生物转化法。化学法对设备要求极高，副产物成分复杂、提纯难、成本高，且该过程所需的镍催化剂对环境污染严重，木糖醇的收益低。生物法则反应条件温和、工艺简单可行，操作性可控性强。且后者污染少，分离成本低，具有良好的应用前景，是实现废物资源化、无害化，替代化学加氢法生产的有效途径。
可生产木糖醇的微生物总体可分三类：细菌、丝状真菌以及酵母菌，酵母的产率明显高于其他。2013年酵母产品的全球市场已达到58亿美元，预计2019年将达到92亿美元。酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)是经由gras(generallyrecognizedassafe)认证的安全菌株。而工业酿酒酵母具有耐热性能好，耐受抑制物性能佳等优点，用其作为基因工程改造的出发菌株，将木糖还原酶(xr，由xyl1编码)基因导入酿酒酵母可使木糖还原为木糖醇，并可获得高产木糖醇的工程菌。但是在葡萄糖和木糖共发酵的情况下，由于葡萄糖效应的存在，胞内木糖的高速代谢仍处于瓶颈，目前为止并未在酿酒酵母中发现可与葡萄糖代谢相匹敌的转运子。酿酒酵母中有多种单糖转运子(hxt1～hxt17和gal2)，但他们均是对己糖具有特异亲和性的转运子。只有一部分转运子如hxt1，hxt2，hxt4，hxt5，hxt7以及gal2可以转运木糖。且在混合糖(木糖和葡萄糖同时存在)的情况下，这些转运子会优先利用葡萄糖，木糖的转运会受到限制。许多研究通过突变一些转运子的特殊位点以提高其对木糖的亲和性，从而提高木糖的代谢速率。
而由国家发展改革委、国家能源局、财政部等十五部委联合印发《关于扩大生物燃料乙醇生产和推广使用车用乙醇汽油的实施方案》要求，到2020年，我国全国范围将推广使用车用乙醇汽油。因而，利用农业废弃物变废为宝同时生产木糖醇和乙醇，产生经济效益的同时还可作为环保处理农业废弃物的有效途径，一举两得。
简洁便捷的基因编辑技术越来越受到热捧，而第3代基因组编辑技术crispr-cas9基因编辑技术正应运而生，cas9既可作为双链的内切酶也可被改造成为切口酶，并在特定位点对dna进行切割，形成双链断裂(doublestrandbreak,dsb)，通过非同源末端连接(non-homologousendjoining，nhej)修复机制或在同源重组(homologousrecombination，hr)修复机制以及修复模板(donortemplate)dna存在的条件下，实现定点单碱基突变、长片段的插入、敲除以及突变。该系统是一个由核酸和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，通过一段短的引导rna(guiderna，grna)识别特定的dna序列，通过改变grna序列即可使蛋白定位到新的dna序列。设计打靶位点时，只需在原有含grna载体的基础上替换20bp的grna核苷酸序列，另外靶点的唯一限制是3'端必须有原间隔相关基序(pam)序列(ngg)，所以它的靶点在基因中出现的频率较高。且cas9可与多个不同靶位点的grna同时导入细胞中，可同时实现多基因编辑，极大的提高了基因编辑的效率。该基因编辑技术相比于传统的基因编辑技术，无需标记基因，流程少、时间短、成本低，在各领域必将有越来越有广阔的应用前景，并且产生深远的影响。
工业酿酒酵母表达系统较为复杂，目前采用的来源于热带假丝酵母ctxyl1(编码木糖还原酶)基因在酿酒酵母中异源表达后，为了模拟其在木质纤维素水解液中的发酵过程，选取初始浓度高的葡萄糖作为碳源供给时，其构建的重组菌，木糖代谢速率慢、木糖醇产量低，不能满足发酵需求的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一株利用crispr/cas9系统突变hxt3基因提高木糖转运速率共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株及构建方法，其通过人为改造工业酿酒酵母使其在高浓度葡萄糖存在的条件下，提高木糖转运速率从而提高酿酒酵母共发酵木糖和葡萄糖的能力，提高其产木糖醇和乙醇的性能，这通过新型基因编辑技术、突变目的基因的表达来实现。
本发明使用具有木糖代谢背景的絮凝性工业酵母seb6作为出发菌株，构建一株高产木糖醇菌株。为了确保重组菌株在工业生产中的安全性，需要对g418抗性筛选标记kanmx基因进行敲除，即通过将已含热带假丝酵母(candidatropicalis)的木糖还原酶(xylosereductase，xr)基因ctxyl1、含有kanmx的絮凝性工业酿酒酵母seb6的抗性基因kanmx利用cre-loxp系统，通过识别loxp位点将其切除，然后利用crispr/cas9基因编辑技术来突变hxt3基因，提高菌株对木糖的亲和性，进一步提高木糖代谢速率，从而提高木糖醇和乙醇产量。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一株共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株的转运蛋白hxt3的367位上的氨基酸天冬酰胺突变为丙氨酸。
进一步地，所述酿酒酵母菌株为seb10，其分类命名为酿酒酵母saccharomycescerevisiae，其保藏编号为cgmccno.14777，保藏日期为2017年10月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的第二个目的是提供一种上述的共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株的构建方法，其包括以下步骤：
步骤a)选取出发菌株，所述出发菌株为絮凝性工业酵母seb6，其保藏编号为cgmccno.11326；
步骤b)利用cre-loxp系统敲除出发菌株的kanmx基因，构建seb6kan菌株；
步骤c)利用crispr/cas9系统突变步骤b)所构建的seb6kan菌株的hxt3基因，构建seb6kan-m-hxt3菌株。
为了进一步优化上述酿酒酵母菌株的构建方法，本发明所采取的技术措施还包括：
进一步地，在步骤c)之后，还包括步骤d)筛选最优seb6kan-m-hxt3菌株，并命名为seb10。
进一步地，所述seb6菌株含有热带假丝酵母(candidatropicalis)的木糖还原酶(xylosereductase，xr)基因ctxyl1。
进一步地，步骤c)中构建seb6kan-m-hxt3菌株的步骤包括：
步骤1)将cas9-nat质粒导入步骤b)构建的seb6kan菌株，粗提酿酒酵母转化子基因组dna并以该dna作为模板进行pcr扩增，发酵筛选高产木糖醇的菌株，将该菌株命名为seb6kan-cas9菌株；
步骤2)以pmel13质粒为模板，pcr扩增并切胶纯化回收pcr扩增产物，制得含grna的质粒线性骨架，命名为pmel13-backbone；
步骤3)设计识别hxt3基因的grna片段以及hxt3单突变修复重组片段，分别命名为m-hxt3-grna、m-hxt3-repair；
步骤4)利用步骤2)制备的pmel13-backbone和步骤3)设计的m-hxt3-grna构建pmel13-m-hxt3-grna质粒；
步骤5)将步骤4)构建的pmel13-m-hxt3-grna质粒和步骤3)设计的m-hxt3-repair转化到步骤1)制备的seb6kan-cas9菌株，利用crispr/cas9系统突变hxt3基因，并对hxt3突变菌株进行测序筛选，脱除cas9-nat质粒以及pmel13-m-hxt3-grna质粒，构建seb6kan-m-hxt3菌株；
其中，步骤1)～步骤3)的操作顺序可进行互换。
进一步地，所述cas9-nat质粒的序列如seqidno：1所示；扩增所述酿酒酵母转化子基因组dna的引物序列如seqidno：2～seqidno：3所示；所述pmel13质粒的序列如seqidno：4所示，其采用的引物序列如seqidno：5～seqidno：6所示；所述m-hxt3-grna的序列如seqidno：9所示，所述m-hxt3-repair的序列如seqidno：11所示。
进一步地，所述步骤1)中酿酒酵母转化子基因组dna的pcr扩增程序为：98.0℃预变性30s，98.0℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸50s，上述过程进行30个循环。
进一步地，所述步骤2)中pmel13质粒的pcr扩增程序为：98.0℃预变性30s，98.0℃变性10s，67℃退火15s，72℃延伸6min10s，上述过程进行35个循环后，于4℃保存。
进一步地，在步骤3)中，还包括设计hxt3编码区验证引物的步骤，所述hxt3编码区验证引物的序列如seqidno.7～seqidno.8所示；在步骤3)中还采用如seqidno.10所示序列的测序引物。
进一步地，在步骤4)中采用了如seqidno.12所示序列的测序引物。
进一步地，步骤d)中筛选最优seb6kan-m-hxt3菌株包括以下步骤：利用试管发酵筛选具有高木糖消耗率的seb6kan-m-hxt3菌株，将该菌株进行培养发酵，并测定发酵参数，计算木糖消耗率以及木糖醇的产率，筛选出木糖消耗速率最快的菌株作为最优seb6kan-m-hxt3菌株，并命名为seb10。
进一步地，在上述酿酒酵母菌株的构建方法中使用的培养基包括液体培养基(如2％ypd培养基、ypdx培养基、ypdx发酵罐用培养基等)、固体培养基(如lb/amp培养基、2％ypd/g418/nat固体培养基等)等，也可使用其他任一合适的培养基。
本发明的第三个目的是提供一种上述工业酿酒酵母菌株在木糖醇及乙醇生产中的应用。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
1、本发明通过crispr/cas9基因编辑技术，可以定点迅速而准确地将转运蛋白hxt3的367位由天冬酰胺突变为丙氨酸。
2、通过本发明所述构建方法制备的酿酒酵母菌株seb10在初始葡萄糖浓度较高的条件下，木糖消耗速率，木糖醇乙醇产量均有所提升。试管发酵条件下，木糖消耗速率提高80.6％，木糖醇产量提高93.5％；发酵罐的条件下，木糖消耗速率提升12％，发酵生产木糖醇的性能优越，木糖醇产量提升13％，乙醇产量提升22％，木糖醇的收率接近理论值1.0。
附图说明
本发明公开的一株共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株为seb10，其已进行保藏，其分类命名为酿酒酵母saccharomycescerevisiae，其保藏编号为cgmccno.14777，保藏日期为2017年10月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
图1是本发明一实施例中的出发菌株seb6kan发酵罐的发酵示意图；
图2是本发明一实施例中的hxt3(n367a)突变菌株seb10发酵罐的发酵示意图。
具体实施方式
本发明涉及一株共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的培养基配方如下：
本发明的培养基配方如下：
1、液体培养基；
2％ypd培养基(10g/lyeastextract酵母浸出粉、20g/lpeptone蛋白胨、20g/lglucose葡萄糖)，121℃，灭菌15min，冷却至60℃，可根据情况添加100μg/mlg418或80μg/ml诺尔斯菌素。用于酵母发酵前的预培养。
ypdx培养基(10g/lyeastextract酵母浸出粉、20g/lpeptone蛋白胨、40g/ld-xylose木糖，60g/l或20g/lglucose葡萄糖)，121℃灭菌15min，冷却至60℃，可根据情况添加100μg/mlg418或80μg/ml诺尔斯菌素。用于木糖的试管发酵。
ypdx发酵罐用培养基(10g/lyeastextract酵母浸出粉、20g/lpeptone蛋白胨、45g/ld-xylose木糖，60g/lglucose葡萄糖)，121℃灭菌15min，冷却至60℃，可根据情况添加100μg/mlg418或80μg/ml诺尔斯菌素。用于木糖的发酵罐发酵。
2、固体培养基；
lb/kana培养基(10g/lpeptone蛋白胨、5g/lyeastextract酵母浸出粉、10g/lnacl)，121℃，冷却至60℃，加入100μg/ml卡那霉素。用于培养大肠杆菌。
2％ypd/g418/nat固体培养基(10g/lyeastextract酵母浸出粉、20g/lpeptone蛋白胨、20g/lglucose葡萄糖、15g/lagar琼脂)，121℃，冷却至60℃，加入100μg/mlg418，80μg/ml诺尔斯菌素。用于培养酵母，根据试验情况添加两种抗生素筛选酵母转化子。
实施例1
本实施例为酿酒酵母菌株seb10的构建方法，其包括如下步骤：
(1)敲除筛选标记kanmx基因：采用醋酸锂转化法将含cre酶酵母表达的诱导型质粒psh47/zeo(1μg)转化到出发酿酒酵母菌株seb6中，在含有zeocin最佳耐受浓度的ph7.2的2％ypd平板中筛选菌落形态完好的阳性转化子。质粒psh47/zeo为现有质粒，敲除筛选标记g418的kanmx基因的方法公开在2013年tomitaka等人报道的一篇文献中，该文献名称为：分离及鉴定一株经突变和重组的能高效利用木糖的酿酒酵母；作者有：tomitakam、taguchih、fukudak、akamatsut、kidak；公开的刊物为：生物科学与生物工程杂志.2013，116(6)：706-715。上述利用同源重组的方式，利用cre-loxp15系统，通过识别loxp位点将kanmx基因切除，该敲除筛选标记g418的kanmx基因的方法采用本领域的常规技术手段，将敲除kanmx基因的菌株命名为seb6kan；
(2)将cas9-nat质粒导入酿酒酵母seb6kan：将现有质粒cas9-nat(1μg)(seqidno.1)通过醋酸锂转化法转化到酿酒酵母seb6kan菌株中，在含有诺尔斯菌素的2％ypd平板中筛选菌落形态完好的阳性转化子；
(3)粗提酿酒酵母转化子基因组dna：将可能的阳性转化子用牙签挑取至95μl1％sds(十二烷基磺酸钠)中，并加入4μl4m醋酸锂溶液，之后操作步骤按照公开在2015年robertmans等人报道的一篇文献中，该文献名称为：crispr/cas9：在酿酒酵母中同时引入多基因修饰的一种分子瑞士军刀；作者有：harmenm.vanrossum#,melaniewijsman,antoonbackx,nielsg.a.kuijpers,marcelvandenbroek,pascaledaran-lapujade,jackt.pronk,antoniusj.a.vanmarisandjean-marcg.daran；公开的刊物为：femsyeastresearch(欧洲微生物学联合会酵母研究杂志)2015，15(2)：1-15。
(4)通过菌落pcr验证以及试管发酵筛选seb6kan-cas9菌株：从上述步骤中得到的转化子基因组dna为模板，cas9-dg-f(seqidno.2)，cas9-dg-r(seqidno.3)为引物，进行pcr扩增。pcr反应体系25μl组成如下：pcr反应体系50μl组成如下：5×primestarbuffer(mg2+plus)5μl；dntpmixture(各2.5mm)2μl；引物cas9-dg-f，cas9-dg-r各10μm，0.3μl；primestarhsdnapolymerase(5u/μl)0.3μl；转化子dna30-50ng；以灭菌双蒸水补加至25μl。pcr扩增程序为：将上述25μl反应体系在98.0℃预变性30s，98.0℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸50s，上述过程进行30个循环后，取适量液体于100v电压条件下进行凝胶电泳，如果出现753bp的电泳条带则为阳性转化子。将验证的阳性转化子于35℃，140rpm条件下，利用ypdx(10g/lyeastextract酵母浸出粉、20g/lpeptone蛋白胨、50g/ld-xylose木糖，20g/lglucose葡萄糖)进行试管发酵，根据发酵结果筛选出一株高产木糖醇菌株，命名为seb6kan-cas9；
利用试管发酵筛选seb6kan-cas9菌株的结果如表1所示：
表1试管发酵筛选seb6kan-cas9菌株
根据表1的结果可知：c2号菌的木糖发酵以及生产木糖醇的性能最优越，因而用其作为突变hxt3基因的出发菌seb6kan-cas9菌株。
(5)含grna的线性骨架的制备：以pmel13质粒(seqidno.4)为模板，6006-fv(seqidno.5)、6005-rw(seqidno.6)为引物，pcr扩增并切胶纯化回收pcr扩增得到的质粒线性化骨架。pcr反应体系50μl组成如下：5×primestarbuffer(mg2+plus)10μl；dntpmixture(各2.5mm)4μl；引物6006-fv、6005-rw各10μm，0.5μl；primestarhsdnapolymerase(5u/μl)0.5μl；质粒pk-xr-ct50ng；以灭菌双蒸水补加至50μl。μm是浓度单位，是μmol/l的意思。grna的线性骨架的pcr扩增程序为：将含有pmel13质粒、引物6006-fv、6005-rw的反应体系在98.0℃预变性30s，98.0℃变性10s，67℃退火15s，72℃延伸6min10s，上述过程进行35个循环后，于4℃保存。pcr完成后，用quickcuttmdpni快切酶(takara公司)在37℃处理2h以消化质粒模板。最后在1％琼脂糖凝胶上上样，在50v电压条件下进行凝胶电泳，用胶纯化回收试剂盒(omega公司)切胶回收获得线型骨架，骨架长度为6110bp，命名为pmel13-backbone；
(6)设计识别hxt3基因的grna片段以及合成hxt3突变dna双链片段：根据公开在2014年jeroengnijland等人报道的一篇文献中，该文献名称为：通过基因工程手段将内源性己糖转运蛋白转化为一种特异性d-木糖转运蛋白以促进酿酒酵母共消耗葡萄糖-木糖；作者有：jeroengnijland,hyunyongshin,renémdejong,paulpdewaal,paulklaassenandarnoldjmdriessen；公开的刊物为：biotechnologyforbiofuels(生物能源生物技术杂志)2014，7：168，将文中的相关转运子的氨基酸位点突变作为参考，我们将转运蛋白hxt3进行单突变(n367a)，即367位的氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸。然后在网站http://yeastriction.tnw.tudelft.nl上，以模式酵母s288c为基准，可在线设计hxt3编码区验证引物hxt3-dg-fw(seqidno.7)和hxt3-dg-rv(seqidno.8)。并通过参考pam(ngg)距离突变位点的远近，grna靶位点序列gc碱基比大于65％的原则，设计识别hxt3基因的grna片段以及该片段命名为m-hxt3-grna(seqidno.9)。然后以seb6基因组dna为模板，hxt3-dg-fw、hxt3-dg-rv为引物，进行pcr扩增。pcr反应体系50μl组成如下：5×primestarbuffer(mg2+plus)10μl；dntpmixture(各2.5mm)4μl；引物hxt3-dg-fw、hxt3-dg-rv各10μm，0.5μl；primestarhsdnapolymerase(5u/μl)0.5μl；seb6基因组dna50ng；以灭菌双蒸水补加至50μl。pcr扩增程序为：将上述50μl反应体系在98.0℃预变性30s，98.0℃变性10s，67℃退火15s，72℃延伸1min50s，上述过程进行30个循环后，于4℃保存，获得hxt3基因片段，并用引物hxt3-mdg-f(seqidno.10)于擎科生物技术有限公司(成都)进行测序。然后依照测序的hxt3基因片段设计出hxt3单突变修复重组片段144bp，该片段命名为m-hxt3-repair(seqidno.11),并在生工生物工程(上海)股份有限公司订购合成双链；
(7)构建pmel13-m-hxt3-grna质粒：根据neb公司的gibsonassembly(gibson连接)操作说明稍作更改，以下列反应体系构建pmel13-m-hxt3-grna质粒。反应体系5μl组成如下：gibsonmix(2×)2.5μl；pmel13-backbone(6110bp)0.025pmol；m-hxt3-grna(144bp)，0.125pmol；以灭菌双蒸水补加至5μl。反应程序为：将上述5μl反应体系在50℃温浴15min后全部用于做大肠杆菌转化实验，该转化方法为本行业常规技术手段，因此在此不再赘述。将转化的菌落在含有卡那霉素的lb培养基上生长，并于5mllb/kana培养基过夜培养，根据生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取pmel13-m-hxt3-grna质粒。并于擎科生物技术有限公司(成都)进行测序，测序引物为pmel13-cxf(seqidno.12)，并与设计的m-hxt3-grna序列相比对，确认正确的转化子。
(8)利用crispr/cas9系统突变hxt3基因：将现有质粒pmel13-m-hxt3-grna(600ng)以及重组修复片段m-hxt3-repair(1.6μg)通过醋酸锂转化法转化到酿酒酵母seb6kan-cas9菌株中，在含有g418以及诺尔斯菌素的2％ypd平板中筛选菌落形态完好的阳性转化子；
(9)测序筛选hxt3突变菌株：以上述步骤中提取的转化子基因组dna为模板，hxt3-dg-fw，hxt3-dg-rv为引物，进行pcr扩增。pcr反应体系25μl组成如下：10×pcrbuffer(mg2+plus)10μl；dntpmixture(各2.5mm)4μl；引物hxt3-dg-fw，hxt3-dg-rv各10μm，0.5μl；takarataqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl；转化子dna30-50ng；以灭菌双蒸水补加至25μl。pcr扩增程序为：将上述25μl反应体系在95.0℃预变性4min，95.0℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min50s，上述过程进行30个循环后，于4℃保存。获得的基因片段用hxt3-mdg-f为引物于擎科生物技术有限公司(成都)进行测序，与设计的m-hxt3-repair序列进行比对，以筛选正确的转化子；
(10)脱除cas9-nat质粒以及pmel13-m-hxt3-grna质粒：针对上述步骤的阳性转化子，在营养丰富的ypd培养基中30℃，160rpm进行试管过夜培养，稀释一定倍数后，涂布于ypd平板上。之后挑取单菌落分别于ypd平板，ypd/g418平板，ypd/nat平板上，于30℃静置培养2-3天，选取在ypd上生长，而不在含有抗性平板上生长的菌落再次重复这样的筛选，最终得到的菌株即为不含cas9-nat质粒以及pmel13-m-hxt3-grna质粒的菌株；
(11)试管发酵筛选高木糖消耗率seb6kan-m-hxt3菌株：从上述步骤中得到的菌株于35℃，140rpm条件下，利用ypdx(10g/lyeastextract酵母浸出粉、20g/lpeptone蛋白胨、40g/ld-xylose木糖，60g/lglucose葡萄糖)进行试管发酵，根据发酵结果筛选出一株高木糖消耗菌株；
利用管发酵筛选高木糖消耗率seb6kan-m-hxt3菌株的结果如表2所示：
表2试管发酵筛选高木糖消耗率seb6kan-m-hxt3菌株
根据表2的结果可知：酿酒酵母菌株编号为m5的木糖消耗速率最快，发酵生产木糖醇的性能优越，收率可达到理论值1.0，与出发菌株seb6kan相比，木糖消耗速率提高80.6％，木糖醇产量提高93.5％，记m5为seb10。
(12)发酵罐评价：用上述步骤中筛选出的一株菌与出发菌株作比较，将这两株接种于2％ypd平板，30℃恒温箱内培养1d；预培养：将活化后的菌株接种于含100ml2％ypd液体培养基的锥形瓶(规格500ml)中，30℃160rpm过夜培养16h。发酵：按照干重为0.5g/l接种于1l发酵罐中在35℃，300rpm，曝气率0.13vvm条件下，利用工作体积为600ml的ypdx(10g/lyeastextract酵母浸出粉、20g/lpeptone蛋白胨、45g/ld-xylose木糖，60g/lglucose葡萄糖)进行发酵，8h后，补加600g/l的葡萄糖溶液，补加速率为1ml/h。采样时间分别为0h，3h，8h，20h，24h，28h，32h以及48h，56h，72h每个采样点采样5ml；
(13)发酵参数的测定：评价菌株生长情况是在紫外分光光度计600nm处测600nm的吸光度值记为od600，通过od600与载体酿酒酵母菌株干重的关系，计算出重组酵母干重；通过气象色谱仪gc(353b)(glscienceinc.公司)测出乙醇含量，通过hplc(shimadzu)液相色谱仪测出葡萄糖、木糖以及木糖醇的含量。
(14)计算相关代谢参数：通过计算消耗的木糖以及产生的木糖醇的数据，计算木糖消耗率以及木糖醇的产率；筛选出木糖消耗速率最快的菌株作为最优菌株。由上述实施例可知，本发明利用crispr/cas9系统敲除xks1基因构建了能高效产木糖醇的工业酿酒酵母菌株，其与出发菌株相比，能有效提高木糖醇的收率和木糖醇产量，该菌株具有良好的应用前景。
出发菌株seb6kan发酵罐发酵和hxt3(n367a)突变菌株seb10发酵罐发酵的发酵示意图分别如图1和图2所示，两者的发酵罐发酵木糖醇产率比较如表3所示：
表3发酵罐发酵木糖醇产率比较
根据图1，图2以及表3的结果可知：通过基因工程将转运蛋白hxt3的367位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸，所构建的酿酒酵母菌株seb10在以初始高浓度葡萄糖与木糖的混合发酵中，与出发菌株seb6kan相比，木糖消耗速率提高了约12％，木糖醇乙醇产量均有所提升，木糖醇产量提升了13％，乙醇产量提升了22.3％。木糖醇收率可接近理论值1.0。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110>中石化上海工程有限公司
<120>一株共发酵木糖和葡萄糖以高产木糖醇及乙醇的工业酿酒酵母菌株及构建方法
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>10447
<212>dna
<213>cas9-nat质粒(人工序列)
<400>1
gacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggttt60
cttagacggatcgcttgcctgtaacttacacgcgcctcgtatcttttaatgatggaataa120
tttgggaatttactctgtgtttatttatttttatgttttgtatttggattttagaaagta180
aataaagaaggtagaagagttacggaatgaagaaaaaaaaataaacaaaggtttaaaaaa240
tttcaacaaaaagcgtactttacatatatatttattagacaagaaaagcagattaaatag300
atatacattcgattaacgataagtaaaatgtaaaatcacaggattttcgtgtgtggtctt360
ctacacagacaagatgaaacaattcggcattaatacctgagagcaggaagagcaagataa420
aaggtagtatttgttggcgatccccctagagtcttttacatcttcggaaaacaaaaacta480
ttttttctttaatttctttttttactttctatttttaatttatatatttatattaaaaaa540
tttaaattataattatttttatagcacgtgatgaaaaggacccaggtggcacttttcggg600
gaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgc660
tcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagta720
ttcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttg780
ctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgg840
gttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaac900
gttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattg960
acgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagt1020
actcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtg1080
ctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggac1140
cgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgtt1200
gggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtag1260
caatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggc1320
aacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggccc1380
ttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggta1440
tcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacgg1500
ggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactga1560
ttaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaac1620
ttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaa1680
tcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggat1740
cttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgc1800
taccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactg1860
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccacc1920
acttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtgg1980
ctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccgg2040
ataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaa2100
cgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccg2160
aagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacga2220
gggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctct2280
gacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgcca2340
gcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttc2400
ctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccg2460
ctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcc2520
caatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgaca2580
ggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttacctcactc2640
attaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcctatgttgtgtggaattgtga2700
gcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcgcgcaatta2760
accctcactaaagggaacaaaagctggagctcatagcttcaaaatgtttctactcctttt2820
ttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagc2880
acagcatactaaatttcccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaa2940
ggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataa3000
aaatttttatcacgtttctttttcttgaaaattttttttttgatttttttctctttcgat3060
gacctcccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcat3120
ttttcttgttctattacaactttttttacttcttgctcattagaaagaaagcatagcaat3180
ctaatctaagttttctagaactagtggatcccccgggaaaaatggacaagaagtactcca3240
ttgggctcgatatcggcacaaacagcgtcggttgggccgtcattacggacgagtacaagg3300
tgccgagcaaaaaattcaaagttctgggcaataccgatcgccacagcataaagaagaacc3360
tcattggcgccctcctgttcgactccggggagacggccgaagccacgcggctcaaaagaa3420
cagcacggcgcagatatacccgcagaaagaatcggatctgctacctgcaggagatcttta3480
gtaatgagatggctaaggtggatgactctttcttccataggctggaggagtcctttttgg3540
tggaggaggataaaaagcacgagcgccacccaatctttggcaatatcgtggacgaggtgg3600
cgtaccatgaaaagtacccaaccatatatcatctgaggaagaagcttgtagacagtactg3660
ataaggctgacttgcggttgatctatctcgcgctggcgcatatgatcaaatttcggggac3720
acttcctcatcgagggggacctgaacccagacaacagcgatgtcgacaaactctttatcc3780
aactggttcagacttacaatcagcttttcgaagagaacccgatcaacgcatccggagttg3840
acgccaaagcaatcctgagcgctaggctgtccaaatcccggcggctcgaaaacctcatcg3900
cacagctccctggggagaagaagaacggcctgtttggtaatcttatcgccctgtcactcg3960
ggctgacccccaactttaaatctaacttcgacctggccgaagatgccaagcttcaactga4020
gcaaagacacctacgatgatgatctcgacaatctgctggcccagatcggcgaccagtacg4080
cagacctttttttggcggcaaagaacctgtcagacgccattctgctgagtgatattctgc4140
gagtgaacacggagatcaccaaagctccgctgagcgctagtatgatcaagcgctatgatg4200
agcaccaccaagacttgactttgctgaaggcccttgtcagacagcaactgcctgagaagt4260
acaaggaaattttcttcgatcagtctaaaaatggctacgccggatacattgacggcggag4320
caagccaggaggaattttacaaatttattaagcccatcttggaaaaaatggacggcaccg4380
aggagctgctggtaaagcttaacagagaagatctgttgcgcaaacagcgcactttcgaca4440
atggaagcatcccccaccagattcacctgggcgaactgcacgctatcctcaggcggcaag4500
aggatttctacccctttttgaaagataacagggaaaagattgagaaaatcctcacatttc4560
ggataccctactatgtaggccccctcgcccggggaaattccagattcgcgtggatgactc4620
gcaaatcagaagagaccatcactccctggaacttcgaggaagtcgtggataagggggcct4680
ctgcccagtccttcatcgaaaggatgactaactttgataaaaatctgcctaacgaaaagg4740
tgcttcctaaacactctctgctgtacgagtacttcacagtttataacgagctcaccaagg4800
tcaaatacgtcacagaagggatgagaaagccagcattcctgtctggagagcagaagaaag4860
ctatcgtggacctcctcttcaagacgaaccggaaagttaccgtgaaacagctcaaagaag4920
actatttcaaaaagattgaatgtttcgactctgttgaaatcagcggagtggaggatcgct4980
tcaacgcatccctgggaacgtatcacgatctcctgaaaatcattaaagacaaggacttcc5040
tggacaatgaggagaacgaggacattcttgaggacattgtcctcacccttacgttgtttg5100
aagatagggagatgattgaagaacgcttgaaaacttacgctcatctcttcgacgacaaag5160
tcatgaaacagctcaagaggcgccgatatacaggatgggggcggctgtcaagaaaactga5220
tcaatgggatccgagacaagcagagtggaaagacaatcctggattttcttaagtccgatg5280
gatttgccaaccggaacttcatgcagttgatccatgatgactctctcacctttaaggagg5340
acatccagaaagcacaagtttctggccagggggacagtcttcacgagcacatcgctaatc5400
ttgcaggtagcccagctatcaaaaagggaatactgcagaccgttaaggtcgtggatgaac5460
tcgtcaaagtaatgggaaggcataagcccgagaatatcgttatcgagatggcccgagaga5520
accaaactacccagaagggacagaagaacagtagggaaaggatgaagaggattgaagagg5580
gtataaaagaactggggtcccaaatccttaaggaacacccagttgaaaacacccagcttc5640
agaatgagaagctctacctgtactacctgcagaacggcagggacatgtacgtggatcagg5700
aactggacatcaatcggctctccgactacgacgtggatcatatcgtgccccagtcttttc5760
tcaaagatgattctattgataataaagtgttgacaagatccgataaaaatagagggaaga5820
gtgataacgtcccctcagaagaagttgtcaagaaaatgaaaaattattggcggcagctgc5880
tgaacgccaaactgatcacacaacggaagttcgataatctgactaaggctgaacgaggtg5940
gcctgtctgagttggataaagccggcttcatcaaaaggcagcttgttgagacacgccaga6000
tcaccaagcacgtggcccaaattctcgattcacgcatgaacaccaagtacgatgaaaatg6060
acaaactgattcgagaggtgaaagttattactctgaagtctaagctggtctcagatttca6120
gaaaggactttcagttttataaggtgagagagatcaacaattaccaccatgcgcatgatg6180
cctacctgaatgcagtggtaggcactgcacttatcaaaaaatatcccaagcttgaatctg6240
aatttgtttacggagactataaagtgtacgatgttaggaaaatgatcgcaaagtctgagc6300
aggaaataggcaaggccaccgctaagtacttcttttacagcaatattatgaattttttca6360
agaccgagattacactggccaatggagagattcggaagcgaccacttatcgaaacaaacg6420
gagaaacaggagaaatcgtgtgggacaagggtagggatttcgcgacagtccggaaggtcc6480
tgtccatgccgcaggtgaacatcgttaaaaagaccgaagtacagaccggaggcttctcca6540
aggaaagtatcctcccgaaaaggaacagcgacaagctgatcgcacgcaaaaaagattggg6600
accccaagaaatacggcggattcgattctcctacagtcgcttacagtgtactggttgtgg6660
ccaaagtggagaaagggaagtctaaaaaactcaaaagcgtcaaggaactgctgggcatca6720
caatcatggagcgatcaagcttcgaaaaaaaccccatcgactttctcgaggcgaaaggat6780
ataaagaggtcaaaaaagacctcatcattaagcttcccaagtactctctctttgagcttg6840
aaaacggccggaaacgaatgctcgctagtgcgggcgagctgcagaaaggtaacgagctgg6900
cactgccctctaaatacgttaatttcttgtatctggccagccactatgaaaagctcaaag6960
ggtctcccgaagataatgagcagaagcagctgttcgtggaacaacacaaacactaccttg7020
atgagatcatcgagcaaataagcgaattctccaaaagagtgatcctcgccgacgctaacc7080
tcgataaggtgctttctgcttacaataagcacagggataagcccatcagggagcaggcag7140
aaaacattatccacttgtttactctgaccaacttgggcgcgcctgcagccttcaagtact7200
tcgacaccaccatagacagaaagcggtacacctctacaaaggaggtcctggacgccacac7260
tgattcatcagtcaattacggggctctatgaaacaagaatcgacctctctcagctcggtg7320
gagacagcagggctgaccccaagaagaagaggaaggtgtgatctcttctcgagtcatgta7380
attagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaagga7440
aggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtatt7500
aagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatg7560
taacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttg7620
cggccggtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgtt7680
ttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacat7740
ccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacag7800
ttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg7860
ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcct7920
ttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaat7980
cgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaactt8040
gattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttg8100
acgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaac8160
cctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggtta8220
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttaca8280
atttcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcataggca8340
agtgcacaaacaatacttaaataaatactactcagtaataacctatttcttagcattttt8400
gacgaaatttgctattttgttagagtcttttacaccatttgtctccacacctccgcttac8460
atcaacaccaataacgccatttaatctaagcgcatcaccaacattttctggcgtcagtcc8520
accagctaacataaaatgtaagctttcggggctctcttgccttccaacccagtcagaaat8580
cgagttccaatccaaaagttcacctgtcccacctgcttctgaatcaaacaagggaataaa8640
cgaatgaggtttctgtgaagctgcactgagtagtatgttgcagtcttttggaaatacgag8700
tcttttaataactggcaaaccgaggaactcttggtattcttgccacgactcatctccatg8760
cagttggacgatatcaatgccgtaatcattgaccagagccaaaacatcctccttaggttg8820
attacgaaacacgccaaccaagtatttcggagtgcctgaactatttttatatgcttttac8880
aagacttgaaattttccttgcaataaccgggtcaattgcgttttcgacactggatggcgg8940
cgttagtatcgaatcgacagcagtatagcgaccagcattcacatacgattgacgcatgat9000
attactttctgcgcacttaacttcgcatctgggcagatgatgtcgaggcgaaaaaaaata9060
taaatcacgctaacatttgattaaaatagaacaactacaatataaaaaaactatacaaat9120
gacaagttcttgaaaacaagaatctttttattgtcagtactgattaggggcagggcatgc9180
tcatgtagagcgcctgctcgccgtccgaggcggtgccgtcgtacagggcggtgtccaggc9240
cgcagagggtgaaccccatccgccggtacgcgtggatcgccggtgcgttgacgttggtga9300
cctccagccagaggtgcccggcgccccgctcgcgggcgaactccgtcgcgagccccatca9360
acgcgcgcccgaccccgtgcccccggtgctccggggcgacctcgatgtcctcgacggtca9420
gccggcggttccagccggagtacgagacgaccacgaagcccgccaggtcgccgtcgtccc9480
cgtacgcgacgaacgtccgggagtccgggtcgccgtcctccccgtcgtccgattcgtcgt9540
ccgattcgtcgtcggggaacaccttggtcaggggcgggtccaccggcacctcccgcaggg9600
tgaagccgtccccggtggcggtgacgcggaagacggtgtcggtggtgaaggacccatcca9660
gtgcctcgatggcctcggcgtcccccgggacactggtgcggtaccggtaagccgtgtcgt9720
caagagtggtacccatggttgtttatgttcggatgtgatgtgagaactgtatcctagcaa9780
gattttaaaaggaagtatatgaaagaagaacctcagtggcaaatcctaaccttttatatt9840
tctctacaggggcgcggcgtggggacaattcaacgcgtctgtgaggggagcgtttccctg9900
ctcgcaggtctgcagcgaggagccgtaatttttgcttcgcgccgtgcggccatcaaaatg9960
tatggatgcaaatgattatacatggggatgtatgggctaaatgtacgggcgacagtcaca10020
tcatgcccctgagctgcgcacgtcaagactgtcaaggagggtattctgggcctccatgtc10080
gctggccgggtgacccggcggggacaaggcaagctaaacagatctacgtaaggtgacaag10140
ctatttttcaataaagaatatcttccactactgccatctggcgtcataactgcaaagtac10200
acatatattacgatgctgttctattaaatgcttcctatattatatatatagtaatgtcgt10260
ttatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacac10320
ccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacaga10380
caagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa10440
cgcgcga10447
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>cas9-dg-f引物(人工序列)
<400>2
tcacccttacgttgtttgaa20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>cas9-dg-r引物(人工序列)
<400>3
aggggacgttatcactcttc20
<210>4
<211>6130
<212>dna
<213>pmel13质粒(人工序列)
<400>4
acaggcaacacgcagatataggtgcgacgtgaacagtgagctgtatgtgcgcagctcgcg60
ttgcattttcggaagcgctcgttttcggaaacgctttgaagttcctattccgaagttcct120
attctctagaaagtataggaacttcagagcgcttttgaaaaccaaaagcgctctgaagac180
gcactttcaaaaaaccaaaaacgcaccggactgtaacgagctactaaaatattgcgaata240
ccgcttccacaaacattgctcaaaagtatctctttgctatatatctctgtgctatatccc300
tatataacctacccatccacctttcgctccttgaacttgcatctaaactcgacctctaca360
ttttttatgtttatctctagtattactctttagacaaaaaaattgtagtaagaactattc420
atagagtgaatcgaaaacaatacgaaaatgtaaacatttcctatacgtagtatatagaga480
caaaatagaagaaaccgttcataattttctgaccaatgaagaatcatcaacgctatcact540
ttctgttcacaaagtatgcgcaatccacatcggtatagaatataatcggggatgccttta600
tcttgaaaaaatgcacccgcagcttcgctagtaatcagtaaacgcgggaagtggagtcag660
gctttttttatggaagagaaaatagacaccaaagtagccttcttctaaccttaacggacc720
tacagtgcaaaaagttatcaagagactgcattatagagcgcacaaaggagaaaaaaagta780
atctaagatgctttgttagaaaaatagcgctctcgggatgcatttttgtagaacaaaaaa840
gaagtatagattctttgttggtaaaatagcgctctcgcgttgcatttctgttctgtaaaa900
atgcagctcagattctttgtttgaaaaattagcgctctcgcgttgcatttttgttttaca960
aaaatgaagcacagattcttcgttggtaaaatagcgctttcgcgttgcatttctgttctg1020
taaaaatgcagctcagattctttgtttgaaaaattagcgctctcgcgttgcatttttgtt1080
ctacaaaatgaagcacagatgcttcgttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcgga1140
acccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataa1200
ccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgt1260
gtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacg1320
ctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactg1380
gatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatg1440
agcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagag1500
caactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcaca1560
gaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatg1620
agtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaacc1680
gcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctg1740
aatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacg1800
ttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagac1860
tggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctgg1920
tttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactg1980
gggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaact2040
atggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaa2100
ctgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaattt2160
aaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgag2220
ttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcct2280
ttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtt2340
tgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcg2400
cagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactct2460
gtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggc2520
gataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcgg2580
tcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaa2640
ctgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcg2700
gacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccaggg2760
ggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga2820
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggccttt2880
ttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccct2940
gattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccga3000
acgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccg3060
cctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactgg3120
aaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttacctcactcattaggcaccccag3180
gctttacactttatgcttccggctcctatgttgtgtggaattgtgagcggataacaattt3240
cacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcgcgcaattaaccctcactaaagg3300
gaacaaaagctggagcttctttgaaaagataatgtatgattatgctttcactcatattta3360
tacagaaacttgatgttttctttcgagtatatacaaggtgattacatgtacgtttgaagt3420
acaactctagattttgtagtgccctcttgggctagcggtaaaggtgcgcattttttcaca3480
ccctacaatgttctgttcaaaagattttggtcaaacgctgtagaagtgaaagttggtgcg3540
catgtttcggcgttcgaaacttctccgcagtgaaagataaatgatcgatacgttctctat3600
ggaggagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttga3660
aaaagtggcaccgagtcggtggtgctttttttgttttttatgtcttcgagtcatgtaatt3720
agttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaagg3780
agttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaag3840
aacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaa3900
cattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcgg3960
ccggtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgtttta4020
caacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccc4080
cctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttg4140
cgcagcctgaatggcgaatggcgcgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggt4200
gtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttc4260
gctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgg4320
gggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgat4380
tagggtgatggttcacgtagtgggccgttgaacattcttaggctggtcgaatcatttaga4440
cacgggcatcgtcctctcgaaaggtggcataggccactagtggatctgatatcacctaat4500
aacttcgtatagcatacattatacgaagttatattaagggttctcgagagctcgttttcg4560
acactggatggcggcgttagtatcgaatcgacagcagtatagcgaccagcattcacatac4620
gattgacgcatgatattactttctgcgcacttaacttcgcatctgggcagatgatgtcga4680
ggcgaaaaaaaatataaatcacgctaacatttgattaaaatagaacaactacaatataaa4740
aaaactatacaaatgacaagttcttgaaaacaagaatctttttattgtcagtactgatta4800
gaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaatacc4860
atatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccatag4920
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctat4980
taatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactga5040
atccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagcc5100
attacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgc5160
ctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatg5220
caaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattc5280
ttctaatacctggaatgctgttttgccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatc5340
aggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttag5400
tctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaa5460
ctctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacatt5520
atcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcct5580
cgaaacgtgagtcttttccttacccatggttgtttatgttcggatgtgatgtgagaactg5640
tatcctagcaagattttaaaaggaagtatatgaaagaagaacctcagtggcaaatcctaa5700
ccttttatatttctctacaggggcgcggcgtggggacaattcaacgcgtctgtgagggga5760
gcgtttccctgctcgcaggtctgcagcgaggagccgtaatttttgcttcgcgccgtgcgg5820
ccatcaaaatgtatggatgcaaatgattatacatggggatgtatgggctaaatgtacggg5880
cgacagtcacatcatgcccctgagctgcgcacgtcaagactgtcaaggagggtattctgg5940
gcctccatgtcgctggccgggtgacccggcggggacgaggcaagctaaacagatctctag6000
acctaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatattaagggttgtcgacctgca6060
gcgtacgaaggtgcctattgatgatctggcggaatgtctgccgtgccatagccatgcctt6120
cacatatagt6130
<210>5
<211>40
<212>dna
<213>6006-fv引物(人工序列)
<400>5
gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtc40
<210>6
<211>27
<212>dna
<213>6005-rw引物(人工序列)
<400>6
gatcatttatctttcactgcggagaag27
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>hxt3-dg-fwhxt3编码区验证引物(人工序列)
<400>7
tcggtcgcggattatcacag20
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>hxt3-dg-rvhxt3编码区验证引物(人工序列)
<400>8
ggctcgaaaatggttggtgg20
<210>9
<211>120
<212>dna
<213>m-hxt3-grna识别hxt3基因的grna片段(人工序列)
<400>9
tgcgcatgtttcggcgttcgaaacttctccgcagtgaaagataaatgatcttgtacactg60
tcgatcgtttgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaac120
<210>10
<211>20
<212>dna
<213>hxt3-mdg-f测序引物(人工序列)
<400>10
gctttgtttatgatcggtgg20
<210>11
<211>144
<212>dna
<213>m-hxt3-repairhxt3单突变修复重组片段(人工序列)
<400>11
gttggtatgagtgattctttcgaaacttctattgttttcggtgtcgtcgccttcttctct60
acttgttgttctttgtacaccgttgacagattcggacgtcgtaactgtctgttatatggt120
gccgttggtatggtctgctgttat144
<210>12
<211>20
<212>dna
<213>pmel13-cxf测序引物(人工序列)
<400>12
acttgatgttttctttcgag20