利用叶绿体标记鉴别玉米雄性不育S型胞质类型的制作方法

文档序号：14751337发布日期：2018-06-22 18:25阅读：283来源：国知局

本发明属于农作物分子生物学技术领域，具体地说，涉及利用叶绿体标记鉴别玉米雄性不育S型胞质类型。

背景技术：

玉米是最早实现杂种优势利用的作物，其杂交种的选育和利用被誉为作物生产上的一次革命。玉米杂交种制种方法有常规和雄性不育两种方法，利用雄性不育配制玉米杂交种，不仅节省大量劳动力，降低成本，而且还可以提高杂交种纯度，提高产量。

玉米雄性不育(male sterile，MS)是指玉米的雄蕊发育异常产生无功能花粉而雌蕊发育正常能够正常授粉结实的现象。玉米雄性不育大体可分为细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)和细胞核雄性不育(genetic male sterility,GMS)两类。细胞质雄性不育(CMS)是由细胞核和细胞质基因共同控制的核质互作型雄性不育系，容易实现不育系、保持系和恢复系的配套，是玉米育种和良种生产上利用的主要雄性不育类型。至今已发现了200多种不同胞质来源的CMS材料，依据雄花育性恢复的专效反应，将CMS材料分为S型、C型和T型三种类型，不同类型的材料雄花育性反应及细胞质效应表现不同。

采用CMS制种需要解决三个问题，第一雄性不育胞质类型鉴定，第二雄性不育材料纯度鉴定，第三利用不育系配制杂交种的鉴定。因此获得一套适于鉴定CMS材料的位点组合具有十分重要的意义。叶绿体基因组信息由于具有以下优势而被广泛应用于植物品种、种质资源鉴定，亲缘关系评价，系统进化，细胞质遗传特性等研究和应用中。(1)叶绿体基因组较小且相对保守，其全序列容易获得；(2)叶绿体基因是母系遗传，不同个体间基因的交换和融合很少发生，叶绿体各基因间有很好的共线性；(3)叶绿体基因组除反向重复区外均为单拷贝基因，几乎不存在旁系同源基因干扰；(4)叶绿体编码区与非编码区进化速度差异显著，存在一些高突变区，可以解决种以下分类单元问题。由于CMS是与细胞质密切相关的，采用叶绿体基因组上标记位点鉴定不育胞质类型是一种稳定、可靠、创新的方法。开发适于CMS材料鉴定的叶绿体SNP或InDel标记位点，多个位点组合的同时使用，可以增强鉴定可靠性减少不确定性。

已报道玉米雄性不育胞质类型鉴定方法有大田育性观察，细胞学差异比较，育性恢复专效性鉴定，标记位点PCR扩增等方法。前三种方法鉴定周期长，鉴定材料范围受限；基于PCR方法目前没有报道针对叶绿体基因组开发SNP或InDel位点的玉米雄性不育胞质类型的鉴定方法，不能实现高通量、自动化的鉴定。基于叶绿体基因组开发用于玉米CMS类型鉴定的标记位点和方法尚未报道。因此，利用高质量的重测序数据开发一套适于玉米雄性不育S型胞质类型的叶绿体分子标记位点非常必要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供用于鉴别玉米雄性不育S型胞质类型的分子标记。

为了实现本发明目的，本发明通过收集来源广泛、表型和基因型丰富、代表性强的170份玉米自交系材料(包括了三种CMS类型材料)，获得叶绿体基因组序列，比较核苷酸多态性，开发鉴定玉米雄性不育S型胞质类型的SNP和InDel位点。主要步骤是：(1)选取170份玉米代表性试验材料，类型包括我国所有杂种优势群，甜糯、地方品种、CMS不育类型等样品。(2)高浓度、高质量总DNA制备。(3)基于二代测序平台的高通量测序，构建文库大小为500bp、PE140、测序深度为5倍。(4)全基因组序列数据处理、叶绿体基因组拼接，使用两个软件独立拼接，基于玉米B73叶绿体基因组序列利用BLAST程序筛选属于叶绿体基因组的contig，进行组装，验证序列准确性。(5)叶绿体基因组注释、多态位点确定，利用DOGMA软件注释叶绿体基因组。(6)170份材料叶绿体基因组序列进行比对，筛选出100个SNP/InDel叶绿体基因组变异位点。(7)玉米S型不育胞质类型鉴定特异位点的确定，分析不同类群之间的Fst值(遗传分化系数)，Fst值大于0.9则为类群特异位点，玉米S型不育类型材料分析获得20个特异位点，包括17个SNP位点和3个InDel位点。位点具体信息见表1，位点的物理位置是基于玉米品种B73叶绿体基因组序列比对确定的。本发明中适于鉴别玉米雄性不育S型胞质类型的20个叶绿体位点开发的技术路线图见图1。

本发明提供了用于鉴别玉米雄性不育S型胞质的分子标记，包括以下20个分子标记中的任一或多个分子标记，所述20个分子标记为17个SNP分子标记和3个InDel分子标记，它们的信息见表1。

表1

由于本发明提供的上述20个SNP/InDel位点均为二态标记，所以该分子标记任一或多个的分子标记组合可以基于KASP平台实现基因分型数据的获得。具体方案为，根据KASP技术要求针对于本发明提供的位点设计引物，引物为普通引物不含荧光集团；购置KASP技术配套的PCR扩增体系MasterMix；配置反应体系加入DNA、引物和MasterMix；运行反应程序；原位扫描荧光信号；数据分析获得基因型数据。

除位点编号为CPMIDP11的分子标记外，其他分子标记分别通过以下引物扩增得到：CPMSNP08，SEQ ID NO.41-43；CPMSNP09，SEQ ID NO.44-46；CPMSNP10，SEQ ID NO.47-49；CPMSNP12，SEQ ID NO.50-52；CPMSNP26，SEQ ID NO.53-55；CPMSNP28，SEQ ID NO.56-58；CPMSNP31，SEQ ID NO.59-61；CPMSNP33，SEQ ID NO.62-64；CPMSNP37，SEQ ID NO.65-67；CPMSNP45，SEQ ID NO.68-70；CPMSNP49，SEQ ID NO.71-73；CPMSNP52，SEQ ID NO.74-76；CPMSNP60，SEQ ID NO.77-79；CPMSNP65，SEQ ID NO.80-82；CPMSNP66，SEQ ID NO.83-85；CPMSNP79，SEQ ID NO.86-88；CPMSNP96，SEQ ID NO.89-91；CPMIDP01，SEQ ID NO.92-95；CPMIDP02SEQ ID NO.96-98。

进一步地，本发明提供了用于检测本发明所述分子标记的特异性引物组合，具体为以下任意一组：CPMSNP08，SEQ ID NO.41-43；CPMSNP09，SEQ ID NO.44-46；CPMSNP10，SEQ ID NO.47-49；CPMSNP12，SEQ ID NO.50-52；CPMSNP26，SEQ ID NO.53-55；CPMSNP28，SEQ ID NO.56-58；CPMSNP31，SEQ ID NO.59-61；CPMSNP33，SEQ ID NO.62-64；CPMSNP37，SEQ ID NO.65-67；CPMSNP45，SEQ ID NO.68-70；CPMSNP49，SEQ ID NO.71-73；CPMSNP52，SEQ ID NO.74-76；CPMSNP60，SEQ ID NO.77-79；CPMSNP65，SEQ ID NO.80-82；CPMSNP66，SEQ ID NO.83-85；CPMSNP79，SEQ ID NO.86-88；CPMSNP96，SEQ ID NO.89-91；CPMIDP01，SEQ ID NO.92-95；CPMIDP02SEQ ID NO.96-98。

虽然本发明实施例未提供CPMIDP11位点的扩增引物，但本领域技术人员可以针对位点编号为CPMIDP11设计合适的特异性引物，并基于表1给出的CPMIDP11的位点信息，能够实现对玉米C型雄性不育胞质类型的鉴定，因此位点编号为CPMIDP11的分子标记以及其可用于鉴别玉米C型雄性不育胞质类型这一用途属于本发明保护的范围。

进一步地，本发明提供了上述分子标记在鉴定玉米雄性不育S型胞质类型中的应用。

本发明提供了上述分子标记在鉴定玉米S型胞质雄性不育系配制的杂交种中的应用。

本发明提供了上述分子标记在鉴定S型胞质雄性不育玉米材料中的应用。

本发明提供了上述分子标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。

本发明提供了上述分子标记在玉米种质资源鉴定中的应用。

上述的应用，具体包括以下步骤：

1)提取待测玉米样品的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，根据所述分子标记，基于KASP检测平台技术分别设计引物，进行PCR扩增；

3)采用荧光检测仪分析PCR产物。

其中，步骤2)PCR扩增程序为：94℃15min；94℃20s，61℃1min，循环10次，每个循环降低0.6℃；94℃20s，58℃1min，循环30次。

上述步骤3)中，若PCR产物如果与表1所述等位基因相同则为S型不育单株，如果为另一个等位基因则不属于S型不育单株。

本发明提供了上述分子标记在鉴定S型胞质雄性不育玉米材料纯度中的应用。

在鉴定S型胞质雄性不育玉米材料纯度的具体过程中，包括以下步骤：

1)提取待测玉米样品的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，根据本发明上述分子标记，基于KASP检测平台技术分别设计引物，进行PCR扩增；

3)采用荧光检测仪分析PCR产物；

4)若PCR产物如果与所述等位基因相同则为S型不育单株，如果为另一个等位基因则不属于S型不育单株；每个位点均进行纯度计算，计算方法为：(S型不育单株数目/检测的总单株数目)×100％。

本发明的关键点在于：

(1)玉米叶绿体基因组数据分离：从全基因组数据中分离得到叶绿体基因组数据是本发明的难点和关键点。由于叶绿体基因组序列相对保守，并且测序质量和长度足够，因此在本发明中叶绿体基因组数据获得是通过拼接的方案，同时结合与玉米叶绿体参考基因组比对方式。玉米叶绿体基因组数据获得主要步骤为，利用Blast程序筛选叶绿体基因组的contig，使用Sequencher软件组装叶绿体基因组contig，组装好的序列与玉米叶绿体参考基因组(玉米品种B73，AGPv3)进行比对验证确认，为获得准确可靠的叶绿体基因组序列提供保障。

(2)叶绿体变异位点挖掘：通过代表性样品选取、高质量测序数据、精确数据分析保证获得叶绿体多态位点的准确性和高效性。在本发明中选取来源广泛、表型和基因型丰富的170份材料，基于拼接的170个叶绿体基因组序列，利用DnaSp 5.0统计变异位点和序列多态，最终确定叶绿体多态位点，其中不同遗传背景材料，高质量基因序列均是获得准确可靠叶绿体多态位点的重要因素。

(3)玉米S型不育胞质类型鉴定位点确定：通过将所有类型玉米自交系(包括T、C、S三类CMS材料)的叶绿体基因组的变异位点进行分析，筛选出S型不育材料的特异位点，特异位点的表现为S型不育与其它所有类型的自交系材料的基因型均不同，属于S型不育材料的特有位点。

本发明具有以下优点：本发明鉴于叶绿体基因组的特征，基于高质量的重测序数据开发一组玉米叶绿体基因组SNP分子标记和InDel分子标记及这些分子标记的组合，可用于鉴定玉米S型雄性不育胞质和正常胞质的种质材料，可用于鉴定S型不育制种和常规制种的杂交种，还可用于鉴定S型不育材料的纯度。本发明提供的分子标记为玉米S型细胞质不育制种、不育材料选育提供了鉴定技术支持，为玉米三系配套种子生产提供了强有力保障。

附图说明

图1为本发明实施例1中适于鉴定玉米雄性不育S型胞质类型的20个叶绿体位点获得的技术路线图。

图2为利用本发明提供的除位点编号为CPMIDP11的分子标记外，其他19对引物鉴别玉米自交系或杂交种是否为S型不育的分析结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本发明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

实施例1与玉米雄性不育S型胞质类型相关的玉米叶绿体基因组分子标记的获得

(1)样品选取：选取170份具有广泛代表性的玉米自交系进行全基因组测序。这170份样品包括普通玉米、糯玉米、甜玉米、爆裂玉米等玉米类型；包括了我国所有杂种优势群，唐四平头、旅大红骨、瑞德、兰卡、改良瑞德、改良兰卡、P群、地方品种，以及T、C、S三种细胞质不育类型材料。

(2)样品制备：170份玉米样品的种子在培养箱内发苗5天，前3天为无光照条件，后2天为光照条件(即出土之后给予充足光照)。每个样品从中选取30株绿苗叶片并混合，液氮条件下充分研磨。总DNA采用CTAB法提取，并去除RNA。用紫外分光光度计和琼脂糖电泳分别检测所提取DNA的质量，琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有降解；紫外分光光度计检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA没有蛋白污染，RNA含量低)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA盐离子含量低)；DNA浓度大于1000ng/μL。

(3)总DNA高通量测序：对170份玉米样本DNA和PCR产物采用超声打断，切胶回收400-600bp的DNA片段，利用的建库试剂盒构建500bp大小的文库，利用Hiseq 4000PE150的测序平台进行测序，测序深度为5倍，平均每个样本获得约10GB数据。

(4)高通量测序数据处理、叶绿体基因组拼接：高通量测序数据分别独立使用SPAdes(Bankevich et al.,2012)和SOAPdenovo2(Luo et al.,2012)两个软件进行拼接。对于每个软件拼接的contig利用Blast程序进行筛选出叶绿体基因组的contig(Altschul et al.,1997)；筛选出的叶绿体基因组contig使用Sequencher进行组装。然后使用Geneious 8.1(Kearse et al.,2012)把所有的reads map到拼接好的叶绿体基因组序列上，验证拼接成的contig序列是否正确。

(5)叶绿体基因组注释、多态位点确定：叶绿体基因组注释用DOGMA(Dual Organellar Geno Me Annotator)(Wyman et al.,2004)进行，用BLASTX和BLASTN搜索鉴定编码基因的位置。170个玉米叶绿体基因组用MAFFT软件进行比对(Katoh and Standley,2013)，然后用Se-al软件进行手工调整比对结果。对于序列里面出现的倒位比对的原则是进行拉开，以免造成错误的数据多态性。利用DnaSp 5.0统计两个叶绿体基因组中的变异位点和序列多态性(Librado and Rozas,2009)，开发获得100个SNP/INDEL多态位点。

(6)适于鉴别玉米S型不育胞质类型位点的确定：基于170份玉米代表性材料的100个SNP/INDEL多态基因型数据，利用VCFtools软件中的weir-fst-pop功能分析不同类群之间的Fst值，即不同类群之间的遗传分化系数，Fst值大于0.9认为该位点为类群特异位点。玉米S型不育类型材料分析获得20个特异位点，包括17个SNP位点和3个IDNEL位点。位点具体信息见表1，位点的物理位置是基于玉米品种B73叶绿体基因组序列比对确定的。本发明中用于鉴别玉米雄性不育S型胞质类型的20个叶绿体位点开发的技术路线图见图1。

实施例2利用本发明获得的分子标记鉴定玉米S型胞质不育自交系

从96个玉米自交系样品中鉴定出S型胞质不育自交系样品，具体方法如下。

待鉴定玉米自交系样品DNA提取：每个样品随机选取50粒种子，进行发苗，给予充足光照，形成绿苗。DNA提取采取混株提取DNA的方式，每个样品从50个单株中随机选取了30个单株的绿叶并混合，DNA提取具体步骤按照玉米DNA分子鉴定标准执行(王凤格等，2014，玉米品种鉴定技术规程SSR标记法，中华人民共和国农业行业标准)。稀释DNA形成工作液，浓度为20ng/μL。

20个S型不育特异位点的引物设计合成：本发明中提供的多态位点均为二等位基因的SNP和InDel标记，因此可以将20个位点基于KASP技术平台设计引物，合成引物为不含荧光的普通引物。

从实施例1确定的19对引物中，针对每一对引物进行扩增。PCR反应体系为1μL，包括1.5μL总DNA(烘干)，0.5μL KASP ROX standard reaction mix(Kbiosciences,Herts UK)，0.014μL引物混合物，0.5μL去离子水。PCR反应程序为94℃15min；循环10次，采取降落PCR方式，94℃20s，61℃1min，(61℃降落到55℃，每个循环降低0.6℃)；94℃20sec，58℃1min，循环30次。

指纹数据获得：将扩增产物利用BMG Pherastar(LGC，Middlesex，UK)仪器进行荧光信号扫描，获得原始数据。原始数据导入Kraken软件(LGC，Middlesex，UK)进行分析获得每个玉米品种每个数据点的指纹数据，并导入数据管理系统。

结果判定：基于表1中所列出的每个位点在玉米S型不育胞质类型中的等位基因进行判定，如果与表中所述等位基因相同则为S型不育材料，如果为另一个等位基因则不属于S型不育材料。结果显示，实施例1确定的除位点编号为CPMIDP11的分子标记外的其他分子标记设计的引物均具有良好的特异性，能够分别实现对所针对位点的特异性检测，从而完成玉米S型胞质不育自交系的鉴定工作。

除位点编号为CPMIDP11的分子标记外，其他19对引物鉴别玉米自交系或杂交种是否为S型不育的分析结果图见图2。图2中每对引物结果分型图中，每个数据点为每个样品在每对引物中分型结果；数据点在原点附近的为阴性对照样品，其余数据点一部分靠近X轴，一部分靠近Y轴，分别代表了每对引物显示的两种纯合基因型结果；利用软件读取的基因型数据分别与表1中的每对引物的信息进行核对，如果与“玉米S型细胞质雄性不育样本等位基因”一致则为S型不育，另一种类型则为非S型不育。

实施例3利用本发明获得的分子标记鉴定玉米杂交种是否为S型胞质不育制种

鉴定96个不同包装袋或不同来源的京科968是否为S型胞质不育制种生产的杂交种，具体方法如下。

待鉴定玉米杂交种样品DNA提取：每个包装袋随机选取50粒种子，进行发苗，给予充足光照，形成绿苗。DNA提取采取混株提取DNA的方式，每个样品从50个单株中随机选取了30个单株的绿叶，形成96份待检测样品。DNA提取具体步骤按照玉米DNA分子鉴定标准执行(王凤格等，2014，玉米品种鉴定技术规程SSR标记法，中华人民共和国农业行业标准)，稀释DNA形成工作液，浓度为20ng/μL。

引物设计合成，PCR扩增，指纹数据获得方法参见实施例2。

结果判定：基于表1中所列出的每个位点在玉米S型不育胞质类型中的等位基因进行判定，如果某待测样品与表中所述等位基因相同则为S型不育方式生成的杂交种，如果为另一个等位基因则不属于S型不育方式生产的杂交种。

实施例4利用本发明获得的位点鉴定S型不育样品的纯度

鉴定1包玉米S型不育样品种子的纯度，即S型不育种子的含量，具体方法如下。

待鉴定样品DNA提取：从待鉴定样品包装中随机选取120粒种子，进行发苗，给予充足光照，形成绿苗。DNA提取采取单株提取的方式，提取100个单株绿叶的DNA，DNA提取具体步骤按照玉米DNA分子鉴定标准执行(王凤格等，2014，玉米品种鉴定技术规程SSR标记法，中华人民共和国农业行业标准)。稀释DNA形成工作液，浓度为20ng/μL。

20个S型不育特异位点的引物设计合成方法同实施例2。

本实施例以实施例1确定的19个S型不育特异位点随机选取1个或多个位点，设计引物。

PCR扩增：从实施例1确定的19组引物中，每组引物均进行扩增。PCR反应体系为1μL，包括1.5μL总DNA(烘干)，0.5μL KASP ROX standard reaction mix(Kbiosciences,Herts UK)，0.014μL KASP Primer mix混合物混合物，0.5μL去离子水。PCR反应程序为94℃15min；循环10次，采取降落PCR方式，94℃20s，61℃1min，(61℃降落到55℃，每个循环降低0.6℃)；94℃20sec，58℃1min，循环30次。

指纹数据获得：将扩增产物利用BMG Pherastar(LGC，Middlesex，UK)仪器进行荧光信号扫描，获得原始数据。原始数据导入Kraken软件(LGC，Middlesex，UK)进行分析获得每个单株每个数据点的指纹数据，并导入数据管理系统。

结果判定：基于表1中的每个位点在玉米S型不育胞质类型中的等位基因进行判定，如果与表中所述等位基因相同则为S型不育单株，如果为另一个等位基因则不属于S型不育单株。每个位点均进行纯度计算，计算方法为，(S型不育单株数目/检测的总单株数目)×100％。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 利用叶绿体标记鉴别玉米雄性不育S型胞质类型

<130> KHP171117988.3

<160> 98

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 60

<212> DNA